一种细胞核靶向生物光子诊疗剂及其制备方法

一种细胞核靶向生物光子诊疗剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞核靶向生物光子诊疗剂及其制备方法，细胞核靶向生物光子诊疗剂包括：钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、包裹于所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒外表面的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层、包裹于所述第一实心氧化硅层外表面的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层、以及共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的细胞核靶向配体，其中，所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够吸收所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂；和/或所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够催化X射线辐射分解水而产生活性氧自由基的光敏剂。
【专利说明】一种细胞核靶向生物光子诊疗剂及其制备方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞核靶向生物光子诊疗剂的制备，属于纳米生物医学领域。具体说，这种纳米诊疗剂是一种尺寸在40nm左右的核/壳结构。其内核钆掺杂上转换荧光颗粒可以实现针对恶性肿瘤的磁共振/上转换发光双模式影像诊断；两层实心氧化硅分别装载光敏剂二羟基硅酞箐SPCD和具有放疗增敏功效的光敏剂原卟啉ΡρΙΧ，从而实现光动力治疗/放疗协同高效治疗，将有望达到最佳的生物光子治疗的效果。

【背景技术】
[0002]目前，临床上普遍采用化疗治疗癌症，其效果很不明显，主要原因在于大多数肿瘤具有多药耐药性，从而严重降低化疗的效果。此外，化疗无法实现精确定位治疗，容易造成巨大的全身毒副作用。因此，发展更为高效的精确定位治疗手段显得尤为重要。随着纳米科学技术的发展，基于光动力学治疗和放疗的生物光子治疗技术应运而生，其主要是利用光和高能X射线精确定位杀死肿瘤细胞，从而达到高效抑制肿瘤生长的目的。然而目前临床上所用的生物光子治疗手段通常以单一的光动力学治疗或者单一的放疗为主，尚未将这两种治疗模式结合起来使用。此外，考虑到要想真正杀死癌细胞，必须先得破坏细胞核内的DNA，所以，发展基于细胞核靶向的生物光子治疗技术，将有望大幅度提高治疗效果，同时尽可能减小毒副作用。
[0003]高效的治疗离不开精确的诊断。只有先利用精确的诊断技术定位肿瘤，才可以及早实施高效治疗。癌症的早期诊断大多采用影像技术(如:发光、PET、CT扫描、磁共振(MRI)成像等)寻找可疑的病灶区，然而目前临床采用的多是单一成像模式，这无疑存在很多缺陷，导致诊断效果较差，诊断出的癌症患者多数属于中晚期，错过了有效治疗的时期。CT和MRI成像具有很高的空间分辨率，但灵敏度较低；而PET和发光成像与之相反，具有很高的灵敏度高，但空间分辨率较低。因此，亟待开发一种多模式成像探针，整合不同成像模式之间的优势，实现针对癌症早期的高效诊断，以便患者及早高效治疗。近年来发展的上转换荧光纳米颗粒，由于具有生物毒性低、穿透深度大、自发荧光少、信噪比高等优点，被广泛认为是具有良好应用前景的新型上转换荧光探针。此外，掺杂钆离子又可以同时引入T1-MRI加权成像，因此，钆掺杂上转换荧光纳米颗粒可以作为一种新型的磁共振/上转换发光双模式成像探针，同时具有较高的空间分辨率和灵敏度，有助于精准定位肿瘤的位置。


【发明内容】

[0004]基于当前严峻的癌症形势以及未来纳米生物医学发展的趋势，本发明的目的是发展一种基于细胞核靶向的生物光子诊疗技术，克服目前癌症诊治领域中出现的成像模式单一、治疗效果差、靶向输运效率低等缺点，以实现针对恶性肿瘤细胞核的磁共振/上转换发光双模式精确诊断以及光动力学治疗/放疗协同治疗技术，有望达到最佳的生物光子诊疗效果。
[0005]在此，一方面，本发明提供一种细胞核靶向生物光子诊疗剂，包括:钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、包裹于所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒外表面的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层、包裹于所述第一实心氧化硅层外表面的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层、以及共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的细胞核靶向配体，其中，
所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够吸收所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂；和/或
所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够催化X射线辐射分解水而产生活性氧自由基的光敏剂。
[0006]本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂中，内核是钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提闻癌症的确诊率。
[0007]本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂中，通过两层实心氧化硅分别装载第一光敏剂和第二光敏剂，第一光敏剂和第二光敏剂中的至少一种是能够吸收所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂，因此可以提高光动力学治疗的效果。另外，第一光敏剂和第二光敏剂中的至少一种是能够催化X射线辐射分解水而产生活性氧自由基的光敏剂，因此可以增强放疗。
[0008]本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂中，嫁接于最外层的表面的细胞核靶向配体赋予其核靶向输运功能，可以使该生物光子诊疗剂直接在细胞核内产生大量的活性氧自由基，从而大幅度提闻光动力学治疗/放疗协同治疗的效果，，有效抑制耐放射肿瘤(例如人纤维肉瘤HT-1080)的生长。
[0009]因此，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂可以实现针对恶性肿瘤的磁共振/上转换发光双模式影像诊断，同时实现光动力治疗/放疗协同高效治疗，有望达到最佳的生物光子治疗的效果。
[0010]较佳地，所述细胞核靶向生物光子诊疗剂还包括共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的聚乙二醇。通过嫁接聚乙二醇，可以提高细胞核靶向生物光子诊疗剂的生物相容性，降低毒副作用并且提高其血液循环性能，促进其在肿瘤组织中的分布。
[0011]较佳地，所述第一光敏剂为二羟基硅酞菁和/或亚甲基蓝，所述第二光敏剂为原卟啉、血卟啉、和/或光卟啉。
[0012]较佳地，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd，粒径为15?19nm。其在980nm近红外光激发下，不仅可以发出可见光(红光、绿光和蓝光)，还可以发出紫外光和SOOnm近红外光，用于发光成像；此外，钆离子的引入又可以实现T1-MRI加权成像。
[0013]较佳地，所述细胞核靶向配体为TAT多肽、SV40T抗原、和/或腺病毒。
[0014]较佳地，所述细胞核靶向生物光子诊疗剂的整体尺寸为40?45nm。这样，可以使细胞核靶向生物光子诊疗剂能够高效地穿越细胞核核膜上的核孔，进入细胞核；此外，还可以减少免疫系统(RES)的吞噬。
[0015]另一方面，本发明提供上述细胞核靶向生物光子诊疗剂的制备方法，包括以下步骤:
(I)在采用反微乳液法对疏水性钆掺杂上转换荧光纳米颗粒进行实心氧化硅包裹的过程中引入第一光敏剂，从而在所述礼掺杂上转换突光纳米颗粒的外表面包裹第一光敏剂掺杂的第一实心氧化娃层；
(2)在采用水相再生长法对所得的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层进行实心氧化娃包裹的过程中引入第二光敏剂，从而在所述第一光敏剂掺杂的第一实心氧化娃层的外表面包裹第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层；以及
(3)在所得的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的外表面嫁接细胞核靶向配体。
[0016]本发明的制备方法可以实现各层厚度的可控，使整体尺寸可以控制在40nm左右，而且合成工艺简单易行、制备成本低、效率高。所制得的材料具有非常好的分散性、稳定性以及生物相容性，具有重要的研究意义和应用前景。
[0017]较佳地，所述制备方法还包括步骤(4):在所述第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的外表面嫁接聚乙二醇。
[0018]较佳地，步骤(2)中，所述第二光敏剂预先通过末端带氨基的硅烷偶联剂进行氨基功能化。
[0019]较佳地,步骤⑵中，反应溶剂为水/氨水/乙醇,三者的体积比为1:1:4。
[0020]本发明实现了钆掺杂上转换荧光纳米颗粒与两种光敏剂(例如SPCD/PpIX)的高效复合，合成了一种新型的生物光子诊疗剂，并且将整体尺寸控制在40nm左右，保证了良好的分散性和稳定性。通过嫁接聚合物PEG以及细胞核靶向配体(例如TAT)，这种新型的细胞核靶向生物光子诊疗剂，既可以实现磁共振/上转换荧光双模式精确诊断，又可以靶向输运至细胞核内，直接在细胞核内产生大量的活性氧自由基，高效破坏DNA，从而大幅度提高光动力治疗/放疗协同治疗的效果，有望为癌症早期的精确诊断与原位治疗提供更好、更有效的方案。

【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的制备方法的一个示例的流程图；
图2为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的一个示例的合成示意图；
图3为(a)本发明的生物光子诊疗剂在近红外光(NIR)和X射线(X-Ray)照射下产生活性氧自由基的示意图，以及(b)内核UCNPs在近红外光照射下的发射光谱与光敏剂SPCD/PpIX的吸收光谱的重叠图；
图4为细胞核靶向生物光子诊疗剂的合成过程中每步产物的TEM照片，其中:(a)UCNPs ； (b)UCSs ； (c)UCSPs ；
图5为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT进细胞核的(a)示意图，(b) 2D共聚焦成像图，(C)生物电镜图，以及(d)3D共聚焦成像图，图中，Cytoplasm表示细胞质，Nucleus表示细胞核；
图6为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内后HT-1080肿瘤的MRI成像图；
图7为细胞核靶向生物光子治疗技术的(a)示意图及(b)其在细胞水平上的治疗效果的评价，图中，Cytoplasm表示细胞质,Nucleus表示细胞核,X-Ray表示X射线，NIR表示近红外光；
图8为HT-1080癌细胞经过不同模式治疗之后DNA损伤的彗星实验表征:(a)control(对照)，(b)UCSPs-PEG, (c)UCSPs-PEG+RT(放疗)，(d)UCSPs_PEG+NIR(近红外光)，(e)UCSPs-PEG+RT+NIR, (f)RT, (g)UCSPs-PEG/TAT, (h)UCSPs-PEG/TAT+RT, (i)UCSPs-PEG/TAT+NIR, (j)UCSPs-PEG/TAT+RT+NIR ；
图9为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂在活体水平上的治疗效果的评价:(a)荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后半个月内肿瘤体积的变化曲线；(b)荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后第15天的肿瘤相对体积；
图10为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注射小鼠体内30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。

【具体实施方式】
[0022]以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0023]本发明一方面提供一种细胞核靶向生物光子诊疗剂。图2为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的一个示例的合成示意图，参见图2中的终产物UCSPs-PEG/TAT，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂为无空腔的核/壳结构，包括:作为内核的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)、包裹于内核的外表面的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层、包裹于所述第一实心氧化硅层外表面的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层、以及共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的细胞核靶向配体(在图2的示例中为TAT)。另外，优选地，还包括共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的聚乙二醇(PEG)，可以提高细胞核靶向生物光子诊疗剂的生物相容性，降低毒副作用并且提高其血液循环性能，促进其在肿瘤组织中的分布。外表面修饰上聚合物PEG以及细胞核靶向配体(例如TAT)，有利于直接靶向进入细胞核。
[0024]本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂中，内核是具有钆掺杂上转换发光纳米颗粒UCNPs，在980nm近红外光激发下，不仅可以发出可见光(红光、绿光和蓝光)，还可以发出紫外光和SOOnm近红外光，用于发光成像；此外，钆离子的引入又可以实现Tl-MRI加权成像。因此，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。钆掺杂上转换发光纳米颗粒包括但不限于NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd。另外，钆掺杂上转换发光纳米颗粒的粒径可为15?19nm,例如19nm左右。
[0025]在内核的表面包裹有第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层，在第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层的外表面包裹有第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层。第一实心氧化硅层的厚度可为5?7nm。第二实心氧化娃层的厚度可为4?6nm。其中,所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种可为能够吸收所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂，从而实现高效的光动力学治疗。也可以是，所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种可为能够催化X射线辐射分解水而产生活性氧自由基的光敏剂，从而实现高效的放疗。例如，所述第一光敏剂包括但不限于二羟基硅酞菁(SP⑶)、亚甲基蓝，所述第二光敏剂包括但不限于原卟啉(ΡρΙΧ)、血卟啉、光卟啉。
[0026]在一个优选的示例中，第一光敏剂为SP⑶、第二光敏剂为ΡρΙΧ。光敏剂SP⑶和PpIX均可以吸收内核UCNPs在近红外光激发下所发出的可见光，产生大量的单线态氧，从而实现高效的光动力学治疗。光敏剂PpIX可以作为一种放疗增敏，催化X射线辐射分解水，产生大量的活性氧自由基，从而实现高效的放疗。通过将光敏剂SPCD与放疗增敏剂PpIX复合于同一体系中，可以实现光动力学治疗与放疗的协同作用。相较于在同一氧化硅层中同时掺杂SP⑶和ΡρΙΧ，通过两层实心氧化硅分别装载光敏剂SP⑶和PpIX既可以提高近红外光以及X射线的利用效率，又可以避免SP⑶与PpIX之间的相互作用，提高材料的分散性和稳定性。
[0027]图4中的(C)示出本发明一个示例的细胞核靶向生物光子诊疗剂的TEM照片，由该图可知，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的整体尺寸为40?45nm，例如为40nm左右。
[0028]第二实心氧化硅层的外表面嫁接有细胞核靶向配体，其包括但不限于TAT多肽、SV40T抗原、腺病毒等，从而这种40nm左右的探针可以高效地穿越细胞核的核孔，靶向进入细胞核。因此，光敏剂(例如SP⑶和PpIX)可以被高效输运至细胞核内，在近红外光和高能X射线的照射下，直接在细胞核内产生大量的活性氧自由基，高效破坏DNA，大幅度提高光动力学治疗/放疗协同治疗的效果。
[0029]图3中的(a)示出本发明的生物光子诊疗剂在近红外光和X射线照射下产生活性氧自由基的示意图，(b)示出内核UCNPs在近红外光照射下的发射光谱与光敏剂SPCD/PpIX的吸收光谱的重叠图，由图2可知，光敏剂SP⑶和PpIX可以吸收近红外光照射下内核UCNPs发出的可见光，产生单线态氧，增强光动力学治疗；同时PpIX又可以吸收高能X射线，产生大量活性氧自由基，增强放疗。
[0030]图5为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT进细胞核的(a)示意图，(b) 2D共聚焦成像图，(c)生物电镜图，以及(d) 3D共聚焦成像图。从图中可以看出，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂与癌细胞共培养后，发现细胞核内出现了明显的上转换荧光信号，证明了其具有优异的细胞核靶向功能。
[0031]图6为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内后HT-1080肿瘤的MRI成像图。从图中可以看出，本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂具有T1-MRI加权成像功能，且随着时间的延长，肿瘤区域的MRI信号强度逐渐增强，从而有利于精确定位肿瘤的位置。
[0032]图7为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的治疗肿瘤的(a)示意图及(b)其在细胞水平上的治疗效果的评价。从图中可以看出，相比于其他治疗模式而言，细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT在近红外光和高能X射线照射下，使HT-1080癌细胞的存活率降到了最低值，达到了最佳的治疗效率。
[0033]图8为HT-1080癌细胞经过不同模式治疗之后DNA损伤的彗星实验表征:(a)control(对照)，(b)UCSPs-PEG, (c)UCSPs-PEG+RT(放疗)，(d)UCSPs_PEG+NIR(近红外光)，(e)UCSPs-PEG+RT+NIR, (f)RT, (g)UCSPs-PEG/TAT, (h)UCSPs-PEG/TAT+RT, (i)UCSPs-PEG/TAT+NIR, (j)UCSPs-PEG/TAT+RT+NIR。从图中可以看出，相比于其他治疗模式而言，细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT在近红外光和高能X射线照射下，呈现出最为明显的彗星拖尾现象，造成最显著的DNA损伤，达到了最佳的治疗效率。
[0034]图9为本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂在活体水平上的治疗效果的评价:(a)荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后半个月内肿瘤体积的变化曲线；(b)荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后第15天的肿瘤相对体积。从图中可知，将细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，在近红外光和高能X射线照射的共同照射下，肿瘤明显变小，达到最佳的治疗效果。
[0035]图10为细胞核靶向生物光子诊疗剂UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注射小鼠体内30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。可以发现，UCSPs-PEG或UCSPs-PEG/TAT注入小鼠体内后，并没有对小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)造成明显损伤，说明本发明的纳米诊疗剂对正常组织没有造成明显的毒副作用，具有良好的生物相容性。
[0036]本发明还提供上述细胞核靶向生物光子诊疗剂的制备方法。图1示出制备方法的一个示例的流程图；图2示出本发明的细胞核靶向生物光子诊疗剂的一个示例的合成示意图。参见图1、2，本发明的制备方法可以包括:合成钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核、在内核表面包裹第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层、在第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层的外表面包裹第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层、以及在第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的外表面嫁接细胞核靶向配体和PEG。其中第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层的制备可以是在采用反微乳液法对疏水性钆掺杂上转换荧光纳米颗粒进行实心氧化硅包裹的过程中引入第一光敏剂。第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的制备可以是在采用水相再生长法对所得的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层进行实心氧化硅包裹的过程中引入第二光敏剂。以下，以UCSPs-PEG/TAT为例，具体说明本发明的制备方法，步骤如下。
[0037](I)内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒(UCNPs)的制备:首先，采用高温热分解法，制备上转换荧光纳米颗粒NaYF4:Yb/Er/Tm。即按照各种稀土离子掺杂的比例，称取相应的稀土离子氯化物作为前驱体。然后以氩气作为保护气，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌，加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液后，接着搅拌(至少2小时，以使油酸前驱体与氢氧化钠和氟化铵充分混合)，甲醇除去后，升温至280?290度，进行高温热解反应1.5h。冷却至室温后，离心收集样品，分散在环己烷溶液中。此处以高温热分解法为例，但应理解，本发明并不限定内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒的制备，只要是能制得内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒的方法均可。
[0038](2)包裹第一层实心氧化硅的过程中引入SP⑶:采用反微乳液法，以C0-520作为表面活性剂，少量氨水作为催化剂，使用注射泵将稀释后的硅源TE0S，匀速加入到内核UCNPs/SPCD的环己烷溶液体系中，反应36h后，滴加甲醇破坏反微乳液体系，随后离心收集样品UCSs，最后分散在去离子水中。通过采用反微乳液法，可以实现厚度可控的实心氧化硅层的可控制备。但应理解，实心氧化硅层的包裹方法不限于此，也可以采用其他公知的方法。
[0039](3)包裹第二层实心氧化硅中引入PpIX:采用水相再生长法，将UCSs与PpIX加入到体积比为1:1:4的水/氨水/乙醇溶液体系中，使用注射泵匀速地往体系中注入硅源TEOS,反应24h后，离心收集样品UCSPs。
[0040](4)嫁接聚合物PEG:利用硅羟基键结合的原理，将UCSPs与PEG硅烷在去离子水中原位搅拌24h后，聚合物PEG通过共价键结合的形式嫁接于实心氧化硅层的外表面，离心收集样品UCSPs-PEG。
[0041](5)嫁接细胞核靶向配体TAT:首先利用氨基羧基结合反应，对TAT进行氨基硅烷修饰；然后利用硅羟基键结合的原理，将TAT通过共价键结合的形式嫁接于实心氧化硅层的外表面，充分反应后，离心收集样品UCSPs-PEG/TAT。
[0042]图4为细胞核靶向生物光子诊疗剂的合成过程中每步产物的TEM照片。(a)UCNPs ；(b)UCSs ; (c)UCSPs。从图中可以看出，每步合成的产物均呈现规则均一的球形，且具有非常好的分散性和稳定性，便于后续的生物学效应研究。
[0043]本发明提供了一种尺寸在40nm左右的细胞核靶向的生物光子诊疗剂，用于实现针对肿瘤细胞核的高效的光动力学治疗/放疗协同治疗，具有以下优点:(I)钆掺杂上转换发光纳米颗粒UCNPs (NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd)作为内核，既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis,NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。(2)通过两层实心氧化硅分别装载光敏剂SP⑶和ΡρΙΧ，有望提高光动力学治疗的效果。(3)光敏剂PpIX还可以作为一种放疗增敏剂，催化X射线辐射分解水，产生大量的活性氧自由基，增强放疗。(4)细胞核靶向输运技术可以使该生物光子诊疗剂直接在细胞核内产生大量的活性氧自由基，从而大幅度提高光动力学治疗/放疗协同治疗的效果。此外，本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，在纳米生物医学领域具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
[0044]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0045]实施例1、高温热分解法制备上转换荧光纳米颗粒NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd
1.稀土氯化物的准备。分别称取 1.28mmol(388.3008mg)YCl3-6H20，0.36mmol (139.4964mg) YbCl3-6H20, 0.04mmol (15.2684mg) ErCl3-6H20, 0.02mmol (5.5087mg)TmCl3,0.3mmol (79.083mg)GdCl3_6H20。这些粉末放置于同一个样品瓶中，然后用4mL去离子水溶解，转入10mL三口烧瓶中；
2.向三口瓶中加入15mL油酸，30mL十八烯，室温下搅拌lh。然后开始通5min氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程。先升温到80度，保持Ih或者更长时间(将自由水除尽)；随后升到120度，保持Ih ;然后升到156度左右，保持lh，获得黄色澄清液。停止加热，让体系自然降温至室温；
3.恥0!1(上海凌锋)-20011^，NH4F(Sigma)-296.3mg，用1mL甲醇溶解，超声加速分散。然后小心加入体系中。室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成。期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
4.2h后，体系开始进入除甲醇环节。同样是缓慢进行。先通5min氩气，然后升温到50度，Ih ;80?100度，lh。直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完。也可以升到120度，保持Ih ;确保甲醇基本去除干净；
5.甲醇除完之后。将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在280度左右，并保持1.5h。自然降至室温；
6.清洗过程:首先，向体系中加入20mL无水乙醇,搅拌30min。然后分装到两个50mL离心管中，用11000r/min，离心1min ;收集到略带黄色的产物(第一次)。随后，各加入5?1mL环己烷，小心摇晃，并超声，可以发现产物迅速溶解，得到浑浊溶液，然后加入15mL无水乙醇，超声约5min，离心收集(第二次)。重复清洗3?5次。最后产物用20mL环己烷分散，获得10mM内核。产物的TEM图参见图4中的(a)，可以看出其粒径为19nm左右。
[0046]实施例2、UCNPs外表面包裹第一层SP⑶负载的实心氧化硅UCSs
采用反微乳液法，实现实心氧化硅的包裹。ImL NP-5加入20mL环己烷中，磁力搅拌40mino 1.5mL 10mM UCNPs的环己烷溶液加入到NP-5/环己烷体系中，无色透明，密封搅拌3h。0.14mL 30%氨水逐滴加入混合液，密封搅拌2h后加入2.5mg SPCD。0.18mLTE0S溶于Iml环己烷，以lmL/h的速率引入体系中。36h后，加入甲醇破坏反微乳液体系，搅拌30min后，离心收集，整个过程用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后分散在5mL去离子水中。产物的TEM图参见图4中的(b)。
[0047]实施例3、UCSs外表面包裹第二层PpIX负载的实心氧化硅UCSPs
a.原卟啉PpIX的氨基硅烷功能化PpIX_NH2:将 25.6mg EDC, 17.6mg NHS 和 15mg PpIX溶解于6mL去离子水中，搅拌5分钟后，加入45 μ L APTES，继续反应24h后备用；
b.通过水相再生长法包裹第二层实心氧化硅:将上述样品加入到体积比为1:1:4的水/氨水/乙醇反应体系中，密封搅拌0.5h后加入ImL上述PpIX-NH2的去离子水溶液，0.1mL的TEOS溶于0.9mL乙醇以0.2mL/h的速率引入体系中。反应24h后用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后分散在1mL去离子水中。产物的TEM图参见图4中的(c)。
[0048]实施例4、UCSPs外表面嫁聚合物PEG和细胞核靶向配体TAT，即UCSPs-PEG/TAT
a.通过共价键嫁接聚合物PEG:往5mL上述制备UCSPs的去离子水溶液中加入75 μ LPEG硅烷，继续反应24h后备用；
b.通过共价键嫁接核靶向配体TAT:将38mg EDC, 57mg NHS和200 μ g TAT溶解于8mL去离子水中，搅拌5分钟后，加入45μ L APTES，继续反应24h。然后逐滴加入5mL UCSPs-PEG的去离子水溶液，继续反应24h后，用去离子水清洗三遍，最后，将产物UCSPs-PEG/TAT分散在5mL去离子水中。
[0049]实施例5、细胞核靶向生物光子诊疗剂的磁共振/上转换荧光双模式成像性能
体外表征:将一定浓度(400 μ g/mL)的UCSPs-PEG/TAT与HT-1080癌细胞共培养24h后，然后用DAPI染色，进行共聚焦成像实验，并且用生物电镜进行观察，结果见图5 ；
体内表征:将UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，测量肿瘤区域的磁共振信号强度变化，结果见图6。
[0050]实施例6、细胞核靶向生物光子治疗技术表征
体外表征:将UCSPs-PEG/TAT与HT-1080癌细胞共培养后，分别施加5Gy的X射线的照射和(或)1.5ff/cm2的近红外光照射，观察各种治疗模式下细胞的存活率，结果见图7、8 ；体内表征:将UCSPs-PEG/TAT尾静脉注入荷瘤小鼠体内，Ih后进行6Gy的X射线照射和1.5ff/cm2的近红外光照射，每隔一天测量肿瘤的体积，结果见图9。
[0051]实施例7、细胞核靶向生物光子诊疗剂的生物安全性评价
将UCSPs-PEG/TAT通过尾静脉注入小鼠体内，30天后解剖出主要的器官(心、肝、脾、肺、肾)进行生理组织切片测试，测试结果见图10。
【权利要求】
1.一种细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，包括:钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、包裹于所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒外表面的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层、包裹于所述第一实心氧化硅层外表面的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层、以及共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的细胞核靶向配体，其中， 所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够吸收所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂；和/或 所述第一光敏剂和所述第二光敏剂中的至少一种是能够催化X射线辐射分解水而产生活性氧自由基的光敏剂。
2.根据权利要求1所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，还包括共价嫁接于所述第二实心氧化硅层外表面的聚乙二醇。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，所述第一光敏剂为二羟基硅酞菁和/或亚甲基蓝，所述第二光敏剂为原卟啉、血卟啉、和/或光卟啉。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4:Yb/Er/Tm/Gd，粒径为15?19nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，所述细胞核靶向配体为TAT多肽、SV40T抗原、和/或腺病毒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂，其特征在于，所述细胞核靶向生物光子诊疗剂的整体尺寸为40?45nm。
7.—种权利要求1至6中任一项所述的细胞核靶向生物光子诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)在采用反微乳液法对疏水性钆掺杂上转换荧光纳米颗粒进行实心氧化硅包裹的过程中引入第一光敏剂，从而在所述礼掺杂上转换突光纳米颗粒的外表面包裹第一光敏剂掺杂的第一实心氧化娃层； (2)在采用水相再生长法对所得的第一光敏剂掺杂的第一实心氧化硅层进行实心氧化娃包裹的过程中引入第二光敏剂，从而在所述第一光敏剂掺杂的第一实心氧化娃层的外表面包裹第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层；以及 (3)在所得的第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的外表面嫁接细胞核靶向配体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤(4):在所述第二光敏剂掺杂的第二实心氧化硅层的外表面嫁接聚乙二醇。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二光敏剂预先通过末端带氨基的硅烷偶联剂进行氨基功能化。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应溶剂为水/氨水/乙醇，三者的体积比为1:1:4。
【文档编号】A61K49/00GK104383539SQ201410587266
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】范文培, 步文博, 施剑林 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所