专利名称：重组腺病毒tmem166作为基因治疗药物在抗肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒TMEM166作为基因治疗药物在抗肿瘤中的应用，特别涉及含有该重组腺病毒TMEM166的诱导肿瘤细胞自噬和凋亡，抑制肿瘤细胞生长的基因治疗药物，并且本发明还涉及该重组腺病毒TMEM166与化疗药物联合给药来制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
生物体的一切生命活动，从出生、成长、衰老、到出现疾病直至死亡都与基因有夫，基因调控着细胞的各种功能。人们现在已经认识到肿瘤是基因异常的疾病，而恶性肿瘤发病率、死亡率较高，已经成为危害人类生命的第一、二位杀手。近年来，关于肿瘤治疗，基因治疗尤为引人注目，到目前为止提出了各种各样的基因治疗法，并进行了临床试验(例如 參见 Freeman SM, Whartenby KA, Freeman JL, Abboud CN, Marrogi AJ. In situ use ofsuicide genes for cancer therapy. Semin Oncol. 1996Feb ；23(1) :31-45.)。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技木。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流一是非病毒载体系统；ニ是病毒载体系统。由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20% ;病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70%的治疗方案采用了病毒载体，包括各种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒等。其中腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点(例如參见Deng Hong-Xin, Tian Ling, WeiYu—Quan.しurrent status,problems and prospects in gene therapy. Chinese Bulletinof Life Sciences. 2005 ; 17 (3) 196-200 ；Kovesdi I, Brough D. E, Bruder J.T. andWickham T. J. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin Biotechnol,1997,8:583-589.)。广为人知的重组人p53腺病毒自1995年在美国批准进入临床试验，目前已有51项各种临床试验方案在世界各国实施，涉及到如肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、脑瘤等多种类型的肿瘤治疗(例如參见Nie B, Shen Z, Wen J. B, Wong 0. G, Hsueh ff. D, HuoL.F, Kung H. F, Jiang B and Lin M. C. 2008. AAV-HGFK1 and Ad_p53 cocktail therapyprolongs survival of mice with colon cancer. Mol Cancer Ther 7 :2855-2865. ；Yoo,G. Η. , M. P. Piechocki, J. Oliver, F. Lonardo, L. Zumstein, H. S. Lin, H. Kim, T. Y. Shibuya,N. bhehadeh,and j. F. Ensley. Enhancement of Ad_p53 therapy with docetaxel in headand neck cancer. Laryngoscope,2004,114 1871-1879. ；Swisher, S. G. , and J. A. Roth.Clinical update of Ad_p53 gene therapy for lung cancer. Surg Oncol Clin N Am,2002，11 :521-535.)。
程序性细胞死亡(programmed Cell Death, PO))是细胞的一种主动死亡过程，基于形态可以将P⑶分为两型，I型P⑶又称凋亡性细胞死亡，II型P⑶又称自噬性细胞死亡、例如參见 Levine B and Daniel Klionsky J. Development by self-digestion:molecular mechanisms and Diological functions of autophagy.Dev cell,2004,6(4)463-477 ；Xiang J, Chao DT, Korsmeyer SJ.BAX-induced cell death may not requireinterleukin I β -converting enzyme-like proteases. Proc Natl Acad Sci,1996,93 :14559-14563)自噬性细胞死亡与凋亡在生化指标、參与分子和机理方面均有密不可分的关系，在某些情况下可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞(例如參见 Cuervo AM. Autophagy in sickness ana in health. Trends Cell Biol, 2004,14(2) :70-77 ；bhmtani T. Autophagy in health and disease a double-edged sword.Science, 2004，306 (5698) :990-995)。对自噬研究的不断深入，不仅进ー步掲示了真核生物自身调控的复杂性和多祥性，更为肿瘤的治疗提供了新的思路。大量研究表明，在多种人类肿瘤中存在有自噬活性的降低，其与肿瘤的发生、发展有密切的关系(例如參见Bertin b, Pierrefite-uarle Autopnagy and toll-like receptors a new link in cancercells. Autophagy. 2008 Nov 16 ；4(8) :1086-1089)。目前人们已经将干预肿瘤细胞自卩遼作为为抗肿瘤药物开发和检测肿瘤药物疗效的新靶点。本发明人利用突光素酶报告基因方法(例如參见Lorenz ffff,Longiaru M,CormierMJ. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ;88 (10) :4438-42.)筛选出一个能够明显下调内參活性并且同时诱导细胞死亡的新基因TMEM166。通过TMEM166的表达，可以达到抑制肿瘤细胞生长的目的，同时为研制治疗癌症的重组腺病毒基因治疗药物奠定了基础。TMEM166是ー种定位于溶酶体和内质网的新型跨膜蛋白(例如參见Wang L.，Yu C，Lu Y, He P, Guo J, Zhang C，Song Q, Ma D, Shi T and Chen Y. TMEM 166，a noveltransmembrane protein, regulates cell autophagy and apoptosis. Apoptosis, 200(,12 :1489-1502.)。过表达TMEM166，可以明显抑制Hela细胞的克隆形成，诱导细胞发生程序性细胞死亡，形态学的改变具有细胞自噬和凋亡的双重特征，且自噬的发生早于凋亡的出现。提示TMEM166可能具有调节凋亡和自噬的双重作用。在前期研究的基础上，我们也构建了腺病毒TMEM166，希望利用腺病毒载体的优越性进ー步探讨TMEM166的抗肿瘤活性，为其真正作为肿瘤基因治疗试剂奠定基础(例如參JAL Roth, J. A. 2006. Adenovirus p53 gene therapy. Expert Opin Biol Ther 6:55-61·)。前期结果显示，利用制备的兔抗人TMEM166特异性抗体，结合组织芯片、免疫组化的方法，以及实时定量PCR分析了人体正常组织和肿瘤组织中TMEM166的表达情况，证明肿瘤细胞中TMEM166的表达明显下调，在正常组织中高表达，提示TMEM166可能是潜在的肿瘤基因治疗靶点(例如參见 He P，Peng Z，Luo Y，Wang L，Yu P，Deng ff, An Y，Shi Tand Ma D. High—throughput functional screening for autophagy—reiated genes andidentification of TM9SF1 as an autophagosome-inducing gene. Autophagy,2009,5 52-60.)。构建了 TMEM166腺病毒重组表达载体(人重组Ad5_TMEM166)。本发明利用腺病毒重组表达载体人重组Ad5-TMEM166进行体内外实验，以期阐明TMEM166的抗肿瘤活性。体外的研究证明TMEM166抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞自噬和凋亡；裸鼠移植瘤实验证实了人重组Ad5-TMEM166感染对于食管癌细胞移植瘤的生长抑制作用，在TMEM166感染的肿瘤组织中，出现大量的细胞凋亡、外围血管密度降低、组织缺血坏死等，表明腺病毒介导的TMEM166转基因具有很强的抗肿瘤活性，具有潜在的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供ー种含有人TMEM166基因的重组腺病毒。本发明所提供的重组腺病毒，是将人TMEM166基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人TMEM166基因的表达盒包括启动子、人TMEM166的cDNA和终止子。所述人TMEM166基因的表达盒中，启动子为CMV启动子，所述终止子为SV40的终 止子。所述人TMEM166基因的表达盒还包括SV40polyA信号序列。所述人TMEM166基因的表达盒通过如下方法插入Ad5的基因组DNA中利用pAdxsi系统(microbix公司，购自本元正阳基因技术股份有限公司)将人TMEM166的cDNA插入pShuttle-CMV的多克隆位点区，然后将重组后pShuttle-CMV-TMEM166中的TMEM166表达盒经酶切后连接到pAdxsi载体上，最后将重组后Ad5-TMEM166转染进293细胞，得到含有TMEM166基因的重组腺病毒。本发明的另ー个目的是提供一种诱导肿瘤细胞自噬和凋亡、抑制肿瘤细胞生长的基因治疗药物。该基因治疗药物可用于非实体瘤细胞或实体瘤细胞。本发明还进ー步提供了该基因治疗药物在制备与化疗药物联合给药来诱导肿瘤细胞死亡的药物中的应用。该化疗药物可以是任何ー种化疗药物，优选3-MA和LY294002。实验表明本发明的重组腺病毒在体内外均有抗肿瘤活性。本发明的重组腺病毒可广泛用于肿瘤的基因治疗。
图IA为pShuttle_TMEM166的BamHI和EcoR I双酶切鉴定电泳IB为人重组Ad5_TMEM166的鉴定图谱图 2A Western Blot 检测人重组 Ad5_TMEM166 在 MGC803、SGC7901、AGS、U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞中的表达，呈浓度依赖性图 2B Western Blot 检测人重组 Ad5-TMEMl66 在 U20S、Saos-2, BGC823, KYSE150肿瘤细胞中的表达，呈时间依赖性图3A CCK8 实验检测人重组 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 肿瘤细胞存活率，呈时间依赖性图3B CCK8 实验检测人重组 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 肿
瘤细胞存活率，呈浓度依赖性图4 人重组 Ad5-TMEM166 诱导 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 肿瘤细胞发生自噬。A :共聚焦显微镜观察GFP-LC3的斑点状定位；B :统计学分析人重组Ad5_TMEM166诱导肿瘤细胞发生自噬时GFP-LC3斑点细胞的数目；C =Western Blot检测人重组Ad5_TMEM166诱导肿瘤细胞发生自噬时GFP-LC3-I蛋白的变化图5Western Blot检测人重组Ad5_TMEM166诱导U20S、Saos_2肿瘤细胞发生自噬时P62蛋白的变化图 6Western Blot 检测人重组 Ad5_TMEM166 诱导 U20S、Saos-2, BGC823、KYSE150肿瘤细胞发生自噬时mT0R/p70S6K信号通路的变化图7A 流式细胞术分析人重组 Ad5-TMEM166 诱导 U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150 肿瘤细胞凋亡，呈浓度依赖性图7B流式细胞术分析人重组Ad5_TMEM166诱导U20S肿瘤细胞凋亡，呈时间依赖性 图8荧光分光光度计检测人重组Ad5-TMEM166诱导U20S、KYSE150的肿瘤细胞Caspase-3 活性图9流式细胞术分析人重组Ad5-TMEM166对相对正常HEK293细胞的影响图10为Ex vivo实验人重组Ad5_TMEM166对食管癌KYSE150细胞生长的影响。A :分析细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5-TMEM166组的裸鼠成瘤性；B :第20天处死裸鼠取出瘤体并称重；C :肿瘤组织照片；D :动态检测细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5-TMEM166组的裸鼠动物体重。图11为In vivo实验人重组Ad5_TMEM166对食管癌KYSE150细胞生长的影响。A :分析细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5-TMEM166组的裸鼠成瘤性；B :第20天处死裸鼠取出瘤体并称重；C :肿瘤组织照片；D :动态检测细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5-TMEM166组的裸鼠动物体重。图12为In vivo实验免疫组化方法检测人重组Ad5_TMEM166对移植瘤细胞中Ki-67的表达。A :免疫组化方法分析细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5_TMEM166组肿瘤细胞Ki-67的表达；B :统计学分析的结果图13为In vivo实验=TUNEL方法检测人重组Ad5_TMEM166诱导移植瘤细胞发生凋亡。A =TUNEL方法分析细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5_TMEM166组肿瘤细胞凋亡细胞；B :统计学分析的结果图14为In vivo实验免疫组化方法检测人重组Ad5_TMEM166对移植瘤组织微血管密度(Microvessel Density, MVD)的影响。A :免疫组化方法分析细胞组、Ad5_Null组、人重组Ad5-TMEM166组肿瘤细胞⑶31蛋白的表达；B :细胞组、Ad5_Null组、人重组Ad5-TMEM166组肿瘤组织的H&E染色。图15为In vivo实验H&E染色分析细胞组、Ad5_Null组、人重组Ad5_TMEM166处理组重要脏器的影响图16为In vivo实验Western Blot分析细胞组、Ad5_Null组、人重组Ad5-TMEM166处理组中肿瘤组织中自噬蛋白P62的表达表I为Ad_TMEM166对U20S细胞的化疗协同效应表2为Ad-TMEM166对BGC823细胞的化疗协同效应
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例I、人Ad5_TMEM166重组腺病毒的构建、鉴定及纯化经PCR扩增得到TMEM166的cDNA片段，然后将TMEM166的片段和pShutt le-CMV (来自本室)用 BamHI 和 EcoR I (购自 New England Biolabs 公司)切开，纯化和回收相应的片段后，用T4连接酶(购自北京晶美生物公司)将TMEM166基因连接到pShuttle-CMV质粒上，筛选 阳性克隆，得到含有TMEM166基因(參见序列表I)的质粒，构建成 pShuttle-CMV-TMEM166。其中，pShuttIe-CMV质粒含有以下元件I. Kanr :为质粒在E. coli (如DH5 α )中扩增提供卡纳抗性(终浓度100 μ g/ml)。2. ori :质粒在E. coli中的复制起点。3. Ad =Ad序列，可以与Ad基因组质粒发生同源重组。4. CMV :来自MCMV病毒的立早启动子。5. SV40polyA :来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号。将重组后的pShuttle-CMV_TMEM166用BamHI和EcoR I进行双酶切，酶切产物进行电泳检測，质粒酶切鉴定结果參见图1A,其中，M :Marker (lkb DNAladder), I :为阳性克隆。将重组pShuttle-CMV_TMEM166酶切后与pAdxsi载体(来自本室)进行连接，然后转染293细胞，最终得到含有TMEM166基因的重组腺病毒。对Ad_TMEM166重组腺病毒进行酶切鉴定。结果參见图IB所不，M :Marker (lkb DNA ladder), I :为阳性克隆对照病毒Ad-null和Ad5_GFP (不含外源目的基因的重组腺病毒)用同样方式构建。病毒繁通、纯化、滴度测定按Graham等人(Graham F L,Prevce L,Gene transfer andexpression protocols Methods in Molecular Biology,Vol 7. Murray Z J ed. Clifton,NJ The Humane Press Inc, 1991. 109-128)的方法进行。Ad_TMEM166 及 Ad-null 毒种各生产50个125cm2培养瓶病毒，收获的病毒经纯化后进行质检，滴度为I X 10nPFU/ml。实施例2 Ad5-TMEM166在肿瘤细胞的表达呈浓度依赖性和时间依赖性KYSE150细胞培养于含10% FBS的1640培养基中，置于37°C，5% C02孵箱中培养。U20S、Saos-2 细胞培养于含 10% FBS (购自 HyClone, SH30084. 03)的 DMEM(购自 HyClone,SH30022. 01B)培养基中，置于 37°C，5 % C02 孵箱中培养。SGC7901、MGC803、BGC823 细胞细胞培养于含 5% FBS (购自 HyClone，SH30084. 03)的 DMEM (购自 HyClone，SH30022. 01B)培养基中，置于37°C，5% C02孵箱中培养。AGS细胞培养于含10% FBS(购自HyClone，SH30084. 03)的 F12(购自 HyClone, SH30026. 01B)培养基中，置于 37°C，5% C02 孵箱中培养。(上述细胞均购自美国ATCC)分别感染MOI为100、200、400、800、1600的Ad5_TMEM166和MOI为200的Ad5-Null，24小时后，收集细胞，按标准的免疫印记程序进行电泳、转膜、封闭等操作。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150四种肿瘤分别感染MOI为200的Ad5_TMEM166和MOI为200的Ad5-Null，24、48、72小时后，收集细胞，按标准的免疫印记程序进行电泳、转膜、封闭等操作。ー抗使用抗TMEM166多克隆抗体(由本实验室制备)，然后将膜用相应的Alexa Fluor 780-标记的IgG第二抗体(购自LI-C0R BIOSCIENCE INC)室温避光孵育I小吋。TBS-T洗膜三次，每次10分钟。固定于膜上的可被红外线激发的荧光团在780nm激发光的作用下，其波长为820nm的发射光可被LI-COR红外成像系统(购自LI-COR BI0SCIENCEINC)的信号检测器检测到。结果參见图2所示，人重组Ad5_TMEM166在肿瘤细胞的表达呈现浓度依赖性(图2A)和时间依赖性(图2B)。实施例3 Ad5-TMEM166降低肿瘤细胞存活率，呈现浓度依赖和时间依赖性U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为200的Ad5-TMEM166或MOI为200的Ad5_Null，感染24、48、72小时后，加入10μ L的CCK8试剂(Cell Counting Kit_8，购自日本同仁化学CK04)，继续培养 2 小时，用 EL-311SX ELISA Reader (购自 Bio-Tec Instruments)测定 450nm 波长的吸光度。细胞存活率为实验组的吸光度值/对照组的吸光度值X 100%。^<0.05，# < O. 01，***p < O. 001
结果參见图3A所示，人重组Ad5-TMEM166时间依赖性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞存活率。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为100、200、400、800的Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培养72小时后，加入IOyL的CCK8试剂，继续培养2小时，用EL-311SX ELISAReader(购自Bio-TecInstruments)测定450nm波长的吸光度。细胞存活率为实验组的吸光度值/对照组的吸光度值 X 100%。*p < O. 05，**p < O. 01，***p < O. 001。结果參见图3B所示，人重组Ad5-TMEM166浓度依赖性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞存活率。实施例4 Ad5-TMEM166诱导肿瘤细胞发生自噬我们将U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150四种肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为50的Ad5-GFP-LC3和MOI为200的Ad5_TMEM166，或MOI为50的Ad5-GFP-LC3和MOI为200的Ad5_Null，17-20小时后共聚焦荧光显微镜(购自美国Laica公司)观察GFP-LC3的斑点结构，GFP-LC3计数结果为GFP-LC3斑点细胞数/总GFP阳性细胞数。同时Western Blot分析GFP-LC3蛋白水平，ー抗使用LC3抗体(购自Cell Signaling公司)，ニ抗使用Alexa Fluor 780-标记的IgG抗体(购自LI-CORBIOSCIENCE INC)。结果參见图4，人重组Ad5-TMEM166感染后的肿瘤细胞，GFP-LC3呈斑点/块状分布的细胞比例明显增加(图4A，4B)。并且发现I型GFP-LC3蛋白的含量显著减低，提示细胞内LC3蛋白的消耗增加(图4C)。我们进ー步分析了代表自噬流量的标志物p62的变化(图5)。U20S和Saos_2肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为100、200、400、800、1600 的 Ad5-TMEM166 和 MOI 为 400 的 Ad5_Null，24 小时后，收集细胞进行 WesternBlot, —抗使用p62抗体(购自日本MBL公司)，ニ抗使用AlexaFluor 780-标记的IgG抗体(购自 LI-COR BIOSCIENCE INC)。结果參见5，随着MOI浓度的增高，p62蛋白水平明显下调，显示自噬流的增カロ(Kabeya, Y. , N. Mizushima, T. Ueno, A. Yamamoto, T. Kirisako, T. Noda, E. Kominami,Y. Ohsumi, and T. Yoshimori. 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, islocalized in autophagosome membranes after processing. Embo J 19:5720-5728·)。实施例5 Ad5-TMEM166诱导细胞自噬通过mT0R/p70S6K信号通路为进ー步掲示Ad5-TMEM166感染引起细胞自噬的分子机制，我们将KYSE150、BGC823、U20S以及Saos-2细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为400的Ad5-TMEM166、MOI为400的Ad5_Null或未处理的细胞，培养17-20小时后，收获细胞并进行Western Blot检测，分析磷酸化的mTOR(购自美国Cell SignalingTechnology 公司)、憐酸化的 p70S6K (购自美国 Cell Signaling Technology 公司)以及p62(购自日本MBL公司)蛋白水平,ニ抗使用Alexa Fluor 780-标记的IgG抗体(购自LI-COR BIOSCIENCE INC)。结果參见图6，Ad5-TMEM166 感染的 KYSE150、BGC823、U20S 以及 Saos-2 肿瘤细胞中，p-mT0R、p-p70S6K以及p62蛋白水平均有所下降，并且mT0R、S6K总量没有明显变化，结果提示Ad5-TMEM166诱导细胞自噬是通过抑制经典的mT0R/p70S6K信号通路介导的。 实施例6 Ad5-TMEM166诱导肿瘤细胞凋亡，呈浓度依赖性和时间依赖性目前认为，程序性细胞死亡主要包括细胞凋亡和自噬性程序性细胞死亡，并且许多调节细胞自噬的重要信号分子都直接參与细胞凋亡的调控，例如mT0R，p70S6K等。于是在进行细胞自噬检测的同时，本发明也对人重组人重组Ad5-TMEM166能否引起细胞凋亡进行了鉴定。将U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为100、200、400、800、1600的人重组Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培养24小时后收集细胞培养上清于离心管，胰酶消化细胞，一井转入离心管，I，500rpm离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，重悬于200 μ I结合缓冲液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mMNaCl, ImM MgCl2, 5mM KC1,2. 5mM CaCl2)，加入终浓度为 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (购自美国BD公司556547)，室温避光反应20分钟后加入终浓度为I μ g/ml的PI (购自美国BD公司556547)，根据细胞浓度补上200-400 μ I结合缓冲液，立即进行流式细胞术分析Annexin V的阳性细胞，为细胞凋亡的数目(图7Α)。U20S肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为200的人重组Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培养24、48和72小时后分别于24小时后和48小时后收集细胞培养上清于离心管，胰酶消化细胞，一井转入离心管，l,500rpm离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，重悬于200 μ I结合缓冲液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mM NaCl，ImM MgCl2, 5mM KCl，2· 5mM CaCl2)，加入终浓度为 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (购自美国BD公司556547)，室温避光反应20分钟后加入终浓度为I μ g/ml的PI (购自美国BD公司556547)，根据细胞浓度补上200-400 μ I结合缓冲液，立即进行流式细胞术分析Annexin V的阳性细胞，为细胞死亡的数目(图7Β)。U20S和KYSE150肿瘤细胞(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为200的人重组Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培养20小时后，收获细胞并应用POLARstar Galaxy荧光分光光度计(购自德国BMG公司)检测Caspase-3活化情況。具体操作如下细胞在全细胞裂解液(IOmM Tris-HCl，pH7. 5，130mM NaCl,l% Triton X-100，ImM PMSF)中冰上裂解30分钟，蛋白质浓度用BCA蛋白检测试剂盒测定(Pierce，USA)。取5yg细胞总蛋白，与Caspase-3活性检测缓冲液(25mM HEPES，pH 7. 5, IOOmM NaCl,ImM EDTA,0. 1% CHAPS, IOmM DTT)，荧光底物 Ac-DEVD_AMC(20 μ M)在 37°C共同孵育。使用POLARStar (BMG Labtechnology, Germany)荧光分光光度计检测AMC释放量，激发光380nm，发射光460nm。每10分钟测定一次，连续监测120分钟。以荧光强度的增加值代表Caspase-3酶活性，每个样品做三个重复孔。结果參见图7-8，Ad5_Null不能诱导细胞死亡，但人重组Ad5_TMEM166能够明显诱导肿瘤细胞凋亡，且呈浓度依赖性和时间依赖性。同时，与Ad5-Null比较，U20S, KYSE150细胞感染人重组Ad5_TMEM166后，能够明显激活的Caspase-3活化。实施例7人重组Ad5_TMEM166不能诱导相对正常的细胞死亡为了进ー步判断人重组Ad5_TMEM166用于基因治疗的可能性，本发明用其感 染相对正常细胞并检测其毒性。我们将人胚肾HEK-293细胞(购自美国ATCC，培养方式同实施例3)分别感染MOI为200的人重组Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培养24小时或48小时后，收获细胞并进行流式细胞术分析(图9A)。人胚肺二倍体成纤维2BS细胞(购自美国ATCC，培养方式同实施例3)感染MOI为200人重组Ad5-TMEM166或Ad5-Null，培养48小时，收获细胞并进行流式细胞术分析(图9B)。结果图9A和9B，人重组Ad5_TMEM166不能诱导相对正常的细胞死亡，说明人重组Ad5-TMEM166可能具有潜在基因肿瘤治疗的价值。实施例8 Ex vivo实验人重组Ad5-TMEM166在体内抑制食管癌KYSE150细胞的生长在接种肿瘤细胞前，连续两天腹腔注射环磷酰胺100mg/kg体重。然后，将处于对数生长期、活力状态良好的KYSE150细胞(购自美国ATCC，培养方式同实施例3)，在体外分别用Ad5-TMEM166及Ad5-Null腺病毒感染细胞(Μ0Ι 100)，未感染细胞作为对照，感染24小时后将细胞注射到裸鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)体内(2X 106/100 μ L/点)，待细胞组裸鼠成瘤后，每天测量肿瘤直径求得肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。收获时，对小鼠脏器进行取材处理。结果參见图10Α，与细胞组和Ad5_Null组相比，人重组Ad5_TMEM166组的裸鼠成瘤非常缓慢甚至不成瘤(P < O. 0001)。第20天处死裸鼠并拍照(图10C)，同时取出瘤体并称重，见图10B。结果发现人重组Ad5-TMEM166组的平均瘤重明显低于细胞组和Ad5-Null组(P < O. ΟΟΙ,ρ < O. 0001)。同时，通过动态检测动物体重，没有发现人重组Ad5-TMEM166的毒副作用(图10D)。实施例9 In vivo实验人重组Ad5_TMEM166抑制食管癌KYSE150细胞的生长开始实验前，所有动物(裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司)在各分组笼中放置I周，使其适应新实验环境。接种肿瘤细胞前，连续两天腹腔注射环磷酰胺100mg/kg体重。然后，将处于对数生长期、活力状态良好的KYSE150细胞(购自美国ATCC，培养方式同实施例3)，制成单细胞悬液，无血清培养液悬浮细胞浓度为2X IOfVlOOyLtj随机分成3组，每组6只裸鼠。对照组(6只)0.9%生理盐水；Ad5-Null对照组(6只)；Ad5-TMEM166治疗组(6只)。于每只裸鼠右侧腋窝皮下接种细胞浓度为2X 106/100 μ L/点，接种后每天观察接种点有无红肿及瘤结节的出现。每隔I天用游标卡尺测肿瘤宽径(a)、长径(b)，观察肿瘤体积的变化，按V = a2Xb/2换算出肿瘤的近似体积，绘制肿瘤生长曲线。实验期间，称量裸鼠体重以评价裸鼠对药物的副反应。待肿瘤体积为100mm3，Ad5-Null对照组进行每隔3天浓度MOI 100的瘤内注射，Ad5-TMEM166治疗组进行每隔3天浓度MOI 100的瘤内注射，共四次。待肿瘤长到单侧大于20mm，或者双侧大于15mm后，将动物处死，剥离肿瘤，称量移植瘤的重量(mg),计算最大肿瘤抑制率(Maximal tumor inhibition)(处理组/对照组，τ/c值)，肿瘤组织用10%中性福尔马林液固定。结果參见图11，随着病毒的瘤内注射治疗，人重组Ad5_TMEM166处理组的肿瘤体积明显小于对照细胞组和Ad5-Null组，从第16天开始与Ad5-Null组相比具有统计学意义ΓΡ<0.01)(如图IlA所示)。这些结果说明在人重组Ad5-TMEM166能减慢裸鼠体内KYSE150成瘤的速度。图12B和12C显示从裸鼠剥离的瘤体大小。称重后发现，人重组Ad5-TMEM166组的平均瘤重明显低于细胞组和Ad5_Null组ΓΡ < O. 001)。同时通过检测动物体重(图12D)，没有发现人重组Ad5-TMEM166的毒副作用。应该指出的是，在TMEM166处理组，常发现虽然肿瘤组织包膜完整，但是内容物却坏死液化，因而肿瘤重量明显减轻。实施例10 In vivo实验Ki_67检测人重组Ad5_TMEM166明显抑制移植瘤细胞的 增殖动物的处理同实施例9。利用免疫组化方法从剥离的肿瘤组织中检测细胞中Ki-67(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)的表达，分析肿瘤细胞增殖情況。具体实验步骤如下石蜡切片的制作(I)固定取实验各组的小鼠肿瘤组织用10%的甲醛溶液及时充分固定；(2)修块取固定好的肿瘤组织,用解剖刀分割成5 8mm小块，70%酒精清洗3次后，浸泡于70%酒精过夜；(3)脱水经梯度こ醇(80% 100% )将组织内的水份置换出，具体过程如下，80%こ醇(2 3小时)一90%こ醇(2 3小时)一95%こ醇I (2小吋)一95%こ醇II (2小吋)一无水こ醇I (2小吋)一无水こ醇II (2小吋)；(4)透明将脱好水的组织块浸入ニ甲苯I 20分钟，ニ甲苯II 20分钟，充分透明；(5)浸蜡透明好的组织块浸入65°C蜡I中30分钟，65°C蜡II中30分钟。浸蜡可去除组织中的透明剂，増加其硬度，便于切成薄片。石蜡温度不宜过高，以高于石蜡熔点2°C为宜，温度过高，时间过长，会使组织块变硬，变脆，收缩，不利于切成完整的切片；(6)包埋在组织包埋机上操作，注意组织切面朝下，摆放平整；(7)切片包埋好的蜡块置于切片机，调节好所需切片厚度，按操作规程进行切片。用毛笔和眼科镊子在42°C 45°C的温水中把切片打开，组织切片最好无褶皱，平整，刀痕、跳片现象。将理想的切片用载玻片(做免疫组化的切片需用涂有明胶粘片剂的载玻片)捞起。标记切片，分别置于32°C、37°C、52°C烘箱中烘烤24h以上。免疫组织化学染色(I)脱蜡前，应将组织切片置于55-60°C恒温箱中烘烤30分钟；(2)脱蜡石蜡切片置于ニ甲苯替代物Ι、Π中各浸泡20分钟，至透明为止；(3)梯度酒精水化将脱腊后的组织切片于100 %こ醇、100 %こ醇、95 %こ醇、95 %こ醇、85 %こ醇各浸泡5分钟X I次；(4)去除内源性过氧化物酶新鲜配置3% H2O2 (135ml甲醇+15ml 30%H2O2),室温下避光孵育9分钟；(5)抗原修复抗原修复液为朽1檬酸-梓檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高火加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热2分钟，自然冷却至室温；(6)封闭用正常羊血清工作液室温封闭20分钟；(7)鼠抗Ki-67单抗反应滴片，カロI 250相应ー抗(以PBS稀释)，37°C孵育I小吋；(8) PBS清洗5分钟X3次；(9) ニ抗反应对应加入相应HRP标记的兔抗鼠IgG (以PBS稀释)，室温反应20分钟；(IO)PBS洗5分钟X3次；(Il)DAB显色，滴片，镜下观察反应结果，苏木精复染细胞核后，中性树胶封片，于显微镜下观察并记录結果。
每张切片随机选择5个高倍视野由两位观察者在双盲情况下进行评价，计算Ki-67阳性细胞数占据总细胞数的比例，认定为阳性率。结果參见图12，图12A所示，人重组Ad5-TMEM166组Ki_67阳性信号最弱，对照细胞组和Ad5-Null组Ki-67阳性信号強。高倍镜下，随机选取5个视野，计算阳性细胞数占视野内总细胞数的比例，如图12B所示，人重组Ad5-TMEM166组的Ki_67表达明显低于对照细胞组和 Ad5-Null 组，P < O. 0001。实施例11 In vivo实验TUNEL检测人重组Ad5_TMEM166明显诱导移植瘤细胞的
凋亡
动物的处理同实施例9。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺ロ末端标记法，SPTUNEL法(购自美国罗氏)从剥离的肿瘤组织中检测裸鼠移植瘤中凋亡细胞的情況。具体步骤如下(I)移植瘤组织标本甲醛固定后用石蜡包埋，5 μ m连续切片，脱蜡，脱水；(2)切片加入100 μ L通透液(O. 1% Triton X-100,0. I %枸櫞酸钠)，覆盖整个标本，37°C下孵育8分钟，进行标本通透性处理；(3) PBS洗三次，每次5分钟。每个标本滴加3%H202 IOOyL,覆盖整个标本,室温下孵育8分钟，灭活内源性过氧化物酶；(4) PBS洗三次，每次5分钟。滴加50 μ L TUNEL反应混合物(TUNEL reaction mixture)，37°C孵育60分钟，期间配制标记反应混合物；(5) PBS洗三次，每次5分钟。滴加50 μ L Convert-POD，37°C孵育30分钟；(6)PBS洗三次，每次5分钟。滴加50 μ L DAB底物，室温下孵育10分钟；(7) PBS洗三次，每次5分钟。(8)苏木素复染，HCl分化，梯度酒精脱水干燥，ニ甲苯透明化处理，中性树胶封片。
(9)结果判定细胞核中有棕黄色颗粒为凋亡细胞，通过荧光显微镜观察蜡片，即随机选择5个视野(Χ400)中的凋亡细胞和凋亡小体，这些区域中的阳性染色细胞核数量与总细胞核数量的比值被定义为凋亡指数(apoptosis index,Al) ,Al =(总凋亡细胞数量/总肿瘤细胞数量)X 100%，取其平均值作为该裸鼠肿瘤组织的肿瘤细胞凋亡指数。结果參见图13A和13B，人重组Ad5_TMEM166组的移植瘤内凋亡的细胞明显多于对照细胞组和Ad5-Null组，P < 0. 0001。实施例12 In vivo实验人重组Ad5_TMEM166明显降低移植瘤组织微血管密度(Microvessel Density, MVD)，促进肿瘤组织缺血坏死新生血管形成是肿瘤生长、转移的前提，作为多种肿瘤预后标志的肿瘤组织微血管密度(Microvessel Density,MVD)受到广泛关注。CD31作为内皮细胞标志，在非成熟的肿瘤血管及成熟血管中均有表达，MVD-⑶31能精确反映肿瘤血管数量。动物的处理同实施例9。利用免疫组化的方法从剥离的肿瘤组织中检测了CD31(购自北京博奥森生物技术有限公司)在移植瘤组织中的表达。具体实验步骤同实施例10结果參见图14，图14A显示人重组Ad5_TMEM166组的移植瘤内MVD数目明显低于对照细胞组和Ad5-Null组。另外，肿瘤组织的H&E染色表明，人重组Ad5-TMEM166组的移植瘤内有大量的缺血坏死，以及瘤细胞溶解现象，而对照细胞组和Ad5-Null组较少，见图14B所示。实施例13 In vivo实验人重组Ad5-TMEM166对于KYSE150移植瘤裸鼠的重要脏
器无明显毒性动物的处理同实施例9。将KYSE150移植瘤实验各组裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏重要脏器进行石蜡切片，并进行H&E染色。具体实验步骤如下(I)脱蜡60°C烘烤蜡片过夜，将烘烤好后的切片进行脱蜡，ニ甲苯I，室温，20分钟一ニ甲苯II，室温，15分钟。(2)水化梯度酒精100%こ醇I，室温浸泡，5分钟一100%こ醇II，室温浸泡，5分钟—95%こ醇,室温浸泡,5分钟一90%こ醇,室温浸泡,5分钟一80%こ醇,室温浸泡,5分钟—70%こ醇，室温浸泡，5分钟一蒸馏水I，室温浸泡，5分钟一蒸馏水II，室温浸泡，5分钟。
(3)染色用滤纸过滤苏木精后，将水化好的切片置于其中，室温浸泡，40秒一自来水冲洗(稍洗)一I %盐酸こ醇，室温浸泡,2秒一自来水冲洗(稍洗)一I %氨水,室温浸泡,2秒—蒸馏水I，室温浸泡，3分钟一蒸馏水II，室温浸泡，3分钟一伊红，室温浸泡，I分钟一蒸懼水稍洗一70%こ醇,室温浸泡,30秒一80%こ醇,室温浸泡,30秒一90%こ醇,室温浸泡，5分钟一95%こ醇，室温浸泡，5分钟一100%こ醇I，室温浸泡，5分钟一100%こ醇II，室 温浸泡，5分钟一ニ甲苯I，室温浸泡，10分钟一甲苯II，室温浸泡，10分钟。(4)封片将染色完成的切片，ニ甲苯未完全干燥，迅速用滴管吸取中性树胶滴在组织上，盖好盖玻片，凝固后便可观察。结果參见图15，人重组Ad5-TMEM166对于小鼠重要脏器无毒副作用。实施例14 In vivo实验Western Blot证明人重组Ad5_TMEM166处理的肿瘤细胞自噬水平上调。动物的处理同实施例9。利用Western Blot从剥离的肿瘤组织中检测了 p62 (购自日本MBL公司)的表达水平。结果參见图16，人重组Ad5_TMEM166处理的肿瘤组织p62表达下调，证明自噬水平上调。实施例15肿瘤化疗药物增加TMEM166诱导的肿瘤细胞死亡3-甲基腺嘿呤(3-Methyladenine, 3-MA,购自美国 sigma 公司)和 LY294002(购自美国sigma公司)是PI3K/AKT抑制剂，也是肿瘤的化疗药物(例如參见QadirMA, Kwok B，Dragowska WH, To KH, Le D，Bally MB, Gorski SM. Macroautophagyinhibition sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells and enhancesmitochondrial depolarization.Breast Cancer Res Treat.2008，112 :389-403 ；Beurel，E.，M.Kornprobst，M.J. Blivet-Van Eggelpoel, A.Cadoret，J.Capeau, andC. Desbois-Mouthon. 2005. GSK_3beta reactivation with LY294002 sensitizeshepatoma cells to chemotherapy-induced apoptosis. Int J Oncol 27:215-222·)。在人重组Ad5-TMEM166感染的的U20S、BGC823，(上述细胞均购自美国ATCC，培养方式同实施例3)，加入50 μ M的LY294002，24小时或48小时后，收获細胞，流式细胞术分析細胞死亡的情況。结果參见表1，Ad-TMEM166能够诱导的U20S细胞死亡，MOI为200时是5. 19%，MOI 400时为13. 32% ；LY294002药物单独处理的细胞死亡是5. 88%，当LY294002药物分别与MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166联合处理细胞，细胞死亡率分别上升到31. 38%和77. 86% (Μ0Ι 400)，两者联合应用导致细胞死亡的数目显著升高。3-MA药物单独处理的细胞死亡是10. 76%，当3-MA加入到已转染TMEM166质粒的U20S中，24小时后流式细胞术分析细胞死亡的情况，细胞死亡的数目上升到38. 28%。从表2可见，Ad-TMEM166能够诱导的BGC823细胞死亡，MOI为200时是10. 43%,MOI 400时为15. 82%%；LY294002药物单独处理的细胞死亡是11. 44%，当LY294002药物分别与MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166联合处理细胞，细胞死亡率分别上升到25. 83%和36. 47%，两者联合应用导致细胞死亡的数目显著升高。上述结果初步提示，3-MA和LY294002作为肿瘤的化疗药物，能够增加TMEM166诱导的肿瘤细胞细胞死亡，反过来说，TMEM166也能増加化疗药物的敏感性，特别是耐药细胞的敏感性。表I TMEM166和化疗药物协同诱导U20S细胞死亡
权利要求
1.一种重组腺病毒,其中所述重组腺病毒是将人TMEM166基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人TMEM166基因的表达盒包括启动子、人TMEM166的cDNA和终止子。
2.根据权利要求I所述的重组腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表达盒中，所述启动子为CMV启动子，所述终止子为SV40终止子。
3.根据权利要求I或2所述的重组腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表达盒还包括SV40polyA信号序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组腺病毒在诱导肿瘤细胞自噬和凋亡、抑制肿瘤细胞生长的药物制备中的应用。
5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为非实体瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述肿瘤细胞为实体瘤细胞。
7.根据权利要求7所述的用途，其中所述的实体瘤细胞为骨肉瘤细胞、胃癌细胞以及食管癌细胞等。
8.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物与化疗药物联合给药来抑制肿瘤细胞生长。
9.根据权利要求9所述的用途，其中所述的化疗药物为3-甲基腺嘌呤(3-MA)和LY294002 等。
10.ー种药物，其包含权利要求1-3中任一项所述的重组腺病毒。
全文摘要
本发明公开了一种重组腺病毒TMEM166作为基因治疗药物在抗肿瘤中的应用。本发明的重组腺病毒，是将人TMEM166基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人TMEM166基因的表达盒包括启动子、人TMEM166的cDNA和终止子。本发明的重组腺病毒TMEM166在体内和体外实验中均可明显的诱导肿瘤细胞发生自噬和凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。并且重组腺病毒TMEM166对肿瘤化疗药物有很好的协同作用，本发明的重组腺病毒TMEM166可广泛用于多种肿瘤的基因治疗。
文档编号A61K48/00GK102851315SQ201110178440
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者马大龙, 陈英玉, 常莹, 许冬, 李艳军, 郭金海, 王峰, 石太平 申请人:北京大学, 北京诺赛基因组研究中心有限公司