专利名称：一种紫杉醇长循环纳米粒制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种长循环紫杉醇纳米粒制剂，同时本发明还涉及该紫杉醇纳米粒的制备方法。
背景技术：
紫杉醇(Paclitaxel)是从太平洋红豆杉树皮中分离出的一种四环二萜类化合物。紫杉醇分子式为C47H51O14N,分子质量853. 9，具有高度亲脂性，不溶于水，血浆蛋白结合率89%至98%，半衰期为5. 3至17. 4小时，主要经肝脏代谢，肾脏清除仅5%。此药于1983年开始用于卵巢癌和乳腺癌的临床研究，1992年美国FDA批准上市。临床研究已经证实了紫杉醇在抗多种实体肿瘤，包括乳腺癌、晚期卵巢癌、肺癌、脑部和颈部肿瘤以及急性白血 病方面，都有重要而显著的作用。临床上已作为一线用药而广泛应用。紫杉醇难溶于水，现行临床注射制剂通常使用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻(Cremophor EL)和乙醇增溶，临床应用前需要预先稀释，因溶剂的转换，紫杉醇易析出沉淀，并且Cremophor EL可引起体内组胺释放，造成病人出现药物性皮疹、呼吸急促，支气管疫挛和低气压等过敏反应。另外Cremophor EL还可以溶出聚氯乙烯塑料管和输液袋中的增塑剂，导致更严重的过敏反应发生。即便同时应用氢化可地松，过敏反应的发生率仍达10% 30%。基于上述原因，国内外药剂工作者开展了广泛深入的研究，开发了大量紫杉醇新型制剂。如环糊精包合物(公开号为CN1931368的专利含有环糊精紫杉醇包合物的药物组合物及其制备方法)、脂质体(公开号为CN101011357的专利一种紫杉醇脂质体制剂的制备方法)、聚合物纳米粒(公开号为CN101884618A的专利一种长循环紫杉醇纳米粒及其制备方法)、乳剂(公开号为CN1671370A的专利增溶紫杉醇的组合物及其制备方法)，这些新剂型虽然从一定程度上改善了现有制剂的不足，但均存在各自的缺陷，如环糊精本身存在极高的肾毒性；脂质体制剂包封率低、易泄漏、稳定性差；聚合物纳米粒载药量低、突释现象明显、有机溶剂不易除尽等；以乳剂处方及工艺制备的紫杉醇乳剂放置两周即会析出紫杉醇沉淀。这些难以克服的缺陷阻碍了上述新型制剂的产业化发展和试剂临床应用。纳米粒给药系统(Nanoparticles-baseddrug delivery systems)是将纳米技术和纳米材料应用于药学领域产生的,它以纳米粒(Nanoparticles, NP)作为药物载体的一种药物输送体系。纳米粒(Nanoparticle, NP)是一类由高分子物质组成的固态胶体粒子，粒径大小介于10 lOOOnm，可分散在水中形成近似胶体溶液，由于纳米粒性质上的奇特性和优越性，作为药物载体，已成为国内外医药学的重要研究方向。用于制备纳米粒制剂的辅料多为高分子可降解聚合物。聚酯类是迄今为止研究最多，应用最广的生物可降解高分子材料，常用的有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚-己内酯(PCL)等。在药物制剂制备过程中常用非离子表面活性剂泊洛沙姆(Poloxamer) 188、聚乙二醇(1000、2000、4000)、F68、水溶性维生素E (又称d-a-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，TPGS)等做为乳化剂或助乳化剂来稳定制备过程。在纳米粒的制备过程中，我们尝试引入卵磷脂作为助乳化剂，因为磷脂有类似于细胞膜的结构，对于细胞对纳米粒的吸收有促进作用，使得制备的纳米粒既有长循环纳米粒的优势又有脂质体的部分性能。制备纳米粒的常 用的方法包括乳化法和纳米沉淀法。近年来发展了一种改进的纳米沉淀法，这种方法实际上是对溶剂挥发法的改进，但由于成球机理不同和在纳米粒制备过程中的广泛应用，这种方法已经完全独立发展为一种纳米粒制备技术。此方法采用水溶性溶剂如丙酮或乙醇作为油相，将要包载的药物溶于其中。由于水溶性溶剂进入水中后自发性分散，迅速穿透油/水界面，降低界面张力，使液滴不断变小，在水中不能溶解的聚合物向界面迁移、沉积并固化，最终形成纳米粒。这种方法的优点是重复性好，粒径均匀。此方法的缺陷在于，水溶性药物在溶剂分散的过程中易于从聚合物相渗漏出来，导致包封率较低。实验表明，改进的纳米沉积技术保持了较高的粒子产率和很好的粒子表面形态，为大规模工业化生产创造了方便。但上述的各种纳米沉淀法均是将油相滴加入水相，即将成球材料的良溶剂滴加入不良溶剂中，未见将水相滴加入有机相来制备纳米粒的报道，而且本领域技术人员从未尝试过或者尝试后轻易放弃了反向滴加溶剂的方法，有反向滴加不能用来制备纳米粒的固有偏见。由于PLA和PLGA纳米粒容易被巨噬细胞识别并吞噬，在体内循环时间短，不能发挥足够的药效，因此我们往往需要对纳米粒进行表面修饰，常用的表面修饰剂有聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚维酮、肝素、人血白蛋白、唾液酸及神经节苷酯等，使用PEG修饰是最常用的一种方法，因此通过特殊的表面修饰来达到纳米粒长循环的目的已经是现在研究纳米粒的一大热点。水溶性维生素E具有两亲性，是一种安全高效的乳化剂，其分子末端有类似于PEG的片段，多用于乳剂配方中，但TPGS作为助溶剂用于长循环纳米粒的制备还未见专利报道。另据报道水溶性维生素E本身具有抗癌活性，且对抑制抗药性也有一定的作用。因此在本发明中我们采用TPGS作为共聚物纳米粒的表面活性剂兼长循环修饰剂，制备的纳米粒同样具有较好的长循环效果。目前就紫杉醇长循环纳米粒这方面的技术还不成熟，尚没有一套成熟的制备工艺制备出理想的长效纳米粒，很多都停留在实验室阶段，无法完成规模化扩大生产。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种紫杉醇纳米粒制剂，该制剂可长循环、毒副作用低、疗效高、可静脉注射。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种全新的纳米粒制备方法，该方法克服了本领域技术人员的固有偏见，方法简便，制备出的纳米粒粒径分布更窄。本发明目的是通过如下技术方案实现的一种紫杉醇纳米粒制剂，制剂中包含紫杉醇、共聚物、助溶剂和注射用水。其中，所述共聚物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸，所述的共聚物与紫杉醇的重量比例为5 I至20 1，特别优选为10 I。所述的助溶剂为水溶性维生素E或其与大豆卵磷脂的混合物，优选为水溶性维生素E。所述的助溶剂与紫杉醇的重量比例为15 I至60 1，优选为30 I。所述的纳米粒制剂的平均粒径小于200nm,纳米粒的药物包封率可达到70%至95%。本发明采用PLGA、PLA做为包裹疏水性药物的共聚物，利用TPGS作为助溶剂形成一层保护纳米粒的壳层材料，并且我们在工艺上另辟新路，采用反向滴加法制备了粒径均匀、包封率高、载药量高的新型紫杉醇纳米粒，粒径控制在200纳米以下。一种长循环纳米粒制剂是由以下材料制备完成的紫杉醇I份，载体材料5-20份，助溶剂15-60份，纳米粒的粒径范围为50 200nm ;所述的载体材料为PLA或者PLGA，所述的助溶剂水溶性维生素E(TPGS)、或其与大豆卵磷脂的混合物。本发明还提供了上述紫杉醇纳米粒制剂的制备方法，包括如下步骤i将紫杉醇和共聚物溶于有机溶剂中作为油相，助溶剂溶于水中作为水相；ii在剪切力作用下将水相滴加到油相中，得到蓝色乳光的乳液；iii去除有机溶剂。其中，所述有机溶剂为丙酮或乙腈，优选为丙酮。油相和水相的体积比例为I : 3至I : 8，优选为I : 5。本发明的长循环紫杉醇纳米粒，由于本身粒径在50_200nm，可用于静脉注射和静脉滴注。所使用的共聚物为可降解材料，本身无毒副作用，代谢产物为水和二氧化碳，中间产物也是人体正常的代谢产物。水溶性维生素E是人身体必须的材料，作为助溶剂有比其他助溶剂更好的优势，而且在我们的工艺中TPGS的用量也比其他助溶剂低，即降低了材料的用量，又避免了毒副作用，据报道TPGS本身就具有一定的抗肿瘤活性，而且在抑制抗药性方面也有一定的作用。TPGS的端基相当于PEG片段，能够减少血液对纳米粒的调理作用，从而延长循环时间。目前现有的技术中制备纳米粒的方法包括纳米沉淀法、自动乳化法、乳化聚合法、喷雾干燥法和高压乳均法等。其中纳米沉淀法制备工艺简单，可应用于大规模生 产，是一种具备广泛应用前景的制备方法。紫杉醇纳米粒给药后，纳米级别的紫杉醇与肿瘤组织接触并向其深处渗透，对肿瘤组织进行特异性杀伤，由于EPR效应粒径在50-200nm之间的纳米粒材料容易在肿瘤部位聚集，起到药物累积的效果，可以对肿瘤更好的杀伤，由于TPGS等壳层的存在使得纳米粒可以缓慢的释放药物，起到缓释的效果，减少用药的次数。由于TPGS中PEG片段的存在，使得纳米粒表面形成比较大的空间位阻，起到长循环的作用，另外TPGS等载体材料是纳米粒表面形成很多微孔结构，增加纳米载体中药物的释放，维持肿瘤组织中紫杉醇的有效治疗浓度。
图I正向滴加(实施例I)纳米粒的粒径分布2反向滴加(实施例2)纳米粒的粒径分布3肿瘤体积随注射时间的变化图
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施实例I :正向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将有机相以lml/min的速度滴入水相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒。激光动态散射仪测试平均粒径为105. 02±30nm，粒径分布结果如图I所示。纳米粒的包封率为80. 2±4%，分散系数为0. 389。实施实例2 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为140. 01±10nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为90. 4±3%，分散系数为0.042。
实施实例3 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和8mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为156. 01±10nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为84. 4±3%，分散系数为0. 108。实施实例4 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和2mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为135. 51±10nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为92. 4±3%，分散系数为0. 035。实施实例5 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，84mgTPGS溶解于30ml双蒸水中形成水相，将36mg大豆卵磷脂溶于IOml 4%乙醇水溶液中，将两种水溶液混合形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，接着反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒。激光动态散射仪测得的纳米粒平均粒径为102. 32±10nm。纳米粒的包封率为85. 2 ± 4 %，分散系数为0. 087。实施实例6 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，48mgTPGS溶解于30ml双蒸水中形成水相，将72mg大豆卵磷脂溶于IOml 4%乙醇水溶液中，将两种水溶液混合形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，接着反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒。激光动态散射仪测得的纳米粒平均粒径为87. 44±20nm。纳米粒的包封率为70. I ±5%，分散系数为0. 163。实施实例7 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mgTPGS溶解于80ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪测试得到纳米粒的平均粒径为143. 29±15nm。纳米粒的包封率为88. I ±3%，分散系数为0. 154。实施实例8 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mgTPGS溶解于30ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到 旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪测试得到纳米粒的平均粒径为160. 21±20nm。纳米粒的包封率为70. I ±5%，分散系数为0. 235。实施实例9 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，120mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为190. 41±30nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为79. 4±3%，分散系数为0. 263。实施实例10 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，240mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为150. 44±20nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为93. 4±3%，分散系数为0. 058。实施实例11 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml丙酮溶剂中作为油相，60mg TPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒，激光动态散射仪的测试得到的平均粒径为165. 81±25nm，粒径分布结果如图2所示。纳米粒的包封率为71. 4±3%，分散系数为0. 173。实施实例12 :反向滴加长循环纳米粒的制备40mgPLGA和4mg紫杉醇共同溶于IOml乙腈溶剂中作为油相，120mgTPGS溶解于50ml双蒸水中形成水相；将水相以5ml/min的速度滴入有机相中，300r/min低速搅拌下形成浅蓝色的纳米乳，接着反应IOmin后,转移到旋转蒸发仪,真空旋转蒸发下处理30min,去除丙酮溶液，得到长循环纳米粒。激光动态散射仪测得的平均粒径为170.54±30nm。纳米粒的包封率为81.4±2%，分散系数为0. 164。实施实例13 :长循环纳米粒包封率的测定采用液相高效色谱测紫杉醇的含量色谱柱安捷伦C18柱；流动相乙腈水(50 50 V v);检测波长227nm;流速l.Oml/min;进样量20ul。分别取浓度为0. 25 50ug/ml的紫杉醇标准品溶液，按照色谱条件进行测试，以峰面积对紫杉醇浓度进行曲线拟合，建立回归方程。将得到的纳米粒混悬液先1000r/min低速离心IOmin去掉没有包进去的药物结晶，再在10000r/min高速离心30min，将上清液吸掉，然后用高纯水复溶再加入同等体积的乙腈破乳，将破乳得到的溶液按照色谱条件测定紫杉醇的含量。同时取未经任何处理的纳米粒混悬液加同样体积的乙腈破乳，按照HPLC条件测紫杉醇的含量包封率)=纳米粒包封的药物的量/投入药物总的量X 100%所得微球的平均包封率为80 95 %。实施实例14 :长循环纳米粒的冻干将纳米粒混悬液离心处理过后，加入10%体积分数的蔗糖，在_40°C下预冻10h，然后在_60°C冷阱条件下冷冻干燥48h，即的长循环纳米粒冻干粉末。冻干粉末复溶后粒径基本没有发生变化，没有聚集现象出现。实施实例15 :长循环纳米粒的动物体实验 为了更好的评价我们纳米粒的抗肿瘤性能，以下用紫杉醇缓释纳米粒(实施例2，
3)同现有的临床用紫杉醇注射液在小鼠肺癌细胞A549细胞系皮下瘤模型实验及其结果来比较说明紫杉醇纳米粒在治疗而行肿瘤中的有效性。实验结果显示紫杉醇纳米粒对A549细胞系皮下瘤模型有较好的抑制肿瘤生长的作用。紫杉醇缓释纳米粒剂型(紫杉醇剂量为10mg/kg)与紫杉醇注射液剂型(紫杉醇含量为10mg/kg)相比，毒性较小，且疗效持久，不需要长时间频繁给药。肿瘤抑制结果如图3所示。
权利要求
1.一种紫杉醇纳米粒制剂，其特征在于所述制剂中包含紫杉醇、共聚物、助溶剂和注射用水。
2.根据权利要求I所述的紫杉醇纳米粒制剂，其特征在于所述共聚物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸，所述的共聚物与紫杉醇的重量比例为5 I至20 : I。
3.根据权利要求I所述的紫杉醇纳米粒制剂，其特征在于所述的助溶剂为水溶性维生素E或其与大豆卵磷脂的混合物。
4.根据权利要求I所述的紫杉醇纳米粒制剂，其特征在于所述的助溶剂与紫杉醇的重量比例为15 I至60 I。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的紫杉醇纳米粒制剂，其特征在于所述的纳米粒制剂的平均粒径小于200nm，纳米粒的药物包封率为70%至95%。
6.一种制备根据权利I至5中任一项所述的紫杉醇纳米粒制剂的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 i将紫杉醇和共聚物溶于有机溶剂中作为油相，助溶剂溶于水中作为水相； ii在剪切力作用下将水相滴加到油相中，得到蓝色乳光的乳液； iii去除有机溶剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于有机溶剂为丙酮或乙腈。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于油相和水相的体积比例为I: 3至 I : 8。
全文摘要
本发明公开了一种紫杉醇长循环纳米粒。本发明的纳米粒制剂包含紫杉醇、共聚物、助溶剂、注射用水等，所制备的纳米粒中紫杉醇占共聚物的重量分率为5％～20％。本发明还公开了一种紫杉醇长循环纳米粒的制备方法。采用反向滴加溶剂的方法将含助溶剂水溶性维生素E(TPGS)的水相滴入含紫杉醇和共聚物的油相，得到粒径均匀、平均粒径小于200nm、包封率高、稳定性好的纳米粒制剂。本纳米粒制剂可用于恶性肿瘤的治疗，通过动物实验评价证明其具有更高的安全性和有效性。
文档编号A61P35/00GK102772368SQ201210298490
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者余波, 王国营, 袁媛 申请人:杭州普施康生物科技有限公司