专利名称：新的潜在抑癌基因cmtm7及其编码蛋白的新应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白的新应用，具体地说，本发明涉及CMTM7作为一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白的应用。
背景技术：
CMTM (CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing family),原名 CKLFSF(chemokine-1ike factor super family)基因家族包括9 个成员，即 CKLF(Chemokine-1ikefactor，趋化素样因子)和 CMTM1-8(CKLF-like MARVELtransmembrane domain-containingmember 1-8)(原名 CKLFSF1-8)。该家方矣是本发明人在国际上首次报道的一个新基因家族并申请了专利(中国专利申请号02122 . 5)。其编码产物的结构和功能特点介于经典的趋化因子(Chemokine)和四次跨膜蛋白家族(Transmembrane 4 Super Family,TM4SF)之间，在免疫、男性生殖等系统发挥重要作用，并参与肿瘤的发生和发展。在CMTM家族成员中，人类CMTM7基因定位于第3号染色体3p22. 3，有2个可变剪切体CMTM7-vl和CMTM7-V2，其中CMTM7_vl是主要表达形式。CMTM7进化保守，在人体正常组织中广泛表达，尤其在免疫细胞中表达水平较高。目前，CMTM7的具体功能尚不清楚。
发明内容
本发明的一个目的在于研究CMTM7在肿瘤中的表达特点，研究CMTM7的新功能，提供CMTM7的新应用。CMTM7有2个可变剪切体CMTM7_vl和CMTM7_v2，其中CMTM7_vl是主要表达形式。在本发明中，所述CMTM7的核酸和蛋白质包括CMTM7-V1、CMTM7-V2两种形式。所述的CMTM7-vl 和 CMTM7-V2 在 GenBank 的登记号分别为 NM 138410 和 NM 181472。所述 CMTM7蛋白为CMTM7基因所编码的蛋白。CMTM7定位于3p22. 3，该区域在多种肿瘤中存在缺失 ’另外，CMTM7具有一个典型的CpG岛。本发明研究了 CMTM7在人多种正常组织以及在肿瘤组织中的表达特点，发现CMTM7在食管癌、乳腺癌、宫颈癌等部分肿瘤来源的细胞系中表达下调或缺失，在大部分表达下调或缺失的细胞系中其启动子区CpG岛存在甲基化修饰，而去甲基化药物5-氮-2-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)或联合曲古抑菌素AUrichostatin Α)可恢复CMTM7的表达，证明其表达沉默与CpG岛的甲基化密切相关。更为重要的是，CMTM7在原发食管癌组织中也有较高频率的甲基化。本发明的实验研究发现，在食管癌、乳腺癌、宫颈癌等来源的部分细胞系中，CMTM7表达下调或缺失，但其启动子区没有甲基化修饰，这提示除了启动子甲基化，其他因素也可能导致CMTM7表达下调或缺失。在原发食管癌组织中，分析发现在CMTM7所在染色体位点存在较高频率的杂合性缺失。本发明还进一步进行免疫组化实验，初步结果提示CMTM7在食管癌、胃癌、肝癌和
3胰腺癌组织中表达下调。本发明还通过实验证实在CMTM7表达下调或缺失的食管癌细胞系(KYSE410，KYSE180)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)或宫颈癌细胞系(HeLa)中恢复CMTM7的表达，可抑制细胞增殖和细胞迁移。另外，在食管癌细胞系中恢复CMTM7的表达，可诱导细胞发生Gl期阻滞。因此，CMTM7可能是一个新的潜在抑癌基因，可能作为癌症的临床诊断和/或预后判断的辅助指标，另外CMTM7腺病毒或蛋白在治疗和/或抑制肿瘤中具有重要应用价值。根据本发明的实验研究发现，本发明提供了 CMTM7基因或其编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。具体的，所述癌症为食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌或胰腺癌。本发明还提供了 CMTM7基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或细胞迁移中的应用。本发明通过实验证实，CMTM7基因或其编码的蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖，并能抑制细胞迁移。具体的，所述肿瘤细胞为食管癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞。在本发明的一具体实施方案中，所述细胞迁移为EGF诱导的细胞迁移。本发明还提供了 CMTM7基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的成瘤性中的应用。根据本发明的具体实施方案，本发明所述的CMTM7在具体应用时，可以是包含于载体中。所述载体可以为真核表达载体、原核表达或病毒，优选为腺病毒。例如，在本发明的一具体实施方案中，是通过腺病毒Ad-CMTM7明显抑制裸鼠体内KYSE180细胞的肿瘤形成。本发明还提供了检测CMTM7基因或其编码的蛋白的试剂在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后指标和预警提示的组合物中的应用；优选所述的试剂为抗体、反义RNA或小干扰RNA。
图IA显示CMTM7在人多种正常组织中的表达谱分析。图IB显示CMTM7在某些肿瘤来源的细胞系中表达下调，并且大多伴随甲基化修饰。图2显示去甲基化药物可恢复食管癌来源细胞系中CMTM7的表达。图3显示CMTM7在食管配对组织的肿瘤组织中存在较高频率的甲基化，BGS测序结果显示具体的甲基化位点。图4显示STR分析CMTM7所在染色体位点3p22. 3有较高频率的L0H。图5显示在配对食管组织中CMTM7在大部分肿瘤组织中表达下调。图6A显示在CMTM7表达缺失的肿瘤细胞系中，利用腺病毒载体可以恢复CMTM7的表达。图6B显示CCK8实验结果。图6C显示迁移和划痕实验结果。图6D显示流式细胞仪检测结果。图6A 图6D可表明CMTM7具有抑癌功能，CMTM7能抑制食管癌或乳腺癌来源肿瘤细胞的增殖和EGF诱导的迁移，并且能诱导食管癌来源肿瘤细胞发生Gl期阻滞。图7显示CMTM7能明显抑制裸鼠体内KYSE180细胞的肿瘤形成能力。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory (CSHL) Press, 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，主要试剂和材料人多组织RNA购自Clontech公司和Mratagene公司；引物合成及测序委托北京奥科生物技术有限公司和北京擎科生物技术有限公司完成；FITC-conjugated annexin V和碘化丙啶(propidium iodide)购自宝赛公司；LATaq购自TAKARA公司；trichostatin A和 5-aza-2，-deoxycytidine 购自 Sigma 公司；Cell Counting Kit_8 (CCK-8)购自 Do jindo公司；Quick-gDNA Miniprep 试剂盒(D3024)和 EZ-Golden-Methylation 试剂盒(D5005)购自ZYMO Research公司。真核细胞表达质粒pcDNA3. l/Myc_HisB (-)-CMTM7为北京大学人类疾病基因研究中心按照常规方法构建；腺病毒Ad-CMTM7是委托本元正阳公司根据真核细胞表达质粒pcDNA3. 1/Myc-HisB (-) -CMTM7构建，对照空载体病毒Ad-null (Mock)乃委托本元正阳公司重组、包装、纯化获得，TCID5tl亦由该公司测定；组织芯片购自陕西超英生物科技有限公司和上海芯超生物科技有限公司。人乳腺癌来源细胞系MDA-MB-231和宫颈癌细胞系HeLa购自ATCC。人食管癌来源细胞系KYSE410，KYSE180和KYSE150细胞购自JCRB，Japan。以上细胞系均使用10% FBS/RPMI 1640(4. 5g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)培养。31例人原发食管癌和癌旁配对组织由北京大学人民医院提供。实施例1、CMTM7在人多种正常组织中的表达谱分析1、细胞或组织的DNA及RNA提取按照TRIZ0LTM(InVitrOgen)试剂的说明书，分别提取细胞或组织总RNA，并将其用紫外分光光度计定量。取ι μ g总RNA，利用Therm0SCRIPTTMII cDNA第一链合成试剂盒(Invitrogen)合成第一链 cDNA。按照 Quick-gDNA Miniprep 试剂盒(Zymo Research)的说明书，提取细胞或组织的基因组DNA，并将其用紫外分光光度计定量。取1 μ g基因组DNA，利用EZ-Golden-Methylation试剂盒(Zymo Research)对其进行重亚硫酸盐处理，最终溶于10 μ 1的洗脱液中。2、RT-PCR 反应体系取1 μ 1上述cDNA产物作模板进行PCR扩增。反应中所用引物序列如表1所示，反应条件如表2所列，GAPDH作为系统内参。表1 PCR反应所用引物序列
权利要求
1.CMTM7基因或其编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述癌症为食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌或胰腺癌。
3.CMTM7基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或细胞迁移中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述肿瘤细胞为食管癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞。
5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述细胞迁移为EGF诱导的细胞迁移。
6.CMTM7基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的成瘤性中的应用。
7.根据权利要求1或3或6所述的应用，其中，所述的CMTM7包含于载体中。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述载体为真核表达载体、原核表达或病毒，优选为腺病毒。
9.检测CMTM7基因或其编码的蛋白的试剂在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后指标和预警提示的组合物中的应用；优选所述的试剂为抗体、反义RNA或小干扰RNA。
全文摘要
本发明提供了CMTM7基因及其编码蛋白的新应用，具体涉及CMTM7基因或其编码的蛋白在制备治疗癌症特别是食管癌、乳腺癌或宫颈癌的药物中的应用，以及CMTM7基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或细胞迁移中的应用，在抑制肿瘤细胞的成瘤性中的应用。本发明研究发现CMTM7是一个新的潜在抑癌基因，特别是在食管癌的发生、发展过程中具有重要作用。
文档编号A61K38/19GK102580114SQ201110003808
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者刘凯, 张颖妹, 李荷楠, 苏玉, 莫小宁, 郭晓欢, 韩文玲, 马大龙 申请人:北京大学