专利名称：放线菌素类化合物放线菌素v在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及放线菌素类化合物放线菌素V，特别是一类源于海洋链霉菌属微生物具有抗肿瘤活性的放线菌素V在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
海洋微生物由于其所处的特殊环境，如高盐度、高压、低营养、低温(特别是深海)或局部高温和无光照以及不同的生物之间的关系等等，发展出了各种独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也为人类提供了在陆地微生物中难以发现的大量新颖代谢产物，其中不少具有潜在的实际应用价值。已被认为是寻找药理活性物质的新源泉。再者，海洋微生物因其易于采集和培养，且人工发酵产生的代谢产物比高等生物所含的物质更易提纯，成本更低，而且符合可持续发展的资源开发原则，所以从中筛选到的活性化合物更利于工业化生产。
自从20世纪40年代应用第一个抗肿瘤药物——氮芥成功地治疗恶性淋巴瘤以来，抗肿瘤药物的研究已取得了很大的发展。我国现代抗肿瘤药物的研制始于20世纪50年代，首先研制的就是放线菌素K，以后又合成了几种烷化剂，如N-甲酰溶肉瘤素、消瘤芥、甲氧芳芥、甘磷酰芥等。60年代以后，从我国土壤中陆续分离提取的更生霉素(新福霉素)、平阳霉素、博安霉素等也进入临床。这里所提及的放线菌素K和更生霉素均属于放线菌素类制剂，其主要成分即为放线菌素D。放线菌素类制剂是由许多结构近似的色多肽类物质所组成。各种放线菌素均有相同的杂环部分发色基团和由不同氨基酸构成的多肽部分。迄今发现的放线菌素至少有50种以上，而主要只有放线菌素D(Actinomycin C1，Dactionmycin或Cosmegen)在发挥临床应用价值。放线菌素D发现于上世纪中期，是从Str.parvullus培养液中提取的一种多肽抗生素；1957年我国上海药物所从广西桂林土壤中分离出的Str.melanochromogenes No.1779培养液中提取的一种抗生素，被定名为更生霉素，实验证明两者理化性质完全相同。已于上个世纪60年代在我国进入临床使用。
放线菌素D属DNA嵌合类抗癌药，抗肿瘤的主要机理是放线菌素D能插入DNA的双螺旋链，通过与模板DNA结合形成复合物，改变DNA的模板性质，抑制DNA和mRNA的合成，进而抑制蛋白质的合成而抑制肿瘤细胞生长。但是药理学研究表明放线菌素D在体内代谢缓慢，在宿主细胞核内容易产生积累，导致其毒性较大，限制了它在临床上的使用。另外放线菌素D对增殖期细胞的毒性与非增值细胞毒性的差别说明其选择性的毒性并未完全由RNA的合成被普遍的抑制而引起的，其更加深入的抗肿瘤活性机理还有待深入研究。故寻找新型放线菌素类制剂或对放线菌素D结构进行改造，以降低其毒性，提高其抗肿瘤活性是开发高效低毒放线菌素类抗肿瘤制剂的目标。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明提供了放线菌素类化合物放线菌素V在制备抗肝癌药物中的应用。
所述抗肝癌的药物组合物中含有放线菌素V，所述放线菌素V具有如下结构
所述放线菌素V的分子量为1268。
本发明的放线菌素类化合物放线菌素V(ActV)来源于海洋红树林内生真菌。发明人由南海海洋链霉菌Streptomyces zhapoensis H41-26的发酵培养物的乙酸乙酯粗提物中分离得到化合物ActV，该菌株由广东省农业科学院植物保护研究所从广东省阳江市西南端海陵岛闸坡的海泥中分离得到。ActV的分子量为1268，纯度为＝96％。尽管ActV曾以少量的形式与ActD一起从陆地放线菌被分离得到，但以ActV为优势产物从海洋放线菌分离出来还是第一次。其结构运用核磁共振(H-NMR，13C-NMR，HSQC，HMBC)、高分辨质谱(ESI-MS)等现代波谱技术进行鉴定，并与现有文献报道的图谱进行对照确认。
优选的，所述抗肝癌的药物为肝癌化疗药物。
该药用可以是药物上可接受的任意一种剂型。包括具有适当组成的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂)等或液体(溶液剂、混悬剂或乳剂)或者口服、局部给药或肠胃外给药，它们可以包含所述纯化合物或者与任何载体或其它药理学活性化合物相结合。当进行肠胃外给药时，需要对这些组合物进行灭菌处理。
本发明化合物或组合物的给药可以通过任何适当的方法进行，如静脉输注、口服制剂、腹膜内和静脉内给药。优选输注时间最多为48小时。包含本发明化合物的药用组合物可以通过以缓释配方中的脂质体或毫微球包囊方式或通过其它标准传递方式进行给药。
所述化合物的正确剂量将根据具体剂型、应用模式和具体部位、患者及所要治疗的肿瘤而变化、还需考虑其它因素如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄速率、患者症状、药物结合、反应敏感性和疾病严重程度，可以在最大允许剂量范围内连续给药或者定期给药。
与现有抗肿瘤药物相比，本发明具有如下有益效果 本发明的放线菌素类化合物来源于海洋真菌，从真菌中提取化合物的方法简单，而优化的培养方法将使大量发酵生产本化合物的成本低廉；本发明通过体外以及体内实验证明新型海洋源性放线菌素ActV具有很强的抗肿瘤活性，可作为治疗肝癌等其他实体肿瘤的先导化合物，可用于制备抗肿瘤药物。本发明的放线菌素类化合物放线菌素V药物组合物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。所述其它药物可以形成该同一组合物的一部分，或者作为单独组合物在相同时间或不同时间进行给药，对其它药物的特性没有特别限制。本发明提供了一种对罹患癌症的任何哺乳动物(特别是人类)进行化合物联合治疗的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明化合物或其药用组合物。
图1是本发明实施例1中MTT比色法检测ActV对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞体外剂量依赖性抑制细胞增殖的生物学活性的一个优选实施例的结果图； 图2是本发明实施例2中对C57BL/6J小鼠皮下接种鼠源性肝癌细胞Hepa1-6体内抗肿瘤活性检测中ActV的两个不同剂量(10μg/kg和50μg/kg)对体内肿瘤生长抑制曲线图； 图3是本发明实施例2中对C57BL/6J小鼠皮下接种鼠源性肝癌细胞Hepa1-6体内抗肿瘤活性检测中小鼠体重随给药时间变化曲线图； 图4是本发明实施例2中对C57BL/6J小鼠皮下接种鼠源性肝癌细胞Hepa1-6体内抗肿瘤活性检测中ActV两个不同剂量(10μg/kg和50μg/kg)及对照组的荷瘤小鼠和剥离后肿瘤的照片。
具体实施例方式 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 ActV抑制人肝癌细胞和鼠肝癌细胞生长的剂量-效应关系 将人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞消化后计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育培养。24小时后更换为含浓度依次为0μM、0.001μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM的ActV的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48小时后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5mg/mL MTT溶液20μl，37℃作用4小时，离心后弃上清液，加入DMSO 150μl，振荡器振荡10min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570nm下的吸光度A值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(％)＝(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100％。对照组即ActV浓度为0μM的培养孔。使用半数抑制浓度(IC50)计算软件Bliss’s software计算IC50，应用SPSS软件进行数据统计分析。
ActV对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性，四甲基二氮唑蓝(MTT)比色法测定ActV对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞作用48小时的IC50见表1，表1是MTT比色法测定ActV对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞作用48小时的IC50，其剂量-效应曲线见图1。
表1
具体来说，采用MTT比色法检测ActV对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和鼠肝癌细胞Hepa1-6生长的影响。建立荷鼠肝癌细胞Hepa1-6的C57BL/6J小鼠同种肿瘤移植模型，随机分为3组，其中一组作为对照，不用ActV处理，另外两组分别以10μg/kg和50μg/kg两种剂量的ActV每2天腹腔注射给药一次，观察并记录ActV的体内抑瘤作用。
实施例2利用同种移植肝癌动物模型检测ActV的体内抗肿瘤活性 采用细胞经皮下接种植入C57BL/6J小鼠颈背部位建立同种移植肝癌动物模型。将鼠源性肝癌细胞Hepa1-6用1×PBS洗涤，用含0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶消化1分钟左右，然后用胰酶抑制剂终止消化。在4℃，1000rpm离心5分钟后，细胞沉淀重悬于1×PBS中并且将浓度调节至2×106细胞/ml。在用于SPF级实验动物饲育的屏障环境动物实验室，将0.1ml肿瘤细胞悬液经皮下注射接种于小鼠颈背部。肿瘤大小用游标刻度卡钳测量，并且体积利用如下公式测算肿瘤体积＝宽度×宽度×长度×0.52。在肿瘤体积为至少100-200mm3(体重的0.5-1％)后(其在5-7天内发生)，将小鼠随机分为2组，分别以10μg/kg和50μg/kg两种剂量ActV每2天腹腔注射给药一次，观察并记录ActV的体内抑瘤作用。当对照组肿瘤最大体积接近2000mm3时终止实验且处死小鼠并尸体剖检。
结果证明，不同剂量的给药组与对照组相比，在实验过程中，肿瘤生长明显受到抑制作用(见图2)，而且两组不同剂量(10μg/kg和50μg/kg)给药组之间肿瘤生长抑制率分别为47.79％和74.65％，体现了剂量依赖性，见表2，表2是ActV体内抑制肿瘤生长抑制率的数据方差分析(按体积计算)。
表2
并且小鼠表征指标之一的体重随给药时间的变化并不明显(见图3)。初步提示在高剂量长期给药情况下，表现出毒性较低、安全性较高的特点。
实验终止时，剥离荷瘤小鼠体内的肿瘤，称重，比较对照组和两组不同给药剂量的实验组之间肿瘤质量，计算肿瘤生长抑制率，10μg/kg组的抑制率为43.44％，50μg/kg组的抑制率为72.22％，见表3，表3ActV体内抑制肿瘤生长抑制率的数据方差分析(按质量计算)，表3结果说明是有统计学意义，并且与比较组间肿瘤体积的结果一致。图4是对C57BL/6J小鼠皮下接种鼠源性肝癌细胞Hepa1-6体内抗肿瘤活性检测中ActV两个不同剂量(10μg/kg和50μg/kg)及对照组的荷瘤小鼠和剥离后肿瘤的照片。
表3
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1、放线菌素类化合物放线菌素V在制备抗肝癌药物中的应用。
2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肝癌药物中含有放线菌素V，所述放线菌素V具有如下结构
3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述放线菌素V的分子量为1268。
4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述放线菌素V是由南海海洋链霉菌Streptomyces zhapoensis H41-26的发酵培养物的乙酸乙酯粗提物中分离纯化得到的。
5、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肝癌药物的剂型包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。
6、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肝癌药物为肝癌化疗药物。
全文摘要
本发明提供了放线菌素类化合物放线菌素V在制备抗肝癌的药物中的应用。其中，放线菌素类化合物放线菌素V(ActV)于南海海洋链霉菌Streptomyces zhapoensis H41-26的发酵培养物的乙酸乙酯粗提物中分离得到，分子量为1268。本发明的放线菌素类化合物从真菌中提取，方法简单，成本低廉；可作为治疗肝癌等其他实体肿瘤的先导化合物，用于制备抗肿瘤药物，特别是作为肝癌化疗药物将具有非常广阔的应用前景。
文档编号A61P1/00GK101601856SQ20091004069
公开日2009年12月16日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者黎孟枫, 洁 袁, 林璧润, 勋 朱, 潘嘉慧, 林永成, 吴珏珩, 隽 李, 何振健, 古明晖 申请人:中山大学