专利名称：一种植物提取物的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物技术领域，具体为一种植物提取物的制备方法和用途。
背景技术：
植物多酚类化合物是一类广泛存在于天然植物、水果蔬菜等中的次生代谢产物， 是一类天然的强还原性物质，在抗氧化和自由基清除方面具有比常用抗氧化剂更强的作用，植物酚酸类还具有多方面的生物活性，尤其在预防心脑血管、癌症以及抗衰老方面发挥着十分重要的作用。近年来，三萜皂苷类成分的生物活性的多样性和重要性方面备受人们重视，成为中药化学研究的一个热点领域，大量的实验研究表明，三萜及其皂苷类成分具有抗癌、抗菌、抗病毒，降低胆固醇、免疫调节等活性，是具有开发应用前景的一大类化合物。少花斑鸠菊为菊科斑鸠菊属植物iVernoniei chun ii Chang in Sunyatsenia )， 该属植物全世界约35种，我国有30种，主要分布于南部及东南部。该属植物药用价值较高， 民间用于治疗感冒咳嗽、风湿痹痛、活血止血和咽喉炎等。我们曾对少花斑鸠菊进行过系统化学成分研究，从中分离鉴定出大量三萜酸类、咖啡酰基奎宁酸类等单体化合物，并通过实验证明具有很好的生物活性，由此显示出了很好的开发应用价值。但经文献检索，还未见有对少花斑鸠菊总酚酸及总皂苷进行提取纯化，获得含有大量总酚酸、总皂苷及微量元素及氨基酸等多种活性成分的少花斑鸠菊提取物的研究报道。
近年来从中草药中提取酚酸类及皂苷类等较大极性成分的方法多采用一定比例的含水甲醇或含水丙酮进行超声提取、回流提取及冷浸提取来实现，这些提取方法往往具有溶剂用量较大、提取时间较长、操作工序麻烦、工作效率较低等缺点。而分离富集总酚酸及总皂苷类成分多采用提取液浓缩后用正丁醇反复萃取、再结合大孔树脂柱色谱富集纯化。以上操作存在操作步骤及洗脱步骤多，有机溶剂用量大，有效部位的收率较低，生产成本较高等缺点，尤其制备过程中需要对提取液、萃取液或洗脱液进行浓缩，由于加热浓缩环节较多，容易造成有效成分破坏或流失，致使所得提取物的提取率及有效成分的转移率不高，且常要用到高沸点的正丁醇及甲醇等有害溶剂，对环境造成污染，同时提取物中常存在重金属含量超标现象。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种植物提取物的制备方法和用途的技术方案，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)原料处理将干燥的少花斑鸠菊粉碎成粗粉，过40 60目筛；
2)提取将药材装入渗漉筒中，用30% 70%的含水乙醇浸泡3 6小时后，用30% 70%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为10 16升，按流速为10 20 mL · HiirT1的速度收集渗漉液；
3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度50°C 80°C，真空度为0. 090 Mpa 0. 095 Mpa, 待浓缩液进液流速为150 350 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到含 2mL浓缩液/每g药材粗粉；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为10 25 mL .mirT1, 分别收集3 4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30% 70%含水乙醇各部位的洗脱液，
5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在50°C 80°C，真空度为0.090Mpa 0. 095 Mpa，待浓缩液进液流速为150 350 mL · mirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60 100目分样筛，即得少花斑鸠菊提取物干粉。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2)中浸泡时间为4 5小时，含水乙醇的浓度为40% 60%，流速为15 18 mL · mirT1。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3)中水浴温度为60°C 70°C，真空度为0. 093 Mpa，进液流速为200 300mL · mirT1。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇、 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为15 20 mL · mirT1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、65%含水乙醇、 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液。所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5)中减压浓缩温度为 60°C 70°C，真空度为0. 093 Mpa，进液流速为200 300 mL · mirT1。所述的一种植物提取物在制备防治肿瘤制剂中的应用。所述的大孔吸附树脂为Dianon HP-20大孔吸附树脂。上述一种植物提取物的制备方法，具有以下有益效果
1)本发明对少花斑鸠菊采用含水乙醇进行渗漉法提取、真空薄膜闪蒸浓缩，结合大孔树脂吸附来分离富集多酚类及皂苷类活性成分。得到了含有大量总酚酸及总皂苷等活性成分的少花斑鸠菊提取物。该提取方法具有溶剂用量较少、提取效率高，不加热，有利于热敏性成分不受破坏的特点，采用的浓缩技术具有浓缩液受热时间极短、浓缩速度快、效率高， 操作简单、使用方便、节能环保等优点。2)采用该方法能最大限度地将功效成分提取富集完全，得到了含有总酚酸及总皂苷等活性成分的少花斑鸠菊提取物。经测定该提取物干粉的收率达到15. 4% 26. 5%。 经含量测定，提取物中总酚酸的含量达到18.6 % 31.8%，总皂苷的含量达到8.8% 16. 9 %，绿原酸的含量达到3. 4% 10. 5%。除此之外，还含有对人体有益的微量元素及氨基酸。
3)本发明提供的少花斑鸠菊提取物制备工艺简单、操作方便、溶剂用量小，无环境污染，生产成本较低，其提取物收率及功效成分的含量高。4)通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定少花斑鸠菊提取物中重金属的含量，发现采用该方法制备的少花斑鸠菊提取物中重金属含量很低，符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。5)经初步的体外抗氧化及抗肿瘤活性试验表明，少花斑鸠菊提取物具有一定的抗氧化及抗肿瘤作用，可用作食品抗氧剂及食品添加剂，也可用作药物原料，因此具有很好的应用前景。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的
百分含量为重量比。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1
1)原料处理将干燥的少花斑鸠菊粉碎成粗粉，过40目筛；
2)提取将药材装入渗漉筒中，用70%的含水乙醇浸泡4小时后，用70%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，按照材重量为Ikg则含水乙醇的用量为12升，按流速为15 mL · HiirT1 的速度收集渗漉液；
3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度70°C，真空度为0. 095 Mpa,待浓缩液进液流速为 250 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到含2mL浓缩液/每g药材粗粉；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过DianonHP-20大孔吸附树脂分离富集，先用H2O 洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、 60%含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为20 mL · mirT1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、 50%含水乙醇、60%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液，
5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在70°C，真空度为0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为沈0 mL · mirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过100目分样筛，即得少花斑鸠菊提取物干粉。在本发明所述的工艺方法中
步骤1)中将少花斑鸠菊粗粉过60目筛；
步骤2)中浸泡时间为3小时、5小时或6小时，含水乙醇浓度为30%、40%、50%或 60%，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为10升、13升、15升或16升，流速为10 mL · mirT1、12 mL · mirT1、18 mL · mirT1 或 20 mL · mirT1 ；
步骤3)中水浴温度50°C、55°C、60°C、65°C、75°C或80°C，真空度为0. 090 Mpa，进液流速为 150 mL · min_\l80 mL · min"\200 mL · min"\300 mL · mirT1 或 350 mL · mirT1 ；得至Ij 含2mL浓缩液/每g药材粗粉；
步骤4)中先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、15%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70% 丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液；洗脱流速为10 mL · πι η^, δ mL · min_1> 18 mL · min_1>22 mL · mirf1 或 25 mL · mirf1 ；
步骤5)中减压浓缩温度为501、601、801，真空度为0.093 Mpa，进液流速为150 mL · min_1>200 mL · mirf1、250 mL · mirf1、300 mL · mirf1 或 350 mL · mirf1 ； 其它同实施例1，也能取得本发明所述的有益效果。以下通过相应的试验对通过本发明制备的提取物进行总酚酸、总皂苷、绿原酸、微量元素及重金属、氨基酸的含量测定。1)总酚酸的含量测定
测定条件UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；没食子酸对照品(110831-200302，中国药品生物制品检定所提供)，没食子酸的最大吸收波长765 nm。标准曲线的绘制准确称取干燥恒重的没食子酸对照品12. 36 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中，制成浓度为0. 1236 mg · mL—1的对照品溶液。分别吸取对照品溶液 0,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0 mL(相当于含没食子酸分别为 0,0. 1236,0. 2470,0. 370、 0. 494,0.6180,0. 741 mg)置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容至10 mL，放置暗处2 h，于765 nm 处测定吸光度，试剂为空白参比。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得没食子酸的回归方程Y=O. 032X+0. 1234， R2=O. 9984。样品的含量测定精密称定干燥的少花斑鸠菊提取物干粉(实施例1)适量，用蒸馏水溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容至10 mL，静置20 min后于765 nm处测定吸光值。重复3次测定，根据回归方程换算出样品中总酚酸的含量，计算出少花斑鸠菊提取物中总酚酸的平均含量为18.6 % 31.8%。2)总皂苷的含量测定
测定条件UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司);人参皂苷Re 对照品(110754-200822，中国药品生物制品检定所提供)，人参皂苷Re的最大吸收波长 560 nm。标准曲线的绘制精密吸取60°C减压干燥至恒重人参皂苷Re对照品10. 36 mg，置 10 ml容量瓶中，加适量甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇勻，即得浓度为1.036 mg · mL—1的对照品溶液。精密吸取对照品溶液40、80、120、160、200 μ L分别加入5支干燥具塞试管中， 置水浴上挥干溶剂。精密加入新配制的5%香草酸一冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于 60 ！恒温水浴中加热15 min，取出，流水冷却2 min。加冰醋酸5 mL，摇勻。甲醇溶液随行空白对照。按照分光光度法试验，在560 nm处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，人参皂苷 Re的质量浓度X为横坐标绘制标准曲线，得人参皂苷Re的线性方程7 =23. 456J-1. 348 r = 0.9993。表明人参皂苷Re进样量在41 207 Ug范围内线性关系良好。供试品溶液的制备精密称取干燥的少花斑鸠菊提取物干粉(实施例1)适量，用甲醇溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液置水浴上蒸发甲醇，残渣用 5 mL水溶解，用石油醚萃取2次，每次20 mL，合并石油醚层。用少量水洗石油醚层，水层及洗液合并，在水浴上蒸至近2 mL，转移到已处理好的Diaion HP-20大孔吸附树脂柱上，加水15 mL洗脱多糖等杂质。弃去洗脱液，再用70 %乙醇20 mL洗脱总皂苷，洗脱液置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，滤过，弃去初滤液，精密吸取滤液1 mL置具塞试管中，在水浴上蒸去甲醇即得。样品的含量测定依上法制备的供试品溶液，加入新配制的5%香草醛一冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60 °〇恒温水浴中加热15 min，取出，流水冷却2 min。 加冰醋酸5 mL，摇勻。同标准曲线项下操作。根据回归方程换算出样品中人参总皂苷的含量，计算公式X=AX 100+ (MXV/2X 1/5)。式中，X为样品中参总皂苷的含量(以Re计) (g/100g), A为从标准曲线上读得被测样品液中参总皂苷的含量(μ g)，V为被测样品溶液的体积(ml)，M为样品的取样量。由公式计算求得少花斑鸠菊提取物中人参总皂苷的含量为 8. 8% 16. 9%。3)微量元素及重金属的含量测定
仪器与测定条件采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定少花斑鸠菊提取物中微量元素及重金属元素的含量。X^eries型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)； MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)，附RTP-300 Plus温控；MiIli-Q Academic超纯水处理器(美国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表1。表1 ICP-MS工测定条件及工作参数
权利要求
1.一种植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)原料处理将干燥的少花斑鸠菊粉碎成粗粉，过40 60目筛；2)提取将药材装入渗漉筒中，用30% 70%的含水乙醇浸泡3 6小时后，用30% 70%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为10 16升， 按流速为10 20 mL · HiirT1的速度收集渗漉液；3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度50°C 80°C，真空度为0. 090 Mpa 0. 095 Mpa, 待浓缩液进液流速为150 350 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到含 2mL浓缩液/每g药材粗粉；4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为10 25 mL .mirT1, 分别收集3 4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30% 70%含水乙醇各部位的洗脱液，5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在50°C 80°C，真空度为0.090Mpa 0. 095 Mpa，待浓缩液进液流速为150 350 mL · mirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60 100目分样筛，即得少花斑鸠菊提取物干粉。
2.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2)中浸泡时间为4 5小时，含水乙醇的浓度为40% 60%，流速为15 18 mL · mirT1。
3.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3)中水浴温度为60°C 70°C，真空度为0. 093 Mpa，进液流速为200 300mL · mirT1。
4.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用 H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为15 20 mL · mirT1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液。
5.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O 洗脱，再依次用10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、 65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液。
6.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5)中减压浓缩温度为60°C 70°C，真空度为0. 093 Mpa，进液流速为200 300 mL · mirT1。
7.如权利要求1所述的一种植物提取物在制备防治肿瘤制剂中的应用。
全文摘要
一种植物提取物的制备方法和用途，属于植物技术领域。包括以下步骤将少花斑鸠菊原料经粉碎过筛后，采用渗漉提取、真空薄膜浓缩、大孔树脂吸附富集等方法制得少花斑鸠菊提取物。所得的少花斑鸠菊提取物中含有18.6％～31.8％的总酚酸，8.8％～16.9％的总皂苷，3.4％～10.5％的绿原酸以及有益微量元素和必需氨基酸，同时所含的重金属均不超标。该提取物具有很强的抗氧化作用，同时还具有一定的抗肿瘤作用，可用作食品抗氧剂、食品添加剂及药物原料等，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低。
文档编号A61P35/00GK102151293SQ20111008014
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者姜东青, 徐殿宏, 袁珂, 黄雅思 申请人:浙江农林大学