靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属生物制药领域，具体涉及靶向特异性补体系统抑制剂,还包括靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。本发明通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如H因子（factor H）直接相连或利用柔性肽段（Gly4Ser）3等方式间接相连，通过基因工程等方法制备一种融合蛋白，最终达到靶向性抑制补体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。
【专利说明】靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和制药领域，具体涉及靶向特异性补体抑制剂的设计、制备 和临床应用。
【背景技术】
[0002] 补体系统是固有免疫的主要组成部分，也是获得性免疫的重要调节者，发挥着 重要的免疫监视作用，不仅可以清楚入侵的病原菌微生物和宿主细胞碎片，还可以协调 整个免疫和炎症过程（Ricklin D et al.，Nat Immunol2010;ll:785-797;Morgan BP et al.，Immunology letters2005;97:171-179)。补体可通过经典途径、替补途径及凝集素途 径激活，其发挥生理功能主要通过激活后形成的产物进行，包括C3b/iC3b沉积于被攻击细 胞膜表面，招募单核细胞等免疫效应细胞通过吞噬作用而清除靶细胞；C3a/C4a/C5a等过 敏毒素引起局部炎症；以及补体膜攻击复合物（Membrane Attack Complex, MAC,即C5b_9n) 在靶细胞膜表面形成孔洞而最终裂解靶细胞。在此过程中，为了防止补体激活后对正常宿 主细胞的"误伤"效应，机体在进化过程中形成了 10余种调控蛋白，包括存在于血液循环中 的 Cl-INH (Clinhibitor，Cl 抑制蛋白）、C4BP (C4binding protein，C4 结合蛋白）、factor I (I因子)、factor Η (Η因子)、S_protein (S蛋白)和Clusterin (簇集蛋白）;以及表达与 细胞膜表面的补体膜调控蛋白〇)35/0?1、0)46/]\0\0)55/1^?和0)59(211〇11，乂.，6〖31.，1116 0ncologist2008; 13:954-966)，以及近期发现的另一种补体膜调控蛋白CRIg (Helmy KY et al·，Cell. 2006; 124:915-927;Wiesmann C et al·，Nature, 2006, 444:217-220)，在补 体酶级联反应的不同阶段抑制补体的激活，使得补体系统在激活和抑制之间维持一种精妙 的平衡，机体处于健康状况。但是，这种平衡一旦被打破，人体的很多疾病的发生、发展和 治疗均与此密切相关，例如大量研究表明，补体系统的过度激活不同程度不同阶段参与其 他疾病的发生与发展，例如自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、系 统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病 (老年性痴呆)、哮喘、过敏、银屑病、重症肌无力、多发性硬化、克隆氏肠病等。因此，以补体 系统为治疗祀点的药物研发，包括补体系统抑制剂重新受到重视（Ricklin D et al.，Nat Immunol2010; 11:785-797),研发补体系统抑制剂，尤其是靶向性抑制剂具有巨大的社会和 经济价值。
[0003] 研发补体系统抑制剂在领域内经过了数十年的探索，包括与C3结合的蛋白质 Compastatin (Georgopoulos LJ，et al.，Mol Immunol, 2009;46:2911-7)以及抗 C5 的重 组单抗Eculizumab (依库珠，Soliris，由亚力兄制药公司Alexion Pharmaceuticals生产） (Rother RP et al·，Nat Biotechnol, 2007; 25:1256-1264),但仍然存在一些明显的不足。 Compastatin已经进入临床前期试验，但是由于抑制所有部位C3的功能而存在潜在的导 致感染的风险。另外，尽管依库珠已经成功用于治疗治疗阵发性睡眠性(夜间）血红蛋白尿 (Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, PNH)，但知识产权为国外拥有，价格异常昂贵， 使用一年的价格是409, 500美元，2009年，Soliris销售额为2. 95亿美元，2010年销售额 5. 41亿美元。PNH是一种后天获得性溶血性疾病，主要由于PIG-A基因的突变导致⑶55 和0)59这两种正常通过糖基磷肌酰肌醇（〖15^〇85^1卩11〇8卩1^1^(171;[1108；[1:01，6?1)锚定于红 细胞膜上的补体膜调控蛋白不再锚定于PNH患者的血细胞膜上，所以PNH患者的血细胞对 补体的攻击异常敏感，极易产生白细胞下降导致的感染、红细胞破裂造成的溶血，以及血小 板被激活，最终导致反复感染、溶血、血栓形成、肾功能衰竭、骨髓衰竭和肺动脉压升高等， 疾病进行性加重，在依库珠单抗出现之前基本无药可治，从而严重威胁患者的生命（Parker C et al·，Blood, 2005; 106:3699-3709)。依库珠的作用机理是与C5结合后，在补体级联反 应的末期抑制补体的激活，从而阻止MAC在血细胞膜上的沉积和对血细胞尤其是对红细胞 的裂解，临床上对PNH患者的治疗收到了较好的疗效，显著减少血栓形成，66%的患者在治 疗一年内不需再输血（Kelly RJ et al.，Blood，2011;117:6786-6792)。然而，理论上应用 依库珠单抗后PNH患者的病情仍然无法得到完全缓解，因为补体级联反应的C3水平仍然存 在激活，产生C3b/iC3b并沉积与血细胞表面，使这些血细胞被单核细胞吞噬，最终造成血 管外溶血（Risitano AM et al·，Blood, 2009; 113:4094-4100)，这也是依库珠单抗治疗并 不十分满意的原因。因此，在补体激活更早期的C3水平，而不是像依库珠单抗的末期C5水 平，阻止补体的激活，将有效同时阻止MAC介导的血管内和C3b/iC3b介导的血管外溶血，从 而产生更好的疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种靶向特异性补体抑制剂。
[0005] 本发明的另一个目的是提供上述靶向特异性补体抑制剂在制备抑制补体激活药 剂中的应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明经过数以千记的实验和反复的测试，发现CRIg可 以用于作为本发明靶向特异性补体抑制剂的基础。
[0007] CRIg最早发现表达于巨噬细胞膜表面的一种C3b/iC3b受体，结合后可吞噬病 原体或其他颗粒（Helmy KY et al.，Cell. 2006; 124:915-927)。进一步结构生物学研究 还发现CRIg可通过特异性识别C3b并抑制C3转换酶的激活，从而在补体级联反应的早 期即产生抑制效应一一这种抑制作用为针对补体的替补激活途径，但其抑制效果低于经 典的补体替补途径抑制剂factor Η ;同时，CRIg的功能位点位于胞外区（Wiesmann C et al.，Nature, 2006, 444:217-220)。查阅发现至今未有CRIg用于补体抑制的应用报道，更未 有利用其与C3b/iC3b结合的特性研发靶向性补体抑制剂的报道。
[0008] 本发明利用CRIg这两种独特的特性，克隆其胞外功能区基因并与其他补体调控 蛋白融合表达，制备成一种通过CRIg与C3b/iC3b特异性结合的靶向作用，把重组联接的 补体调控蛋白运送至局部补体激活部位，从而达到抑制补体激活，预防或治疗疾病的目的。 CRIg的胞外功能部位的基因序列见序列表的SEQ ID N09,氨基酸序列见序列表SEQ ID N010。另外，与CRIg相连的其他部分包括所有能抑制补体激活的成分，例如补体调控蛋白 Cl-INH、C4BP、factor I、factor H、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF 和CD59、甚至CRIg本身等的全长或部分序列，其中相连的方式包括直接相连，以及通过其 他物理、化学和生物等手段通过其他分子间接相连。
[0009] 本发明以CRIg功能性胞外区与fH功能区直接或通过柔性连接肽（SerlGly4) 3间 接相连为例，描述该重组蛋白CRIg-fH及CRIg-L-fH的靶向补体抑制效果。
[0010] 本发明提供了一种蛋白质，它编码具有抑制补体激活功能的蛋白，并且包含CRIg 和补体抑制剂的序列。
[0011] CRIg与不同的补体抑制剂，包括存在于血液循环中的Cl-INH (Clinhibitor，C1 抑制蛋白）、C4BP (C4binding protein，C4 结合蛋白）、factor I (I 因子）、factor Η (Η 因 子)、S-protein (S蛋白）和Clusterin (簇集蛋白）；以及表达与细胞膜表面的补体膜调控 蛋白⑶35/CR1、⑶46/MCP、⑶55/DAF和⑶59甚至CRIg本身，以及其他具有补体抑制功能的 物质进行连接。
[0012] CRIg与其他补体抑制剂的连接方式，包括：
[0013] (1) CRIg与其他补体抑制剂直接相连，两者之间没有任何其他连接物。
[0014] (2) CRIg与其他补体抑制剂通过生物方法连接。
[0015] (3) CRIg与其他补体抑制剂通过化学方法连接。
[0016] 例如，该蛋白质由CRIg和factor Η组成。
[0017] 在本发明的一个实施例中，该蛋白质由CRIg胞外区、factor Η以及两者间的连接 物组成。
[0018] 所述的补体抑制功能区可以是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、 Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全长。
[0019] 在本发明的另一个实施例中，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N02或者SEQ ID N04所示。
[0020] 本发明提供了编码上述蛋白质的核酸。
[0021] 较好的，其核苷酸编码序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
[0022] 本发明还提供了一种含上述核酸的载体。以CRIg-fH和CRIg- (Gly4Ser) 3 - fH 为例，该载体含有核酸的碱基序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
[0023] 本发明还提供了一种含上述核酸的细胞。
[0024] 本发明的蛋白质可以利用基因工程技术，连接CRIg蛋白质和factor Η蛋白质；
[0025] 所述的CRIg蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID Ν06所示；
[0026] 所述的factor Η蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N08所示。
[0027] 也可以按照蛋白质的序列依次连接氨基酸残基。
[0028] 本发明的核酸也可以利用基因工程技术，连接CRIg蛋白质和factor Η蛋白质的 编码序列；或者按照核酸的序列依次连接碱基。
[0029] 本发明提供了靶向特异性补体系统抑制剂，即上述蛋白质在制备抑制补体激活的 药物中的应用。也可以用于制备保护细胞免受补体攻击并提高红细胞压积的药物。
[0030] 本发明提供了上述蛋白质在制备保护阵发性夜间血红蛋白尿患者血细胞的药物 中的应用，也可用于制备其他疾病中使遭受补体攻击的细胞免受补体攻击的药物或者药 剂。
[0031] 另一方面，本发明提供了一种药物，所述药物的活性成分为上述蛋白质，即含有 CRIg和factor Η的功能域。
[0032] 例如，该药物是抑制补体激活的药物。
[0033] 又如，该药物产生含有氨基酸序列如SEQ ID Ν02或者SEQ ID Ν04所示的蛋白质。
[0034] 上述药物的给药方式包括：
[0035] (1)直接给药。
[0036] (2)通过能携带或表达该药物的载体系统给药。
[0037] 本发明通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向 作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如Η因子（factor H)直接或利用柔性肽段 (Gly4Ser) 3等方式相连，通过基因工程的方法制备一种融合蛋白，最终达到靶向性抑制补 体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1为CRIg-fH和CRIg-L-fH的表达与纯化。
[0039] 图2为CRIg-L-fH与C3活化和降解产物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的动力学 分析和结合力测定。
[0040] 图3为CRIg-fH与C3活化和降解产物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的动力学分 析和结合力测定。
[0041] 图4为CRIg-L-fH对补体替补途径诱导的七例PNH患者红细胞的溶血起保护作 用。
[0042] 图5为CRIg-L-fH对补体经典途径诱导的七例PNH患者红细胞的溶血起保护作 用。
[0043] 图6为CRIg-L-fH对Thy-ΙΝ大鼠肾炎引发的血清尿素氮升高病理症状的缓解作 用。
[0044] 图7为CRIg-L-fH对Thy-ΙΝ大鼠肾炎引发的血清肌酐升高病理症状的缓解作用。
[0045] 图8为CRIg-L-fH对Thy-ΙΝ大鼠肾炎引发的尿液总蛋白渗漏病理症状的缓解作 用。
[0046] 图9为CRIg-L-fH对Thy-ΙΝ大鼠肾炎引发的血尿病理症状的缓解作用。
[0047] 图10为免疫荧光检测各组大鼠肾脏冰冻切片的IgG、C3片段、MAC和CRIg-L-fH 的沉积。
[0048] 其中，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001 ;n=4。
【具体实施方式】
[0049] 实施例1
[0050] CRIg-fH及CRIg-L-fH蛋白表达载体的构建、真核表达和纯化
[0051] 1.仪器与材料：
[0052] Mastercycler pro-Eppendorf PCR 仪（德国 Eppendorf 公司），DK-8D 型电热恒温 水槽(上海精宏实验设备有限公司），IQ350凝胶成像系统(美国GE Healthcare公司），C02 细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司），FR-980A生物电泳图像分析系统(复日科技公 司）、BioRAD Mini protein Tera system (美国 BioRAD 公司）、NanoVue RNA/DNA 浓度 / 纯 度检测仪(德国IKA公司）
[0053] 2.实验方法：
[0054] 2. 1基因克隆和载体构建
[0055] Trizol法（invitrogen)提取人淋巴瘤U937细胞的总RNA，反转录为cDNA(promega reverse transcription kit)，PCR 扩增 CRIg 基因的胞外结构域（G19_K137);Trizol 法 提取人肝癌细胞系Η印3B细胞的总RNA，反转录后PCR扩增factorH基因的SCR1-5结构域 (E19-K323)。
[0056] 设计同时包含CRIg胞外结构域和factor H SCR1-5结构域以及linker序列 (L，（SeriGlyJs) (TCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGA)的引物，应用重叠 PCR (Overlapping PCR)的方法将CRIg胞外结构域基因和factorH SCR1-5基因连接起来， 插入到pHLsec真核表达载体中，双向测序鉴定插入序列，载体命名为pHLsec-CRIg-fH和 pHLsec-CRIg-L-fH。
[0057] CRIg 核酸序列（SEQ ID N05)
[0058] ATGGGGATCTTACTGGGCCTGCTACTCCTGGGGCACCTAACAGTGGACACTTATGGCCGTCCCATCCTG GAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCCTGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTA CACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCACCATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAG ACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGGTTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTG AGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGT GAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAACTCTCTGTCTCCAAGCCCACAGTGACAACTGGCAGCGGTTATG GCTTCACGGTGCCCCAGGGAATGAGGATTAGCCTTCAATGCCAGGCTCGGGGTTCTCCTCCCATCAGTTATATTTGG TATAAGCAACAGACTAATAACCAGGAACCCATCAAAGTAGCAACCCTAAGTACCTTACTCTTCAAGCCTGCGGTGAT AGCCGACTCAGGCTCCTATTTCTGCACTGCCAAGGGCCAGGTTGGCTCTGAGCAGCACAGCGACATTGTGAAGTTTG TGGTCAAAGACTCCTCAAAGCTACTCAAGACCAAGACTGAGGCACCTACAACCATGACATACCCCTTGAAAGCAACA TCTACAGTGAAGCAGTCCTGGGACTGGACCACTGACATGGATGGCTACCTTGGAGAGACCAGTGCTGGGCCAGGAAA GAGCCTGCCTGTCTTTGCCATCATCCTCATCATCTCCTTGTGCTGTATGGTGGTTTTTACCATGGCCTATATCATGC TCTGTCGGAAGACATCCCAACAAGAGCATGTCTACGAAGCAGCCAGGGCACATGCCAGAGAGGCCAACGACTCTGGA GAAACCATGAGGGTGGCCATCTTCGCAAGTGGCTGCTCCAGTGATGAGCCAACTTCCCAGAATCTGGGCAACAACTA CTCTGATGAGCCCTGCATAGGACAGGAGTACCAGATCATCGCCCAGATCAATGGCAACTACGCCCGCCTGCTGGACA CAGTTCCTCTGGATTATGAGTTTCTGGCCACTGAGGGCAAAAGTGTCTGTTAA
[0059] CRIg 蛋白序列（SEQ ID N〇6)
[0060] MGILLGLLLLGHLTVDTYGRPILEVPESVTGPffKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKffLVQRGSDPVTIFL RDSS⑶HIQQAKYQGRLHVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVT TGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHS DIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPVFAIILIISLCCMVVFT MAYIMLCRKTSQQEHVYEAARAHAREANDSGETMRVAIFASGCSSDEPTSQNLGNNYSDEPCIGQEYQIIAQINGNY ARLLDTVPLDYEFLATEGKSVC
[0061] Factor H 核酸序列（SEQ ID N07)
[0062] ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAA CTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTAT CTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTA ATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGA GGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTA CCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCAC CAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTA TGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACC AAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGG AGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCT GGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTT AAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATA CAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAA CATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTG TGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAG TACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAG GGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAA TGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTA TTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGAT GGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATAT CCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCC ATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCC ATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAA AGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACT TTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGG AATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAAT GAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCT GTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAA TTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCC CCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACA AGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATA AATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAA TTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAA TTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGT TCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAA ATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTT CTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGAC AGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATG CTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCC ATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAAT GGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGA ATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTAT CAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCA ATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAG TATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGT AGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAA CATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGG GATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCA AAAAGATAG
[0063] FactorH 蛋白序列（SEQ ID N〇8)
[0064] MRLLAKIICLMLffAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSffSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKG EWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKC LPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQ KIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYP ATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQD GWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSID IENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDT LDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNS VQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCI VEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILE EHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLC QENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCY MGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLP SFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSG ERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGN KRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLE YPTCAKR
[0065] CRIg胞外结构域
[0066] 核酸序列（357bps) (SEQ ID N09)
[0067] ggccgtcccatcctggaagtgccagagagtgtaacaggaccttggaaaggggatgtgaatcttccctgc acctatgaccccctgcaaggctacacccaagtcttggtgaagtggctggtacaacgtggctcagaccctgtcaccat ctttctacgtgactcttctggagaccatatccagcaggcaaagtaccagggccgcctgcatgtgagccacaaggttc caggagatgtatccctccaattgagcaccctggagatggatgaccggagccactacacgtgtgaagtcacctggcag actcctgatggcaaccaagtcgtgagagataagattactgagctccgtgtccagaaa
[0068] 蛋白序列（ll9aa) (SEQ ID N010)
[0069] GRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRLH VSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQK
[0070] FactorH SCR1-5 结构域
[0071] 核酸序列（9l5bp) (SEQ ID N011)
[0072] gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtctgaccaaaca tatccagaaggcacccaggctatctataaatgccgccctggatatagatctcttggaaatgtaataatggtatgcag gaagggagaatgggttgctcttaatccattaaggaaatgtcagaaaaggccctgtggacatcctggagatactcctt ttggtacttttacccttacaggaggaaatgtgtttgaatatggtgtaaaagctgtgtatacatgtaatgaggggtat caattgctaggtgagattaattaccgtgaatgtgacacagatggatggaccaatgatattcctatatgtgaagttgt gaagtgtttaccagtgacagcaccagagaatggaaaaattgtcagtagtgcaatggaaccagatcgggaataccatt ttggacaagcagtacggtttgtatgtaactcaggctacaagattgaaggagatgaagaaatgcattgttcagacgat ggtttttggagtaaagagaaaccaaagtgtgtggaaatttcatgcaaatccccagatgttataaatggatctcctat atctcagaagattatttataaggagaatgaacgatttcaatataaatgtaacatgggttatgaatacagtgaaagag gagatgctgtatgcactgaatctggatggcgtccgttgccttcatgtgaagaaaaatcatgtgataatccttatatt ccaaatggtgactactcacctttaaggattaaacacagaactggagatgaaatcacgtaccagtgtagaaatggttt ttatcctgcaacccggggaaatacagcaaaatgcacaagtactggctggatacctgctccgagatgtaccttgaaa
[0073] 蛋白序列（305aa) (SEQ ID N012)
[0074] EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCG HP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAM EPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKC NMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTST GWIPAPRCTLK
[0075] 1. 1真核蛋白表达系统的建立
[0076] 取对数生长期的293FT细胞，以每皿1. 2X107的细胞密度均匀铺在直径15cm的 细胞培养皿中，PEI法分别转染pHLsec-CRIg-fH和pHLsec-CRIg-L-Fh大抽质粒，在37°C， 5%C02培养箱中培养6小时后更换293表达培养基（invitrogen)，继续培养三天后收取细胞 上清，离心去除细胞及细胞碎片。
[0077] 1. 2蛋白亲和纯化、透析和蔗糖浓缩
[0078] 应用Ni2+柱亲和纯化的方法，将细胞上清中CRIg-fH和CRIg-L-fH纯化洗脱至洗 脱缓冲液中，转移至透析管中（Novagen)，透析法将缓冲液更换为PBS，蔗糖法吸水浓缩后 再用PBS透析。
[0079] 2.实验结果：
[0080] 通过上述方法应用真核系统诱导表达和纯化得到CRIg-fH和CRIg-L-fH两种融合 蛋白，PAGE电泳检测为单一条带（图1)，浓缩后浓度可达到1?2mg/ml。
[0081] 所涉及相关序列如下：
[0082] CRIg-fH 核酸序列（SEQ ID N01)
[0083] ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCC TGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCAC CATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGG TTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGG CAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAAGAAGATTGCAATGAACT TCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCT ATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAAT CCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGG AAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACC GTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCA GAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATG TAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAA AGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAG AATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGG ATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAA GGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACA GCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAATAA
[0084] CRIg-fH 蛋白序列（SEQ ID N02)
[0085] MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRL HVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPE GTQAIYKCRPGYRSLGNVMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLL GEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFW SKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNG DYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop
[0086] CRIg-L-fH 核酸序列（SEQ ID N03)
[0087] ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCC TGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCAC CATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGG TTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGG CAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAATCTGGTGGCGGTGGCTC CGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAG GTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGA AATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGG ACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGT ATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGAT ATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGA ACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAG AAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGAT GTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGG TTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAAT CATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACG TACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGC TCCGAGATGTACCTTGAAATAA
[0088] CRIg-L-fH 蛋白序列（SEQ ID N04)
[0089] MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRL HVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKSGGGGSGGGGSGGGGEDCNELPPRRN TEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEY GVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYK IE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLP SCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop
[0090] 实施例2CRIg-fH及CRIg-L-fH与C3活化和降解片段相互作用的动力学分析和亲 和力测定
[0091] 1.仪器与材料：
[0092] Biacore T200 (GE Healthcare)、Series S Sensor Chip NTA、CRIg-L-fH 蛋白溶 液、C3 活化和降解的蛋白组分（C3b、iC3b、C3c、C3d, Complement Technology)、HBS_N 溶液 (GE Healthcare)
[0093] 2.实验方法
[0094] 表达纯化的CRIg-L-fH用HBS-N running buffer稀释为0. 2ug/ml作为配体偶联 在NTA芯片上，C3fragments以一系列浓度梯度稀释(如图所示）作为流动的分析物，应用 Biacore T200仪器测定动力学曲线并经过Biacore T200Software v2. 02分析。亲和常数、 解离常数和平衡解离常数如表1所示。
[0095] 表 1
[0096]
【权利要求】
1. 一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有靶向抑制补体激活的功能，并且该蛋白质的 氨基酸序列 (a) 含有CRIg胞外功能区和补体抑制功能区； 或者 (b) 由CRIg胞外功能区、补体抑制功能区以及两者间的连接物组成； 上述补体抑制功能区是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、 CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全长。
2. 如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N02或 者SEQ ID N04所示。
3. -种核酸，其特征在于，该核酸序列编码权利要求1所述的蛋白质。
4. 如权利要求3所述的核酸，其特征在于，该核酸的碱基序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
5. -种载体，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸。
6. 权利要求1所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，利用基因工程技术，连接CRIg胞 外区、补体抑制功能区的蛋白质多肽； 所述的CRIg胞外区蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N010所示； 所述的补体抑制功能区是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、 CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全长。
7. 权利要求1所述的蛋白质在制备靶向抑制补体激活的药物中的用途。
8. 权利要求1所述的蛋白质在制备保护阵发性夜间血红蛋白尿患者血细胞或其他疾 病中遭受补体攻击的细胞免受补体攻击的药物中的用途。
9. 一种药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1所述的蛋白质。
10. 如权利要求9所述的药物，其特征在于，该药物是针剂。
【文档编号】A61K38/17GK104231085SQ201410114646
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】胡维国, 乔倩, 张鑫 申请人:复旦大学附属肿瘤医院