建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用的制作方法

建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提出了建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用。分离间充质干细胞的方法，包括：A）利用胶原酶对动物样本进行消化，以便分散所述动物样本中所包含的细胞，以便获得包含干细胞的细胞混合物；B）将编码报告蛋白的核酸分子引入所述细胞混合物的至少一部分细胞中，其中，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连，以便在间充质干细胞中表达所述报告蛋白；以及C）利用FACS，分选获得表达所述报告蛋白的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞呈单个细胞的形式。利用该方法能够有效地制备单个细胞形式的间充质干细胞。
【专利说明】建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域。具体的，本发明涉及分离干细胞的方法及其用途。更 具体的，本发明涉及分离干细胞的方法，利用该方法所得到的干细胞或其衍生物，以及该干 细胞或其衍生物在制备药物中的用途。

【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(MSC)最近受到了广泛关注，因为其具有有利于移植的性质，即其具 有多潜能和非免疫原性。已经报道了可以从成人骨髓和胎儿组织分离获得间充质干细胞 (MSC)。从骨髓分离的MSC (BM MSC)已经被报道为在体外具有高增殖潜能的多潜能细胞。 BM MSC能够分化为脂肪细胞（A)、成骨细胞（0)、软骨细胞（C)以及血管平滑肌（V)谱系，但 不能分化成骨骼肌细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞或神经细胞谱系。这暗示了他们可以 用于众多受损组织的细胞治疗：骨骼、软骨、中枢神经细胞和心肌组织。
[0003] 首先，从间充质干细胞的体外分离方法上来看，主要有贴壁法，密度梯度离心法， 流式细胞术和免疫磁珠分离法。前两种方法的缺点主要在于细胞纯度较低；后两种方法的 共同缺点在于1)没有真正特异性的细胞表面标记；2)对细胞活性有较大影响，易造成MSCs 的损伤，出现增殖缓慢等问题；3)操作复杂，价格昂贵，一般仅限于实验室应用。这些存在 的技术瓶颈问题在很大程度上限制了 MSCs的临床应用与发展。然而，目前还没有能够分离 单克隆间充质干细胞的方法。其次，从间充质干细胞临床运用角度来看，目前主要开展的自 体干细胞移植技术在临床各类疾病中得到广泛运用。但缺点在于：骨髓来源取材不便，易造 成自体损伤；外周血来源必须借助外源性刺激，使干细胞达到一定数量；脂肪来源虽避免 了上述劣势，但存在体外扩增的致瘤性及血清使用的致病性。
[0004] 因此，建立单克隆间充质干细胞的方法有待于进一步地改进。


【发明内容】

[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商 业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效分离干细胞的方法，利用该方法能 够获得单个细胞形式的干细胞，进而可以获得由单个细胞形成的干细胞单克隆集群。
[0006] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离干细胞的方法。根据本发明的实施 例，该方法包括:A)利用胶原酶对动物样本进行消化，以便分散所述动物样本中所包含的细 胞，以便获得包含干细胞的细胞混合物；B)将编码报告蛋白的核酸分子引入所述细胞混合 物的至少一部分细胞中，其中，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动 子可操纵地相连，以便在间充质干细胞中表达所述报告蛋白；以及C)利用FACS，分选获得 表达所述报告蛋白的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞呈单个细胞的形式。根据本发 明实施例的方法，由于编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相 连，因此，该编码报告蛋白的核酸分子将会在细胞混合物中所包含的间充质干细胞中得到 特异性表达，从而利用细胞流式分选手段，可以对特异性表达报告蛋白的间充质细胞进行 有效分选，从而得到单个细胞形式的间充质干细胞。
[0007] 根据本发明的实施例，前述方法还可以具有下列附加技术特征：
[0008] 在本发明的一个实施例中，所述动物样本为来自选自肝脏组织、脂肪组织、骨实 质、肌肉、脐带血、脐带、胎盘、外周血、胰腺、肺脏、经血和牙髓的至少一种。可选的，所述动 物样本为来自胎儿肝脏组织及成人骨髓组织。从而可以有效地提高分离间充质干细胞的效 率。
[0009] 在本发明的一个实施例中，将编码报告蛋白的核酸引入所述细胞混合物的至少一 部分细胞中包括：利用液体培养基对所述细胞混合物进行培养；将构建体引入所述培养获 得的贴壁细胞中，其中，所述构建体包括：编码报告蛋白的核酸分子；以及间充质干细胞特 异性启动子，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连。 由此，可以有效地将编码报告蛋白的核酸分子引入到细胞中，并且可以使得编码报告蛋白 的核酸分子能够有效地在间充质干细胞中获得表达。
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述液体培养基为α-MEM培养基。由此，可以进一步 提高后续分离间充质干细胞的效率。根据本发明的实施例，该培养基还可以添加 EGF或 FGF2等生物因子，从而维持MSC的最佳生物学特性及分化潜能。
[0011] 根据本发明的实施例，可以采用的报告蛋白的类型不受特别限制，只要其具有可 检测的活性即可。根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶 的至少一种。具体地，根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白 质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等，或者报告蛋白可以是一种能够与底物 相互作用以产生可检测信号的酶。由此，可以根据常规的方法，对报告蛋白进行监测和对表 达报告蛋白的细胞进行分选。根据本发明的一些具体示例，优选地，报告蛋白可以为绿色荧 光蛋白（GFP)、增强型绿色荧光蛋白（EGFP)以及荧光素酶的至少一种。根据本发明的一个 具体示例，优选报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白，由此，报告蛋白产生的荧光信号能够更容 易地被检测到，从而使信号检测更加灵敏，由此，在本发明的一个实施例中，所述报告蛋白 为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。可选的，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白。
[0012] 在本发明中所使用的术语"可操纵地"指的是核酸表达控制序列例如启动子等与 目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合 时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，根据本发明 的实施例，可以直接通过构建体在间充质细胞中引入特定的间充质干细胞特异性启动子用 于启动编码报道蛋白的核酸分子的转录和表达，由此，可以提高所获得的接受该核酸分子 的细胞中报告蛋白的表达。根据本发明的具体示例，可以采用的间充质干细胞特异性启动 子为人NAN0G启动子，其基因组序列为：
[0013] 5' -GATTTAAAAGTTGGAAACGTGGTGAACCTAGAAGTATTTGTTGCTGGGTTTCTC TTCAGGTTCT GTTGCTCGGTTTTCTAGTTCCCCACCTAGTCTCCCTTACTCTGCAGCTAC TTTTGCATTACAATGGCCTTGGTGA GACTGGTAGACGGGATTAACTGAGAATTCACAAG GGTGGGTCAGTAGGGGGTGTGCCCGCCAGGAGGGGTGGGTCT AAGGTGATAGAGCCT TCATTATAAATCTAGAGACTCCAGGATTTTAACGTTCTGCTGGACTGAGGCTGGTTGCCT CATGTTATTAT-3'。
[0014] 在本发明中所使用的术语"构建体"是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序 列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中与宿主细胞的基因组发生同源重组以获得重 组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可 以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例， 构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于 操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以 是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。
[0015] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种干细胞或其衍生物，所述干细胞是通过 前面任一项所述的方法制备的。由于利用前面所述的方法所得到的干细胞是单细胞形式的 干细胞，或者属于干细胞的单克隆集群，因而其具有相同的遗传背景，降低了其在用于动物 体时的免疫原性。另外，利用根据本发明的实施例所获得的干细胞或其衍生物纯度高；基因 组单一性，便于今后基因组测序；不易分化或分化程度较非单克隆细胞低，易保持原有MSC 的特性与潜能。
[0016] 因而，在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的干细胞或其衍生物在制备 药物中的用途，所述药物用于治疗选自下列的至少一种：血液系统疾病、心血管疾病、肝硬 化、神经系统疾病、神经系统修复、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病、脊髓 损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、 糖尿病足和肝硬化。这些疾病已经被证实，可利用间充质干细胞进行有效治疗，从而利用根 据本发明方法所得到的间充质干细胞，基于前述本发明单克隆间充质干细胞的优点，将能 够获得更有效地治疗效果。
[0017] 为此，在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物，其特征在于，包括：前 面所述的干细胞或其衍生物；以及药物上可以接受的赋形剂。
[0018] "治疗"在本发明中包括预防、缓解、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其他有害 过程，包括干扰治疗和/或由治疗引起的过程。
[0019] 由本文所述方法产生的单个形式的细胞或单克隆干细胞都可用于临床以处理受 试者。"受试者"是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于人、家畜、 竞技动物和宠物。需要用本发明的方法治疗的受试者包括由于物理损伤或疾病有关的损 伤而患有功能丧失的受试者。因此，可将它们制剂成药物组合物。因此，在某些实施例中， 干细胞存在于适于给药即生理上相容的组合物中。因此，组合物通常还包括一种或多种缓 冲剂（例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水）、碳水化合物（例如葡萄糖、甘露糖、鹿糖或葡 聚糖）、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂例如EDTA或谷 胱甘肽、佐剂（例如氢氧化铝）、使所述制剂与接体的血液相比等渗、低渗或稍微高渗的溶 质、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂。在其他实施例中，细胞可以存在于适于冷冻或储藏的组 合物中。在许多实施例中，用于给予受试者的细胞的纯度为约100%。在其他实施例中，其 为95%-100%。在其他实施方式中，其为95%-100%。优选地，对于与其他细胞的混合物，所述 百分比可为约 1〇%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、 60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-95%。或者，分离/纯度可以细胞倍增的形式表示，其中 细胞已发生例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多倍的细胞倍增。给定体积的细胞数量可 通过广为人知的和常规的方法和仪器测定。给定体积的细胞混合物中的细胞的百分数可通 过几乎一样的方法测定。可手动或通过使用自动细胞计数器容易地对细胞进行计数。给定 体积的特定细胞可使用特异性染色和目测以及通过使用特异性结合试剂（一般为抗体）、 荧光标记和荧光激活细胞分选器的自动化方法而测定。倚赖多种因素选择用于为给定用途 给予所述细胞的剂型。在这些因素中，重要的是受试者的物种，待治疗的病症、功能障碍或 疾病的性质及其在受试者中的状态和分布，其他待给予的疗法和试剂的性质，给药的最佳 途径，经过该途径的残存性，给药方案以及其他本领域技术人员明了的因素。例如，具体地， 合适载体和其他添加剂的选择会倚赖给药的确切途径和特定剂型的性质。例如，细胞存活 可为基于细胞的疗法的效力的一个重要决定因素。这对于主要治疗和辅助治疗都是成立的 当。目标位点不适于细胞接种和细胞生长时会产生另一个担心。这可能会阻止治疗性细胞 到达该位点和/或移植到那里。本发明的多个实施例包括增加细胞存活和/或克服因接种 和/或生长屏障而引起的问题的措施。细胞/培养基的水性悬液的最终配制一般包括将所 述悬液的离子强度调节到等渗（即约0. 1-0. 2)以及将pH调节到生理pH(即约PH6. 8-7. 5)。 所述最终制剂通常还含有液体润滑剂例如麦芽糖，其必须为身体所耐受。示例性润滑剂成 分包括甘油、糖原、麦芽糖等。基于有机聚合物的材料，例如聚乙二醇和透明质酸以及非纤 维状胶原（优选琥珀酸化的胶原），也可用作润滑剂。这些润滑剂通常用于在注射位置上改 善所注射生物材料的注射能力、润透性和分散性，以及通过改变所述组合物的粘性来降低 推动力（spiking)。最后的配制是将所述细胞限定在可药用载体中。随后将所述细胞置于 注射器或其他注射装置中以精确注射到组织缺损的位点上。术语"可注射"指所述制剂基 本不需推动即可在正常压力和正常条件下以带有低至25号针头的注射器中给予。推动可 导致组合物从注射器溢出而非注射到组织中。对于这一精确布置，需要细至27号（200 μ I. D.)甚至30号（150yI.D.)的针头。可通过这些针头挤出的最大颗粒大小是至少具有以 下参数的复杂函数：颗粒最大尺寸、颗粒长宽比（长：宽）、颗粒刚性、颗粒表面粗糙度和影 响颗粒之间粘性的有关因素、悬浮液的粘弹性，以及通过针头的流速。悬浮于牛顿流体种的 刚性圆珠代表最简单的情况，而在粘弹性流体中的纤维性或有分支的颗粒似乎复杂得多。 所述组合物的理想等渗性可使用氯化钠或其他可药用剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二 醇、或其他无机或有机溶质实现。氯化钠特别优选用于含有钠离子的缓冲液。如果需要，可 使用可药用的增稠剂将所述组合物的粘性保持在选定水平上。优选甲基纤维素，因为它可 方便和经济地获得并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙 基纤维素，卡波姆等。所述增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。重要的是使用量可实 现选定的浓度。粘性组合物通常是通过在溶液中加入所述增稠剂而制备的。可药用的防腐 剂或稳定剂可用于增加细胞/培养基组合物的寿命。如果加入所述防腐剂，那么选择不影 响所述细胞生活力或效力的组合物完全在本领域技术人员的知识范围之内。本领域技术人 员会认识到所述组合物的成分在化学上应为惰性的。这在化学和药学原理方面不对本领域 技术人员构成问题。可使用本公开内容提供的信息、本文引用的和本领域通常可获得的文 献，参考教科书或通过简单实验（不包括过度试验）可以容易地避免问题。无菌可注射溶 液可通过以下方式制备：根据需要，将用于实现本发明的细胞与不同量的其他成分掺入所 需量的合适溶剂中。
[0020] 在某些实施例中，干细胞可被制成单位剂量的可注射形式，例如溶液、悬液或乳 液。适于细胞注射的药物制剂通常为无菌水性溶液和分散体系。用于可注射制剂的载体可 为溶剂或分散介质，含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙 二醇等）以及它们的合适混合物。本领域技术人员可容易地确定将在本发明方法中给予的 组合物中的细胞和可选添加剂、媒介（vehicle)和/或载体的量。通常，任何添加剂（除所 述细胞以外）都以〇. OOlwt% -50wt%的量存在于溶液例如磷酸缓冲盐水中。所述活性组 分以微克至毫克量级存在，例如约〇. 〇〇〇lwt%到约5wt%，优选约0. OOOlwt%到约lwt%，最优 选约 0· OOOlwt% 到约 0· 05wt%，或者约 0· OOlwt% 到约 20wt%，优选约 0· Olwt% 到约 10wt%， 最优选0. 05wt%到约5wt%。在某些实施例中，将细胞封装以给药，特别是当胶囊化可提高 治疗效力时或者提供处理和/或C藏寿命上的优点时。在某些实施例中，当胶囊化增加细 胞介导的免疫抑制的效力时，它也因此降低对免疫抑制药物治疗的需要。此外，在某些实施 例中，胶囊化提供可进一步降低受试者对所述细胞（通常在同种异体移植中不是免疫原性 的或者只是微弱免疫原性的）的免疫反应的针对受试者免疫系统的屏障，从而减轻由于给 予所述细胞而可能发生的任何移植排斥或炎症。细胞可在植入前通过膜以及胶囊进行封 装。应考虑到，可使用可用于细胞胶囊化的多种方法中的任意一种。在某些实施例中，细胞 被单独封装。在某些实施例中，许多细胞被封装在同一膜内。在其中所述细胞在植入后被 取出的实施例中，一个例如在单个膜内封装许多细胞的较大尺寸的结构可提供方便的回收 方法。在微囊化细胞的多种实施例中可使用多种材料。这些材料包括例如聚合物胶囊，藻 酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微胶囊、聚-L-赖氨酸藻酸钡胶囊、藻酸钡胶囊、聚丙烯腈/ 聚氯乙烯（PAN/PVC)中空纤维以及聚醚砜（PES)中空纤维。某些实施例将细胞加入聚合物 中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的实例包括但不限于纤维连接蛋白、纤维蛋 白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原和蛋白多糖。其他因子例如上面讨论的细胞因子也可被加入 所述聚合物中。在其他实施例中，细胞可被加入三维凝胶的空隙中。大的聚合物或凝胶通 常通过手术植入。可配制成足够小的颗粒或纤维的聚合物或凝胶可通过其他常规的、更方 便的、非手术的途径给予。具体地，对于治疗肝脏缺陷的情况，所述细胞可被封装在一个可 植入受试者的装置中。细胞可被植入到肝脏中或肝脏附近或其他位置以取代或补充肝脏功 能。细胞也可不在装置中而植入，例如现有的肝脏组织中。
[0021] 组合物可根据诸如具体患者的年龄、性别、体重和病症，以及将给药的制剂（例如 固体或液体）等因素，按剂量并通过医药和兽医领域技术人员公知的技术给药。人类或其 他哺乳动物的剂量可由技术人员根据本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识，不 需过度实验而得出。适用于本发明多个实施例的细胞剂量取决于多种因素。其对于不同的 情况可发生相当大的变动。可确定主要和辅助治疗的最佳给药剂量的参数包括下面的一 些或全部：要治疗的疾病及其阶段；受试者的物种、它们的健康、性别、年龄、体重和代谢速 率；受试者的免疫活性；其他正在给予的疗法；以及根据受试者的历史或基因型预测的可 能并发症。所述参数还可包括：所述细胞是同基因的、自体的、同种异体的还是异种的；它 们的效能（具体活性）；使所述细胞有效而必须靶向的位点和/或分布；以及所述位点的这 些特性例如细胞的可达性和/或细胞的植入性。其他参数包括与其他因子（例如生长因子 和细胞因子）的共给药。给定情况下的最佳剂量还要考虑将细胞制剂的方式、给予它们的 方式、给药后细胞定位到靶标位点的程度。最后，最佳剂量的确定必须提供这样的有效剂 量，即所述剂量既不低于最大有益效果的阈值也不高于剂量相关的有害作用超过增加剂量 的益处的阈值。对于某些实施例，细胞的最佳剂量处在用于自体、单核骨髓移植的剂量范围 内。对于非常纯的细胞制剂，在不同实施例中，每次给药的最佳剂量可为1〇 4?1〇8个细胞 /kg接受者质量。在某些实施例中，每次给药的最佳剂量为105?10 7个细胞/kg。在许多 实施例中，每次给药的最佳剂量为5X 105?5X 106个细胞/kg。用于参考，前述较高的剂 量与用于自体单核骨髓移植的成核细胞的剂量相似。某些较低的剂量与用于自体单核骨髓 移植的CD34+个细胞/kg的数量相似。应理解，单份剂量可一次、分份或在一段时间内连续 递送。也可将整份剂量递送到一个位置或分散到若干个位置。
[0022] 在各种实施例中，细胞可以一个初始剂量给药，然后通过再次给药保持。细胞可在 开始通过一种方法给药，然后通过相同方法或者一种或多种不同方法给药。水平可通过继 续给予所述细胞而保持。各种实施例通过静脉注射在开始时给予所述细胞和/或保持它们 在受试者中的水平。在多种实施例中，可根据患者的病情和本文其他地方讨论的其他因素 使用其他给药形式。应注意，人类受试者接受治疗的时间通常长于实验动物，然而，治疗的 长度通常与疾病过程和治疗效果的长度成比例。本领域技术人员会考虑使用在人和/或动 物（诸如大鼠、小鼠、非人灵长类等）中实行的其他方法的结果，以确定用于人的合适剂量。 基于这些考虑并根据本公开内容和现有技术所提供的指导的，这种确定可使技术人员不需 过度实验而确定剂量。初始给药和再次给药或连续给药的合适方案可以都相同或者可以是 变化的。合适方案可由技术人员根据本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识，不需 过度实验而得出。治疗的剂量、频率和持续时间取决于许多因素，包括疾病的性质、受试者 以及可能给予的其他疗法。因此，多种方案可用于给予所述细胞/培养基。在某些实施例 中，将细胞以一个剂量给予受试者。在其他一些实施例中，将细胞以一系列的两个剂量或多 个剂量连续给予受试者。在其中以一个剂量、两个剂量和/或多于两个的剂量给予细胞的 其他一些实施例中，剂量可相同或不同，并且给药之间的间隔可相同或不同。细胞可在各种 不同时间内以多种频率给药。在某些实施例中，细胞在小于1天的时间内给药。在其他实 施例中，它们在2、3、4、5或6天的时间内给药。在某些实施例中，细胞在数周的时间内以每 周一次或多次给药。在其他实施例中，细胞在数周的时间内给药持续一到数月。在多种实 施例中，细胞可在数月的时间内给药。在其他实施例中，细胞可在一或数年的时间内给药。 通常治疗长度是与疾病过程的长度、所用疗法的效果以及要治疗的受试者的情况和反应成 比例的。
[0023] 根据本发明的实施例，所分离的间充质干细胞可具有被诱导分化以形成至少一种 选自以下的细胞的能力：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平 滑肌、心肌、内皮细胞、上皮细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞或少突胶质细胞类 型。本发明还提供从上述间充质细胞获得的分化细胞，其中其后代细胞可为骨、软骨、脂肪 细胞、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮细胞、上皮细胞、内分泌细胞、外分 泌细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞或少突胶质细胞。所述分化后代细胞可为皮 肤上皮细胞、肝上皮细胞、胰腺上皮细胞、胰腺内分泌细胞或岛细胞、胰腺外分泌细胞、肠上 皮细胞、肾上皮细胞或上皮相关结构。细胞或其分化后代可用于纠正遗传疾病、退化性疾 病、心血管疾病、代谢贮积病、神经疾病或癌症过程。它们可用于产生用于治疗牙周病的齿 龈样材料。它们可用于形成皮肤上皮组织，所述皮肤上皮组织源自可用于皮肤移植和整形 手术的细胞。它们可用于例如在阴茎或心脏中强化肌肉。它们可用于产生治疗用体外血，或 产生人造血细胞和/或人用出生前或出生后动物血。它们可用作治疗剂以例如在患者从癌 症治疗、自身免疫疾病治疗的化疗或放疗恢复中起辅助作用，以引起接受者的耐受性。它们 可用于治疗AIDS或其他传染病。视神经细胞可用于治疗由包括但不限于视神经疾病导致 的失明，所述视神经疾病由包括但不限于黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜 色素变性导致。所述细胞或源自所述细胞的心肌细胞可用于治疗心脏病，包括但不限于心 肌炎、心肌病、心力衰竭、由心脏病发作导致的损伤、高血压、动脉粥样硬化和心脏瓣膜功能 不全。它们还可用于治疗涉及CNS缺陷或损伤的疾病。此外，所述干细胞或其神经元分化 后代细胞可用于治疗涉及神经缺陷或退化的疾病，包括但不限于中风、阿尔茨海默氏症、帕 金森氏病、亨廷顿氏病、艾滋病相关痴呆、脊髓损伤、影响脑部或其他神经组织的代谢性疾 病。细胞或它们的分化后代例如基质细胞可用于支持其他细胞类型在体内或体外的生长和 分化，所述其他细胞类包括但不限于造血细胞、胰腺岛细胞或β细胞、肝细胞等。所述细胞 或分化软骨后代，可用于治疗关节或软骨疾病，包括但不限于软骨撕裂、软骨变薄、骨关节 炎。此外，所述细胞或它们的分化成骨细胞后代可用于改善对骨具有有害效果的过程，包括 但不限于骨折、骨折不愈合、骨关节炎，由扩散到骨的肿瘤（例如前列腺癌、乳腺癌、多发性 骨髓瘤等）导致的骨"洞"。使用合适的生长因子、趋化因子和细胞因子，细胞可被诱导以分 化形成若干谱系，包括例如多种具有中胚层表型的细胞、具有神经外胚层表型的细胞（神 经胶质细胞、少突胶质细胞和神经元）和具有内胚层表型的细胞。这些包括成骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞、软骨和骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮细胞、造血细胞、基质细胞、神经元细 胞和上皮细胞。已被诱导分化以形成骨细胞的细胞可在骨质疏松、佩吉特氏病（Paget' s disease)、骨折、骨髓炎、骨坏死、软骨发育不全、成骨不全症、遗传性多发性骨软骨瘤、多发 性骨飯发育不良、玛丽安氏综合征（Marfan' s syndrome)、粘多糖积症、神经纤维瘤病或 脊柱侧弯中用作细胞疗法或者用于组织再生，局部畸形、脊柱裂、半椎体或融合椎骨、肢体 畸形的重建手术，肿瘤损伤组织的重建以及感染（如中耳炎）后的重建。已被诱导分化以 形成软骨细胞的细胞可用于与年龄有关的疾病或损伤、运动相关损伤中的组织再生，或特 定疾病例如类风湿关节炎、银屑病关节炎、赖特关节炎（Reiter's arthritis)、溃瘍性结肠 炎、克罗恩病（Crohn' s disease)、强直性脊柱炎、骨关节炎中的细胞疗法或者组织再生； 外耳的重建手术；鼻的重建手术；以及环状软骨的重建手术。已被诱导分化以形成脂肪细 胞的细胞可用于重建或整容手术的重塑，包括但不限于，乳房切除术后的乳房重建、对因其 他手术例如从脸或手上切除肿瘤造成的组织丧失进行整形、隆胸和去皱。还可用于II型糖 尿病的治疗。因此衍生的脂肪细胞还可提供用于研究脂肪调节的有效体外模型系统。成 纤维细胞：源自所述细胞的成纤维细胞可用于细胞疗法或组织修复以促进伤口愈合或提供 结缔组织支撑物，例如整容手术的支架。已被诱导分化以形成骨骼肌细胞的细胞可用于杜 氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy)、贝克肌营养不良症（Beckermuscular dystrophy)、强直性肌营养不良症、骨骼肌肉病变的治疗中的组织修复，以及修复骨骼肌损 伤的重建手术。已被诱导分化以形成平滑肌细胞的细胞可用于胃肠系统发育异常例如食道 闭锁、肠闭锁和肠套叠的治疗中的细胞疗法或组织修复，以及肠梗塞或结肠造口手术后的 组织替换。平滑肌细胞还可用于膀胱或子宫重建、新血管形成、由例如动脉粥样硬化或动脉 瘤造成的血管损伤的修复。平滑肌前体细胞（肾小球膜细胞）可用作肾小球疾病的体外模 型或用于糖尿病性神经病中的细胞疗法或组织再生。平滑肌前体还可用于修复远曲小管或 肾小球旁组织的致密斑。心肌细胞可用于治疗心肌梗塞后的、伴随充血性心力衰竭的、瓣膜 置换过程中的、由先天性心脏异常引起的或者由心肌病或心内膜炎引起的心脏组织损伤的 细胞疗法或组织修复。小神经胶质细胞可用于治疗脊髓损伤和神经退化性障碍例如亨廷顿 氏症（Huntington's disease)、帕金森氏症、多发性硬化症和阿尔茨海默氏症，以及用于影 响中枢神经系统的传染病过程中损伤组织的修复。被遗传改变以产生细胞因子的小神经胶 质细胞还可用于移植以治疗通道因血脑屏障被限制的中枢神经系统中的传染病。神经胶质 细胞还可产生由多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症和脑癌引起的中风后神经组织再生以及 脊髓损伤后再生的生长因子或生长因子抑制因子。基质细胞：基质细胞可用作化疗后骨髓 置换和骨髓移植的移植细胞。内皮细胞可用于治疗因子VIII缺陷和用于新血管形成。内皮 细胞还可提供使用血管形成抑制因子抑制肿瘤的体外模型，以及血管炎、超敏反应和凝血 障碍的体外模型。造血细胞：造血细胞可用于在高剂量化疗后再增殖骨髓。源自所述聚集体 细胞的造血细胞可进一步分化以形成血细胞，以贮存在血库中，缓解输血血液不足的问题。 小神经胶质细胞可用于治疗脊髓损伤和神经退化性障碍例如亨廷顿氏症、帕金森氏症、多 发性硬化症和阿尔茨海默氏症，以及对影响中枢神经系统的传染病中损伤组织的修复。被 遗传改变以产生细胞因子的小神经胶质细胞还可用于移植，以治疗通道因血脑屏障被限制 的中枢神经系统中的传染病。神经胶质细胞还可产生由多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症 和脑癌引起的中风后神经组织再生以及脊髓损伤后再生的生长因子或生长因子抑制因子。 被诱导形成少突胶质细胞和星形胶质细胞的细胞，例如，可用于移植到脱髓鞘组织尤其是 脊髓中，在那里它们的功能是为周围神经组织加髓鞘。所述细胞还可用于细胞置换疗法和 /或基因疗法以治疗先天性神经退化障碍或贮积障碍例如粘多糖贮积症、脑白质营养不良 (球状细胞脑白质营养不良、卡纳文氏症（Canavan' s disease))、岩藻糖血症、GM2神经节 苷脂沉积症、尼曼-皮克病（Niemann-Pick)、圣菲利波综合征（Sanfilippo syndrome)、沃 尔曼氏病（Wolman' s disease)和泰-萨克斯病（Tay Sachs)。它们还可用于创伤性疾病 例如中风、中枢神经系统出血和中枢神经系统创伤；用于周围神经系统疾病例如脊髓损伤 或脊髓空洞症；用于视网膜疾病例如视网膜脱离、黄斑变性和其他退化性视网膜疾病，以及 糖尿病性视网膜病变。外胚层上皮细胞：细胞可用于细胞置换疗法和/或基因疗法中，以治 疗或缓解皮肤病例如脱发、皮肤缺损如皮肤烧伤和白化病的症状。上皮细胞可用于细胞置 换疗法和/或基因疗法中，以治疗或缓解若干器官病的症状。所述细胞可用于治疗或缓解 先天性肝脏疾病，例如，贮积病如粘多糖贮积症、脑白质营养不良、GM2神经节苷脂沉积症； 胆红素增加病变，例如克里格勒-纳贾尔综合征（Crigler-Najjar syndrome);氨病，例如 尿素循环的先天性障碍如鸟氨酸脱羧酶缺乏症、瓜氨酸血症和精氨酸琥珀酸尿症；氨基酸 和有机酸的先天性障碍，如苯丙酮尿症，遗传性酪氨酸血症和α抗胰蛋白酶缺乏症；以及 凝血障碍例如因子VIII和IX缺乏症。所述细胞还可用于治疗由病毒感染导致的获得性肝 病变。所述细胞还可用于体外，例如生成人工肝脏，产生凝血因子以及产生由肝脏上皮细胞 生成的蛋白或酶。所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因疗法，以治疗或缓解胆 病例如胆汁性肝硬化和胆道闭锁的症状。所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因 疗法，以治疗或缓解胰腺疾病例如胰腺闭锁、胰腺炎和α抗胰蛋白酶缺乏症的症状。此外， 当可得到胰腺上皮细胞、神经细胞时，可生成β细胞。这些细胞可用于糖尿病的治疗（皮 下植入或者胰腺内或肝脏内植入）。此外，所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因 疗法，以治疗或缓解肠道上皮病症例如肠道闭锁、炎性肠病、肠梗塞和肠切除的症状。细胞 可用于组织修复：细胞还可用于组织修复。可将细胞植入到骨中以增强所述修复过程，以强 化变弱的骨或重新覆盖关节。可将软骨细胞注射到关节中以重新覆盖关节软骨。Caplan等 人（美国专利5, 855, 619)描述了一种生物基质植入物，包括其中已加入间叶肝细胞的收缩 凝胶基质。所述植入物旨在修复组织缺陷，尤其是肌腱、韧带、半月板或肌肉的损伤。例如， 软骨可通过将软骨细胞加入到由例如胶原、合成聚乙醇酸纤维或合成聚乳酸纤维制成的多 孔、三维支架的周边区域而形成。发明人已经证明，本发明的细胞分化以形成软骨细胞，例 如，其可沉积在胶原、合成聚乙醇酸、合成聚乳酸或其他支架材料中或周围以提供植入物以 促进组织修复。
[0024] 根据本发明实施例的建立单克隆间充质干细胞的方法的有益效果如下：
[0025] 1.因具有相同的遗传背景，降低了其在用于动物体时的免疫原性；
[0026] 2.纯度极高、细胞基因组单一性；易于今后基因组的测序；
[0027] 3.不易分化或分化程度较非单克隆细胞低，易保持原有MSCs的特性与多功能分 化潜能；和
[0028] 4.可体外长期培养、大量扩增以满足临床需求，致瘤性低。
[0029] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1显示了根据本发明实施例的利用流式细胞仪分析经过转染的MSCs细胞中的 Nanog启动子转染效率；
[0031] 图2显示了根据本发明实施例的利用荧光显微镜观察经过转染的MSCs细胞中GFP 的表达；
[0032] 图3显示了根据本发明实施例的经过分选后培养于96孔板的单克隆MSCs的光学 显微镜观察图；以及
[0033] 图4显示了根据本发明实施例的利用荧光显微镜观察经过转染的MSCs细胞中 VMENTIN基因（4A)、a -SMA基因（4B)和CNN1基因（4C)的表达情况。

【具体实施方式】
[0034] 下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面的实施例，仅仅是为了说明本 发明，而不以任何方式限制本发明。另外，在下面实施例中所采用的试剂和材料也均是市售 可得的，如果未明确说明，则所采用的方法和条件，也均按照公知的方法和条件进行相关处 理。
[0035] 实施例1细胞分离和培养
[0036] 将分别来源于动物的不同组织，利用胶原酶进行消化，离心后，去除上清液后，将 收集的细胞用PBS洗涤2次后用完全培养基进行培养，MSCs贴壁迅速，24小时后进行换液， 去除其余悬浮的细胞，从而获得所有的贴壁细胞。其中完全培养基包括α-MEM培养液培 养，10%胎牛血清。
[0037] 实施例2细胞转染
[0038] 将新分离得到的MSC贴壁培养24小时，换液后继续培养，在转染前使用无抗生素 培养基培养，待细胞融合70%-80%，将含有Nanog启动子的质粒与对照质粒分别溶于50微升 无血清的Opti - MEM I培养液中，混合均匀。将适量脂质体溶于50微升无血清的Opti - MEM I培养液中，混合均匀。在室温下孵育5分钟。然后将上述两种溶液混合物混合(总体 积100微升)。轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟后，在24孔板中每孔加入100微升的复 合物以及适量培养基。在加完复合物4?6小时后将培养基更换为完全培养基，并将细胞 继续在37度5%C0 2培养箱中培养48个小时后，利用FACS测量转染效率，结果见图1，图2。
[0039] 从图1中的结果可以看出，对照组质粒显示出的转染效率为56. 8%，间充质干细胞 表达的阳性率为34. 4%。通过流式细胞仪检测，可以确认根据本发明的方法可以成功将含有 人NAN0G启动子序列转染进入细胞，且转染效率良好，可以用于后续实验。图2的显示了从 实施例1获得的细胞经转染人NAN0G启动子序列和GFP在荧光显微镜绿色偏光镜下的转染 效果结果。
[0040] 实施例3细胞分选
[0041] 利用胰酶消化离心后，用PBS将转染成功后的贴壁细胞从培养皿上转移下来，经 过清洗后，用FACS流式细胞仪在488纳米下氩激光下进行检测。利用Cell-Quest软件 (Weasel V2. 3. 1)对样品中的10, 000个细胞进行分析。
[0042] 将分选后的单个细胞采用上述完全培养基在96孔板中在37摄氏度5%C02条件下 进行培养，每3?5天换液一次，由观察可知早期单个克隆细胞生长较为缓慢，但一周后细 胞呈现集落群后，生长迅速，呈典型的间充质干细胞样生长，呈梭状、漩涡样、放射状生长， 结果见图3。
[0043] 实施例4免疫荧光
[0044] 将分化好的细胞培养于中文名为培养腔室玻片（B&D)。融合的细胞层用溶解在磷 酸缓冲液（PBS)的4%(体积/体积)多聚甲醛溶液在室温下进行固定15分钟，弃去多聚甲醛 溶液后经过清洗向细胞中加入溶解在PBS中的0. l%TritonlOOX并在室温下孵育10分钟以 便在细胞核中进行蛋白表达。细胞骨架蛋白用甲醇在-20摄氏度条件下固定5分钟。然后将 载有固定好的细胞的玻片分别与鼠抗人波形蛋白VIMENTIN抗体、鼠抗人α -平滑肌肌动蛋 白（α-SM)抗体、鼠抗人巢蛋白抗体、鼠抗人肌间线蛋白抗体、鼠抗人钙调理蛋白（CNN1) 抗体在室温下孵育1小时，分别倾去抗体后对玻片进行清洗后用对应的Alexa-448结合的 羊抗鼠、羊抗兔和鼠抗羊抗体继续孵育2分钟。染色后，用Vecta-shield+DAPI(Vector)进 行封片，并用Imager A1显微镜（Carl Zeiss)进行观察。由图4结果显示，间充质干细胞 中VMENTIN、a -SMA和CNN1蛋白的表达均为阳性，其中VMENTIN蛋白100%表达，其也可 作为MSCs蛋白表达的阳性对照。
[0045] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0046] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1. 一种分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括： A) 利用胶原酶对动物样本进行消化，以便分散所述动物样本中所包含的细胞，以便获 得包含干细胞的细胞混合物； B) 将编码报告蛋白的核酸分子引入所述细胞混合物的至少一部分细胞中，其中，所述 编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连，以便在间充质干细 胞中表达所述报告蛋白；以及 C) 利用FACS，分选获得表达所述报告蛋白的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞呈 单个细胞的形式。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物样本为来自选自肝脏组织、脂肪 组织、骨实质、肌肉、脐带血、脐带、胎盘、外周血、胰腺、肺脏、经血和牙髓的至少一种。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动物样本为来自胎儿肝脏组织及成 人骨髓。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将编码报告蛋白的核酸引入所述细胞混 合物的至少一部分细胞中包括： 利用液体培养基对所述细胞混合物进行培养； 将构建体引入所述培养获得的贴壁细胞中， 其中， 所述构建体包括： 编码报告蛋白的核酸分子；以及 间充质干细胞特异性启动子，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启 动子可操纵地相连。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为α -MEM培养基。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋 白、酶的至少一种。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞特异性启动子为人 NANOG启动子。
9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建体呈质粒、噬菌体、人工染色体、 粘粒、病毒的至少一种的形式。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对所得到的单个细胞形式的 间充质干细胞进行培养，以便获得干细胞单克隆集群。
11. 一种干细胞或其衍生物，所述干细胞是通过权利要求1-10任一项所述的方法制备 的。
12. 权利要求11所述的干细胞或其衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选 自下列的至少一种：血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、神经系统修复、膝 关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病、脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统 性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化。
13. -种药物组合物，其特征在于，包括： 权利要求11所述的干细胞或其衍生物；以及 药物上可以接受的赋形剂。
【文档编号】A61P7/00GK104232570SQ201310253266
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】张文炜 申请人:张文炜