猪圆环病毒Ⅱ型与猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型与猪伪狂犬病二联疫苗，其特征在于，包含至少一种猪圆环病毒Ⅱ型抗原和至少一种猪伪狂犬病毒抗原。本发明还涉及该二联疫苗的两种制备方法：其一是将猪圆环病毒Ⅱ型进行灭活，制成猪圆环病毒Ⅱ型灭活苗；将猪伪狂犬病毒抗原与冻干保护剂混合，制成猪伪狂犬冻干活疫苗，然后将所述灭活苗作为稀释液溶解所述猪伪狂犬冻干活疫苗制备成猪圆环Ⅱ型、猪伪狂犬二联疫苗组合物；其二是将猪圆环病毒Ⅱ型抗原和猪伪狂犬病毒抗原按比例混合，然后与冻干保护剂混合制备成二联冻干疫苗。使用本发明的二联疫苗，可以大大降低冷链运作的费用，联合用疫苗对猪伪狂犬病抗原免疫效果有协同作用，且不影响猪圆环病毒抗原的免疫效果。
【专利说明】猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗【技术领域】，具体涉及一种猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法和应用。【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒，而PCV2为致病性的病毒，与通常不具有毒力的PCVl形成对比，猪的PCV2感染与多种疾病综合症有关，这些疾病综合症共同称为猪圆环病毒性疾病，亦被称为猪圆环病毒相关疾病。
[0003]猪圆环病毒性疾病侵袭5-22周龄的猪，临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长迟滞、呼吸窘迫、腹泻、黄疸及黄疸病。在一些受侵袭的猪中，会明显出现所有症状的组合，而也有一些受侵袭的猪仅具有一种或两种上述症状。感染PCV2的猪的死亡率接近50%，在尸体剖检中，显微镜可见及肉眼可见多个组织及器官损伤，其中淋巴器官是最常见的损伤部位。已经观察到PCV2核酸或抗原的量与显微镜可见的淋巴损伤程度强烈相关。此外，亦已发现血液中核酸或抗原的量与临床症状的严重程度相关，在患有猪圆环病毒性疾病的猪具有高于IO6基因组当量数/毫升的病毒含量。
[0004]猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是多种动物共患的传染病，引起家畜和野生动物急性致死性的传染病，以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状，猪是其自然易感宿主，主要引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，仔猪感染主要是神经症状，成年猪则以隐性感染为主，该病已成为种猪繁殖障碍综合症的主要病因。近年来研究发现，PCV2和PRV混合感染时具有协同作用，导致断奶后仔猪病情加重，损失更为严重。
[0005]与PCV2感染的临床明显疾病表现相比，亚临床PCV2感染被认为存在于那些感染了 PCV2但无临床症状的动物中。一般而言，PCV2感染的这些形式间存在相关性，因为亚临床的感染可以转变成猪圆环病毒性疾病，而恢复期的动物可能保持持久感染状态。
【发明内容】
[0006]本 申请人:在重复亚临床PCV2感染向猪圆环病毒性疾病转变的试验中，意外的发现猪伪狂犬病毒可导致该转变的发生。
[0007]因此，本发明的目的在于给猪接种猪圆环病毒疫苗，并联合接种猪伪狂犬病毒疫苗，可以理解为给猪接种二联疫苗或同时使用猪圆环病毒疫苗和猪伪狂犬病毒疫苗，联合用猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫，可以大大降低冷链运作的费用。特别地，本 申请人:意外地发现，联合用疫苗对猪伪狂犬病抗原免疫效果有协同作用，且不影响猪圆环病毒抗原的免疫效果。
[0008]本发明提供一种猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗，其包含至少一种猪圆环病毒II型抗原和至少一种猪伪狂犬病毒抗原。
[0009]本发明的猪圆环病毒II型抗原含有至少一种PCV2抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下任一种抗原:如
梅里亚公司(Merial)的Circovac?;辉瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn?: PCV2 ;哈尔滨维科生
物技术开发公司的猪圆环病毒II型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的 Ingelvac CircoFLEX?)。 [0010]优选地，本发明中猪圆环病毒II型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原，其中优选使用PCV2SH株，保藏号为CGMCC N0.23890，公开于专利文献CN101240264A。PCV2不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登录号AY686763)、PCV2LG株(GenBank 登录号 HM038034)、PCV2DBN-SX07-2 (GenBank 登录号 HM641752)的抗原组合物或疫苗组合物均在本发明保护范围之内。
[0011]优选地，本发明中猪圆环病毒II型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份，更优选地，猪圆环病毒II型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒II型抗原为PCV20RF2蛋白。其中，本发明PCV20RF2蛋白，优选序列表SEQN01.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的、优选80%以上的、更优选90%以上的氨基酸序列的蛋白，为能达到本发明目的的蛋白序列。本发明对PCV20RF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV20RF2蛋白都可用作本文所述PCV20RF2DNA和/或多肽的来源。
[0012]优选地，本发明的二联疫苗中所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。优选地，所述的猪伪狂犬病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏编号 ￥200002)33株(06110:，保藏编号 N0.0907)、WKQ-001 株(CCTCC，保藏号 V200511)或伪狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha-K61株、Bucharest株、BUK株、H株(GCMCC，保藏号为N0.5013)和C株(CCTCC，保藏编号V201114)的一种或任意几种的组合。
[0013]优选地，本发明的二联疫苗中所述PCV2病毒含量为IO3~IO7TCID5tl/头份；更优地，所述PCV2病毒含量为IO4~IO6TCID5tl/头份。所述PCV20RF2蛋白生物的含量为0.5~50 μ g/头份，更优选5~30 μ g/头份，更优选10~20 μ g/头份。所述的猪伪狂犬病毒抗原含量为IO5~IO7TCID5tl/头份，优选地为IO6TCID5tl/头份。优选地，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量为IO5~IO7TCID5tl/头份，优选地为IO6TCID5tl/头份。
[0014]本发明的优选方式涉及二联疫苗的佐剂，优选为頂S1313N VG、MS2215VG、Gel01、卡波姆、蜂胶、ISA206、ISA15A的一种或几种的组合物。
[0015]更优选地，本发明所述的猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗中，还包括冻干保护剂。优选地，本发明所述的冻干保护剂，可以是乳糖、脱脂牛奶、明胶、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸钠中一种或几种。[0016]优选的，本发明所述的冻干保护剂优选12wt%_30wt%的乳糖、lwt%_5wt%的明胶，更优选为2wt%明胶与15wt%乳糖的1:1 (v/v)的混合物。
[0017]本发明的另一目的在于提供上述二联疫苗的制备方法，本发明是通过两种技术方案来实现的，方案一是将猪圆环病毒II型进行灭活，制成猪圆环病毒II型灭活苗；将猪伪狂犬病毒抗原与冻干保护剂混合，制成猪伪狂犬冻干活疫苗，然后将所述灭活苗作为稀释液溶解所述猪伪狂犬冻干活疫苗制备成猪圆环II型、猪伪狂犬二联疫苗组合物。方案二是将猪圆环病毒II型抗原和猪伪狂犬病毒抗原按比例混合，然后与冻干保护剂混合制备成二联冻干疫苗。
[0018]本发明的另一目的在于提供一种所述二联疫苗在制备预防和/或控制猪圆环病毒II型病和猪伪狂犬病药物中的应用，特别是，所述二联疫苗在制备预防和/或控制PCV2临床发病的药物中在应用。
[0019]本发明技术方案带来的有益效果至少包括:
[0020]I)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
[0021]2)本发明的猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒感染的二联疫苗，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且意外发现猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒的抗原混合后，猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒的抗原组合物不仅能产生的保护性免疫应答的同时，还意外发现猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒抗原有相互增强免疫效果的作用，而且如本发明后续实施例所证明的，特别是存在其中一种抗原的情况下，另一种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员预料的。
[0022]3)解决了现有技术的困难，改变了人们对猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒同时感染时的认识偏见，首次将猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒抗原按照合适的比例联合使用，而在本发明之前，一直没有人认为两种病可以同时进行预防进而这两种疫苗可以联合使用；
[0023]4)本发明的猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒感染的二联疫苗，在预防和治疗猪圆环病毒II型疾病及猪圆环病毒II型亚临床感染的应用，可以有效的防止猪圆环病毒II型亚临床感染向猪圆环病毒II型临床感染的转变，遏制病情的蔓延。
[0024]5)此外，本发明预防和治疗猪圆环病毒II型相关疾病和猪伪狂犬病毒相关疾病的二联疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫I次就能够预防猪圆环病毒II型和猪伪狂犬病毒两种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。【具体实施方式】
[0025]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0026]本发明所述“每头份”或“/头份”是指每头猪每次用疫苗量。未作特别说明之处，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”为2ml。本发明所述疫苗佐剂包括但不限于:Gel01 (法国SEPPIC)、氢氧化招胶、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂胶、ISA206 (法国SEPPIC)或ISA760VG (法国SEPPIC)，优选水溶性疫苗佐剂，例如GelOl (法国 SEPPIC)。
[0027]本发明所述冻干保护剂的例子，包括但不限于:明胶水溶液、乳糖水溶液及其混合物，优选2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0028]实施例[0029]实施例1猪圆环病毒II型抗原的制备
[0030]I猪圆环病毒II型亚单位抗原的制备
[0031](I)将猪圆环病毒2型0RF2基因引入蜂毒素信号肽基因序列，转入pMD-18T载体，获得包含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组载体:首先设计引物Spe_ATG(5’ -cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3') ?口弓L Hind-TAA(5' _gcaagctttattcattaagggttaagttggg_3，)，以保藏号为CGMCC N0.2389的PCV2-SH株的基因组DNA为模板，扩增PCV2-0RF2基因，并将扩增的0RF2基因克隆入pMD-18T载体中，获得重组载体pT_0RF2。PCR产物大小约730bp。将PCR产物进行测序，由电泳及测序结果可知，重组载体pT-0RF2含序列表中的SEQ ID NOl序列。具体序列详见专利CN101884787A。
[0032]设计4条引物，以pT-0RF2为模板，通过融合PCR方法在0RF2基因序列5'端引入蜂毒素信号肽核昔酸序列和限制性酶SpeI和Hind III酶切位点，引物如下:
[0033]HBM-F15' _tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt_3’
[0034]HBM-Rl5' -ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3’
[0035]HBM-F25’ _ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg_3’
[0036]HBM-R25’ _aaacaagggcaacgttgactaagaatttc_3’
[0037]通过SpeI和Hind III双酶切带有蜂毒素信号肤核昔酸序列的0RF2序列，并将其克隆入转移载体pFastBacTMl (Invitrogen)，构成包含猪圆环病毒2型重组0RF2基因的载体pFastBacP2。用PCR扩增并测序，由测序结果可知,重组转移载体pFastBacP2含蜂毒素信号肤核昔酸序列，即含序列表中的SEQ ID N02序列。具体序列详见专利CN101884787A。
[0038](2)包含猪圆环病毒2型重组0RF2基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组0RF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒vBac_P2;将PFastBacP2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DHlOBac (购自Invitrogen公司),获得重组质粒Bacmid_P2;经PCR筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒Bacmid-P2DNA。采用Cellfectins RReagent转染Sf9细胞(购自Invitrogen公司)，待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物Ml3F和Ml3R进行PCR验证目的重组0RF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac_P2。扩增重组杆状病毒vBac_P2作为种毒,通过噬斑法进行效价滴定后于4° C保存备用。
[0039](3)重组杆状病毒vBac_P2感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养，将vBac_P2重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞High Five?(购自Invitrogen公司)。在含有200_350ml的EXPRESS FIVE SFM培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养High Five?细胞，接种细胞密度为0.3-0.6 X IO6个细胞/mL当细胞密度达到I X IO6个细胞/ml时，用重组病毒vBac_P2接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数(M.0.1.)分别是0.01、
0.1、10接种重组杆状病毒后，以26-28°C培养，转速为lOOrpm，培养4天。
[0040](4)重组杆状病毒的猪圆环病毒2型重组0RF2基因表达猪圆环病毒2型重组0RF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组0RF2蛋白。具体表达条件及鉴定方法参照专利CN101884787A。
[0041](5)将培养物经1000Og离心20分钟，分离沉淀和上清液，上清液通过I μ m的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，超滤膜孔径为10000 (切割分子量)，纯化后的样品溶液经7mM 二乙烯亚胺(BEl)灭活重组杆状病毒载体，36-48小时，加入等量的硫代硫酸纳中和。然后通过紫外分光光度计进行蛋白抗原含量测定，测定结果为500μg/ml。4°C保存。
[0042]2猪圆环病毒II型 全病毒灭活抗原的制备
[0043]猪圆环病毒II型(SH株)病毒液的制备:将长满单层的PK15细胞(购自ATCOJgJ去细胞培养液，将PCV2毒种按0.1~0.2TCID50的接种量接种于PK15细胞上，37°C吸附30分钟，加入细胞维持液，置37°C旋转培养。每日观察I~2次，细胞生长良好，36~37°C培养4~7日后收获细胞培养物，冻融2-3次后，测定毒价结果为106 5TCID5(l/ml，将抗原液置于-20°C以下保存。
[0044]将病毒液用中空纤维(0.5 μ m~2 μ m)滤柱过滤，除去细胞碎片，经浓缩后，测定毒价结果为107.tlTCID5tZml再加入0.1%~0.2%的甲醛溶液37°C灭活24h，加入0.1%~0.2%中和剂来中和甲醛的毒性。
[0045]实施例2猪伪狂犬病毒抗原的制备
[0046]将猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株，为TK7gE7gf三基因缺失，公开于中国专利CNlOl 186902，该毒株以保藏编号V200002保藏于CCTCC)用病毒稀释液(无血清的DMEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M.0.1)为0.1接种于ST细胞(购自CCTCC，编号⑶C0060)培养，37°C吸附30min，加入含3% (v/v)犊牛血清的DMEM细胞维持液，37°C培养2~4日，冻融2~3次，收获病毒，病毒效价为108_ 7TCID5tZml。
[0047]实施例3猪圆环病毒II型抗原与猪伪狂犬病毒抗原二联疫苗的制备
[0048]1.猪圆环病毒II型灭活疫苗稀释猪伪狂犬病冻干活疫苗
[0049]将猪圆环病毒II型全病毒灭活抗原与水质佐剂MS1313N VG以1:1比例混合，用IKA搅拌器以350rpm)搅拌混匀5min制成乳剂。按照国家标准对其进行检验,均符合规定。具体疫苗配比参照表1进行，共设A~G7种，其中A、B、C、D、E、F组中猪圆环病毒II型部分采用PCV2全病毒灭活抗原，每头份(2ml)中含量分别为103_°TCID5(1、104_°TCID5(1、106_°TCID5Q、106.0TCID50, 107.0TCID50 和 106.0TCID500
[0050]A、B、C、D、E、G组猪伪狂犬病毒部分将猪伪狂犬病毒抗原与冻干保护剂(2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合,搅拌混匀30~60min，无菌分装进行冻干，按照表1中含量配比制成猪伪狂犬冻干活疫苗。[0051]使用时，将A、B、C、D、E组中以猪圆环病毒II型灭活疫苗作为稀释液溶解猪伪狂犬冻干活疫苗，按表1所示各组分别加至冻干的猪伪狂犬活疫苗，溶解混匀。共制成5种不同配比的疫苗组合物。F组为单独的猪圆环病毒II型灭活疫苗，G组为单独的猪伪狂犬病毒冻干活疫苗。
[0052]表1猪圆环病毒II型全病毒抗原与猪伪狂犬抗原具体配比
[0053]
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗，其特征在于，包含至少一种猪圆环病毒II型抗原和至少一种猪伪狂犬病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪圆环病毒II型抗原为PCV2全病毒和/或含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位。
3.根据权利要求1或2所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒抗原的含量为IO5~IO7TCID5tl/头份，所述猪圆环病毒II型抗原的含量为IO3~IO7TCID5tl/头份。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的二联疫苗，其特征在于，还包括疫苗佐剂，所述佐剂为頂S1313N VG、IMS2215VG, GelOl、卡波姆、蜂胶、ISA206或ISA15A的一种或几种的组合物。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的二联疫苗，其特征在于，还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为2wt%明胶与15wt%乳糖的1:1 (v/v)的混合物。
7.一种制备猪圆环病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤:将猪圆环病毒II型进行灭活，制成猪圆环病毒II型灭活苗；将猪伪狂犬病毒抗原与冻干保护剂混合，制成猪伪狂犬冻干活疫苗，然后将所述灭活苗作为稀释液溶解所述猪伪狂犬冻干活疫苗。
8.一种制备猪圆环 病毒II型与猪伪狂犬病二联疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤:将猪圆环病毒II型抗原和猪伪狂犬病毒抗原按比例混合，然后与冻干保护剂混合进行冻干。
9.权利要求1~6中任一项所述的二联疫苗在制备预防和/或控制猪圆环病毒II型病和猪伪狂犬病药物中的应用。
10.权利要求1~6中任一项所述的二联疫苗在制备预防和/或控制PCV2临床发病的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/22GK103920146SQ201310012804
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2013年1月14日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司