专利名称：Set基因rna干扰重组载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种可以在哺乳动物细胞内表达的 SET基因RNA干扰重组载体及其该载体的表达方法。
背景技术：
癌蛋白SET又称I2PP2A、TAF_Ii3，在细胞中广泛存在，是体内主要的丝-苏氨酸蛋 白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的胞内抑制蛋白，具有特异性、非竞争性和热 稳定性，同时SET也是组蛋白分子伴侣。其在急性未分化型白血病中首次被鉴定，近年来的 研究表明，SET是一个多功能蛋白，涉及细胞凋亡、肿瘤发生、转录调节、核小体装配、组蛋白 结合等方面。Madeira A等报道在Alzheimer，s疾病中SET蛋白参与了神经元凋亡过程，为 此疾病机理提供了新的线索；PP2A活性的缺失或改变与肿瘤发生有一定联系，许多细胞毒 素的促肿瘤作用与抑制PP2A的活性有关，PP2A被认为可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。而 SET蛋白作为PP2A的胞内抑制蛋白，其与肿瘤发生也密切相关，如Wilm’ s肿瘤中SET mRNA 和蛋白表达都显著上升，通过癌蛋白SET的磷酸化可促进前列腺癌细胞生长，肝细胞癌变 中观察到I2PP2A/SET基因表达上调，PP2A活性受抑制；SET蛋白能诱导原癌基因C-Jun的 表达和影响转录因子AP-I的活性，同时也能增强激活蛋白-Kactivator protein-Ι)的转 录活性；SET作为组蛋白分子伴侣，能抑制组蛋白和核小体的乙酰化，从而导致组蛋白依赖 性转录的沉默和DNA去甲基化激活受阻。三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)为不饱和卤代脂肪羟类化学物，是电子、制 革和五金行业常用的有机清洗溶剂，经吸入和皮肤接触后可引起肝脏、肾脏、心脏及皮肤的 损害。近年来，三氯乙烯中毒事件呈上升趋势，死亡事件也时有报道。三氯乙烯中毒主要表 现为药疹样皮炎，但肝脏功能损害情况亦相当严重。刘建军等利用蛋白质组学技术研究三 氯乙烯刺激肝细胞后蛋白质差异表达，结果发现其中的SET差异蛋白在TCE低剂量时表达 上调，并且随着TCE剂量的增加，其表达继续上升。自 1998 年 Fire 等人发现 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)现象以来，RNAi 技 术已被证实是一种特异、高效、经济的抑制基因表达的手段而受到极大的重视和欢迎。2001 年，RNAi技术被成功应用于哺乳动物细胞，其应用前景更加诱人，已经成为疾病研究和治疗 的热点。研究者们可以利用这项技术对目标基因或蛋白质进行特异性表达沉默，通过观察 其表达被抑制的细胞或者生物体的从形态到各项生理生化指标的变化，对该基因或蛋白质 的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此 短短几年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是与疾病相关的一些基因和蛋白。RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)所诱导 的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 外源性或内源性的双链RNA进入细胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依赖性RNA酶III (Dicer， DCR)的作用下被切割成3’端有2个突出碱基的21-23nt长度的小分子干扰RNA(small interference RNA, si RNA)；这些siRNA与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)；而后 RISC 在 siRNA 反义链的指导下与 siRNA 同源靶mRNA相结合，RISC中的重要组成成分Ago-2蛋白在近中点位置将其切割A，随后靶 mRNA被细胞内RNA酶降解，转录后的mRNA就不能翻译出相对应的蛋白，而RISC游离出来， 寻找新的目标分子，从而达到抑制靶基因表达的作用。现有技术中，没有发现在肝细胞内可稳定表达，特异性抑制SET蛋白表达的shRNA 表达载体，而且现有的其它shRNA表达载体往往存在转染效率低，干扰效果不稳定，载体用 量大，而且通常都需要多次瞬时转染等缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种经济、快捷且可以稳定表达的SET基因RNA干扰 重组质粒载体，避免多次瞬时转染造成繁琐流程，能有效地抑制SET蛋白表达，可以用于制 备治疗SET蛋白表达异常相关疾病的药物中和SET基因的功能研究，解决现有技术存在的 缺陷。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种SET基因RNA干扰重组载体，其特征是包括表达载体的基本序列、抗性基 因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可 表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述 可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计；所述表达载体为 psiRNA-hHlneo 系列。优选的是所述的多克隆位点包含Bbs I限制性酶切位点，所述寡核苷酸链包括 Sense+Loop+Antisense，并在两端加上Bbs I限制性酶切位点；所述的Loop为TCAAGAG。更优的是所述的SET mRNA 靶序列为 5' -AACAGCAAGAAGCGATTGAAC-3 ‘ (SQE ID No 1)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述 正义链序列为5 ‘ -TCCCAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCAAGAGGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTT-3 ‘ (SQE ID No 3)；所述反义链序列为5 ‘ -CAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACACTCTTGATGTTCAATCGCTTCTTGCTGT-3 ‘ (SQE ID No 4)。更优的是所述的SET mRNA 靶序列为 5' -AAACGCAGAATAAAGCCAGCA-3 ‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述 正义链序列为5 ‘ -TCCCAAACGCAGAATAAAGCCAGCATCAAGAGTGCTGGCTTTATTCTGCGTTTTT-3 ‘ (SQE ID No 5)；所述反义链序列为5 ‘ -CAAAAAAAACGCAGAATAAAGCCAGCACTCTTGATGCTGGCTTTATTCTGCGTTT-3 ‘ (SQE ID No 6)。本发明的目的之二在于提供一种SET基因RNA干扰重组载体的构建方法，包括步 骤
(A)依据Genbank的SET基因序列，根据shRNA设计原则选取SET mRNA靶序列，并 设计合成可表达的SETshRNA的寡核苷酸链模板序列；(B)将设计合成的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆 位点序列内，构建特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体，其能有效地抑制肝细 胞内SET蛋白的表达，为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。
图1为本发明所述的psiRNA-hHl neo质粒图谱；图2为本发明实施例shRNA重组质粒酶切鉴定电泳示意图；图3为本发明实施例shRNA重组质粒测序结果(部分)示意图；图4本发明实施例RNA干扰后L-02肝细胞中SET蛋白的表达Western blotting 检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1靶向人SET的短发夹环RNA(shRNA)寡核苷酸链的设计与合成针对人SET mRNA序列(Genbank Accession NM_001122821)，根据 shRNA设计原则 及www, simawizard. com上的在线设计软件选择两条21nt靶序列，经BLAST同源性比对分 析，两条靶序列与人类其他基因编码序列无同源性，分别起始于SET基因第119、553位点。 寡核苷酸链由Sense+Loop (TCAAGAG) +Antisense组成，并在两端加上Bbs I酶切位点，分别 命名为siRNAl、siRNA2，另外设计对照序列siRNA c，不针对人任何基因，具体序列如表1。 寡核苷酸链由上海生工公司合成。表1靶向SET基因shRNA寡核苷酸链序列Table 1 the sequences of shRNA oligonucleotides targeting SET gene
权利要求
一种SET基因RNA干扰重组载体，其特征是包括表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计；所述表达载体为psiRNA hH1 neo。
2.如权利要求1所述的SET基因RNA干扰重组载体，其特征是所述的多克隆位点包 Bbs I限制性酶切位点，所述寡核苷酸链包括Sense+Loop+Antisense，并在两端加上Bbs I 限制性酶切位点；所述的Loop为TCAAGAG。
3.如权利要求2所述的SET基因RNA干扰重组载体，其特征是所述的SETmRNA靶序 列为5' -AACAGCAAGAAGCGATTGAAC-3‘ (SQE ID No 1)；所述的寡核苷酸链模板序列包括 寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5' -TCCCAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCAAGAGGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTT-3' (SQE ID No3)；所述反义链序列为5' -CAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACACTCTTGATGTTCAATCGCTTCTTGCTGT-3' (SQE ID No4)。
4.如权利要求2所述的SET基因RNA干扰重组载体，其特征是所述的SETmRNA靶序 列为5' -AAACGCAGAATAAAGCCAGCA-3‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸链模板序列包括 寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5' -TCCCAAACGCAGAATAAAGCCAGCATCAAGAGTGCTGGCTTTATTCTGCGTTTTT-3' (SQE ID No5)；所述反义链序列为5' -CAAAAAAAACGCAGAATAAAGCCAGCACTCTTGATGCTGGCTTTATTCTGCGTTT-3' (SQE ID No6)。
5.一种构建权利要求1-4任一项所述SET基因RNA干扰重组载体的方法，包括步骤(A)依据Genbank的SET基因序列，根据shRNA设计原则选取SETmRNA靶序列，并设计 合成可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列；(B)将设计合成的SETshRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点 序列内，构建特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体。
6.权利要求1-4任一项所述的SET基因RNA干扰重组载体在制备治疗SET蛋白表达异 常相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种SET基因RNA干扰重组载体及其构建方法和应用，所述SET基因RNA干扰重组载体包括表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计；所述表达载体为psiRNA-hH1 neo系列。本发明成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体，其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达，为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。
文档编号A61P35/00GK101948858SQ20101025567
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘建军, 周丽, 席仁荣, 彭朝琼, 邢秀梅, 黄海燕 申请人:深圳市疾病预防控制中心