以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤dna疫苗及病毒载体疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体VR-S8和VR-MS、重组腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重组痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
【专利说明】以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫 苗
[0001] 本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年12月4日，申请号为 200910252427. X，名称为"以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗"。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA 载体VR-S8和VR-MS、重组腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重组痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗 和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
【背景技术】
[0003] 生存素（Survivin)是抑制凋亡蛋白（IAP)家族成员，具有抗凋亡和调控细胞分裂 的双重功能，广泛表达于各种胚胎组织和癌细胞中，但在正常终末分化细胞中不表达。这些 特点使生存素成为肿瘤发生，发展和治疗等领域中的一个新靶点。
[0004] 目前的研宄表明生存素在肿瘤基因治疗中具有潜在价值：它的肿瘤特异性表达， 及其与预后不良、药物抗性和病人生存期缩短等呈正相关。针对生存素及其突变体等进行 的肿瘤免疫治疗已成为人们关注的热点。目前国内外策略有（参见Li, F.et al.，2006; Li, F.，2003 ;Altieri，D. C.，2008) : (1)利用生存素启动子的肿瘤特异性表达进行的肿瘤 革巴向基因治疗；（2)针对生存素本身的治疗策略：a)生存素的反义或全长的cDNA或反义核 苷酸表达载体策略，比较适合生存素的功能研宄和前临床研宄，但用全长的生存素可能有 潜在的危险；b)生存素功能阴性突变体（dominant negative mutant，DNM)策略，主要是 SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不适用于直接的癌症治疗；c)生存素核酶方案，即用 生存素 mRNA特异性核酶剪切生存素 mRNA以降低生存素的表达，此方案也是一种有效的研 宄工具，但不适用于癌症临床治疗；d)生存素 RNAi技术，目前的研宄表明：RNAi能有效的 使哺乳动物基因表达沉默，可用于基因功能研宄，但昂贵的费用限制其临床应用；e)用小 分子有机物或小肽抑制生存素的表达或干扰其功能；f)用生存素特异性表位的免疫治疗， 这是一个很吸引人的领域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。
[0005] 因为生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全长来设计疫苗可能存在安全隐患，根 据国内外策略的优点和弊端拟采用生存素抗凋亡功能缺失剪切体来设计疫苗，在保证其抗 凋亡功能缺失的情况下尽量保存长度以提高免疫原性。因此本发明采用生存素的抗凋亡功 能缺失剪切体来设计疫苗。生存素在体内是以二聚体形式起作用的，它N-端第6、第7和第 10位的三个氨基酸是形成二聚体的关键氨基酸（参见Shi，Y.et al.，2000);生存素的第5 位至第14位氨基酸是HLA-A2的特异性抗原表位（参见Andersen, Μ. H. et al.，2001)，基于 这两点本发明首次设计了剪切体S8 (即切去生存素 N-端7个氨基酸），希望可以破环它的 二聚体结构，从而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8为靶点来设计疫苗可能会提高疫苗的 安全性。
[0006] 粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成员，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮细胞及 其来源的肿瘤细胞表面，由多肽核心和侧枝糖链构成。其核心肽胞外段含有数目不等的串 联重复区（VNTR)。正常组织中MUCl分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖 基化丰富；而在肿瘤组织，其广泛分布并异常丰富地表达于细胞表面，糖基化不完全，因此 暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点，并且表达增强，可达正常细胞的 100倍以上，因此MUCl是较理想的抗肿瘤靶分子。
[0007] MUCl VNTR中的PDTRP序列是B细胞及T细胞共同识别的表位，可与MUCl特异 性抗体及细胞毒性T淋巴细胞（CTL)相结合，故称这个最具免疫原性的部位为免疫显性结 构域，因此，目前大部分利用MUCl研宄免疫治疗的都是集中在VNTR区域（参见Singh，R. et al.，2007 ;Persson，J. et al.，2006 ;Xing，P. X. et al.，1992 ;Tang，C. K. et al.，2008 ; Tang，C. K. et al.，2008)。从发现MUCl到现在已用其进行了很多的疫苗研宄工作，并有一些 疫苗已经进入人类临床研宄阶段，但大多数都是传统的多肽类、蛋白类或树突状细胞（DC) 类疫苗，这些疫苗大多都存在免疫原性差或制备困难等问题；进入临床的基因疫苗主要是 重组痘病毒疫苗，虽然没有检测到毒性，但直接用重组痘病毒疫苗初免-加强还是存在较 大的安全隐患，而且产生的临床效果也不是很理想；DNA载体疫苗由于免疫原性较弱目前 还基本处于临床前研宄阶段。
[0008] 本发明发明人的前期研宄表明增加 VNTR的数目可在一定程度上增强MUCl的免疫 效果（参见Zhang S et al.，2008)，如33个拷贝的MUCl VNTR串联重复序列引起的免疫应 答明显强于2个拷贝的MUCl VNTR串联重复序列引起的免疫应答，因此本发明选用含有33 个的串联重复序列MUCl VNTR作为抗原来设计疫苗，并将其与S8融合表达来构建融合表达 疫苗以增强疫苗免疫的广谱性和有效性，目前将生存素和MUCl VNTR联合应用进行肿瘤治 疗还未见报导。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种DNA片段S8,所述S8片段的序列为SEQ ID NO:8。
[0010] 本发明提供了一种重组质粒VR-S8,其中所述重组质粒的骨架载体为如图IA的 VR1012,在所述VR1012的多克隆位点中所述的S8片段。优选地，所插入的S8片段位于 VR1012的多克隆位点Sail和BamHI之间。
[0011] 本发明提供了一种SEQ ID NO:9所示的DNA片段MS，所述序列MS包含一个含有 33个拷贝的MUCl VNTR的DNA片段33M和所述的S8片段。
[0012] 本发明提供了一种重组质粒VR-MS，其特征在于所述重组质粒的骨架载体为 VR1012,在所述VR1012的多克隆位点中插入了所述的MS片段。优选地，所插入的MS片段 位于VR1012的多克隆位点Sail和BamHI之间。
[0013] 本发明提供了一种重组腺病毒Ad-S8,其特征在于在腺病毒中插入了所述的S8片 段。优选地，所述重组腺病毒的骨架载体为pBHGlox Λ El，3Cre，所插入的S8片段位于所述 重组腺病毒的多克隆位点EcoRI和BglII之间
[0014] 本发明提供了一种重组腺病毒Ad-MS，其特征在于在腺病毒中插入了所述的MS片 段。优选地，所述重组腺病毒的骨架载体为pBHGlox Λ El，3Cre，所插入的MS片段位于所述 重组腺病毒的多克隆位点BglII处。
[0015] 本发明提供了一种重组改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特征在于在所述重组改良 安卡拉痘苗病毒中插入了所述的MS片段。优选地，所插入的MS片段位于所述重组改良安 卡拉痘苗病毒的多克隆位点Sail和KpnI之间。
[0016] 本发明提供了所述的S8片段或所述的MS片段在制备用于进行抗肿瘤免疫的蛋白 疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗或树突状细胞疫苗中的用途。
[0017] 在一个优选的实施方案中，上述疫苗中包含免疫佐剂和/或化疗药物，其中所述 免疫佐剂选自细胞因子白介素2 (IL-2)、细胞因子粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF)和非 甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列，其中所述化疗药物选自卡铂、顺铂、奥沙利铂和紫杉 醇。
[0018] 本发明首先以S8为靶点进行肿瘤基因疫苗的研宄，分别构建DNA载体疫苗 (VR-S8)和腺病毒载体疫苗（Ad-S8)，采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫（DNA prime-rAd boost)免疫策略，同时采用表达白细胞介素2 (IL2)的质粒（VR-IL2)作为免疫佐剂，通过免 疫小鼠检测S8基因疫苗的免疫原性及抗肿瘤活性，结果表明：小鼠可产生针对S8的特异性 抗体（见图4)和CTL(见图5);该疫苗具有一定的抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组 比较，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为68. 54 %，生存期延长 了 35. 6% (见图6)。在治疗性实验中，与PBS组比较，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫组模 型中小鼠肿瘤生长受到了明显的抑制（抑制率为23. 42%)，但并没有明显延长模型小鼠的 生存期（见图7)。
[0019] 本发明采用生存素和MUCl为靶点设计融合表达基因疫苗。由于MUCl基因的多态 性决定了不同个体间VNTR数目的不同，最常见的为含有30-90个连续重复序列，根据自行 构建MUCl VNTR基因的特点选择以33个重复区序列（简称为33M，该序列含有33个VNTR 的串联重复序列，每个重复序列之间有6个由于构建引入的酶切位点的碱基序列，）来构建 MUCl DNA载体疫苗（VR-33M)，同时构建33M与S8融合表达的DNA载体疫苗（VR-MS)。通过 免疫模型小鼠检测融合表达基因疫苗的免疫效果和抗肿瘤活性与二者单独表达的疫苗相 比是否有明显的提高，结果表明生存素和MUCl融合表达基因疫苗的免疫效果明显强于二 者单独表达的疫苗的免疫效果，例如：在对肿瘤的预防性研宄中，融合表达疫苗免疫组与生 存素疫苗单独免疫组相比抑瘤率提高了 134%，生存期延长了 166%;与MUCl单独免疫组比 较，抑瘤率提高了 25%，生存期延长了 73% (见图12)。为了进一步加强MS疫苗的免疫效 果又构建了其病毒载体疫苗（Ad-MS和MVA-MS)，采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫的免 疫策略，同时采用表达IL2的质粒作为免疫佐剂，通过免疫模型小鼠检测融合表达基因疫 苗的免疫效果和抗肿瘤活性，结果表明DNA初免-重组腺病毒加强的免疫策略能明显抑制 模型小鼠肿瘤的生长，并有效延长小鼠的生存期；IL2也显示出了明显的佐剂增强作用（见 图 13)。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图LDNA载体及重组DNA载体疫苗图谱。A为VR1012载体图谱；B为重组质粒 VR-S8图谱；C为重组质粒VR-33M图谱；D为重组质粒VR-MS图谱。
[0021] 图2.重组腺病毒载体图谱及制备流程。A为AdMax?腺病毒载体及重组病毒制 备流程；B为穿梭载体pDC316图谱；C为重组穿梭载体pDC316-S8图谱；D为重组穿梭载体 PDC316-MS 图谱。
[0022] 图3. MVA重组原理及相关载体图谱。A为MVA重组示意图；B为穿梭载体pSCll图 谱；C为重组穿梭载体pSClI-MS图谱，MS结构基因表达框架重组到MVA的TK基因中，基因 表达的启动子采用P7. 5。
[0023] 图4.小鼠免疫血清抗S8抗体的检测。C57/BL小鼠经PBS (2)、VR-IL2 (3)、 VR-S8(4)，VR-S8/VR-IL2(5)，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8(6)免疫后，以小鼠的血清作为一抗，以 表达S8的COS-7细胞裂解上清作为检测小鼠血清的抗原，以S8单克隆抗体作为阳性对照 (1)，进行蛋白质印迹（Western-blot)检测的结果。
[0024] 图5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴细胞的特异性CTL杀伤活性检 测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并用特异性抗原肽（H_2d限制性） 标记的小鼠肺癌细胞株B16作为靶细胞，采用非放射性LDH释放法检测免疫鼠的CTL应答。
[0025] 图6.不同形式S8基因疫苗对MSf+B16(购自ATCC)肿瘤细胞体内生长的免疫预防 作用。C57BL/6 小鼠经 PBS 对照组、VR-IL2、VR-S8、VR-S8/VR-IL2 以及 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8 在经隔周免疫四次后一周，接种MSf+B16肿瘤细胞，测量肿瘤大小（A)至26天，生存情况观 察至肿瘤接种后50天（B)。
[0026] 图7.不同形式S8基因疫苗对MS/B16肿瘤细胞体内生长的免疫治疗作用。在 给C57BL/6小鼠皮下接种MS f+B16肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、卡铂（Carboplatin)、 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和VR-S8/VR-IL2/Ad-S8/卡铂疫苗，测量肿瘤大小（A)至27天，生存 情况观察至肿瘤接种后50天（B)。
[0027] 图8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗体的检测。C57/BL小鼠经PBS (I)、VR-S8 (2)、 VR-33M (3)、VR-MS (4)免疫后，以小鼠的血清作为一抗，以表达MS的C0S-7细胞裂解物作为 抗原，进行蛋白质印迹检测的结果。
[0028] 图9. MS疫苗与单独表达生存素和MUCl的疫苗诱导小鼠产生特异性CTL杀伤活性 的比较。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并用生存素（A)和MUCl (B) 特异性抗原肽（H_2d限制性）标记的小鼠肺癌细胞B16作为靶细胞，采用非放射性LDH释 放法检测免疫鼠的CTL应答。
[0029] 图10.小鼠免疫血清抗MS抗体的检测。C57/BL小鼠经PBS (I)、VR-IL2 (2)、 VR-MS(3)、VR-MS/VR-IL2(4)、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS(5)免疫后，以小鼠的血清作为一抗，以 表达MS的C0S-7细胞裂解物作为抗原，进行蛋白质印迹检测的结果。
[0030] 图11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴细胞的特异性CTL杀伤活性 检测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋巴细胞为效应细胞，并用生存素（A)和MUCl (B)特 异性抗原肽（H_2d限制性）标记的小鼠肺癌细胞B16作为靶细胞，采用非放射性LDH释放 法检测免疫鼠的CTL应答。
[0031] 图12. MS疫苗与单独表达生存素和MUCl的疫苗对模型小鼠免疫预防效果比较。 C57BL/6小鼠经PBS对照组、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在经隔周免疫三次后一周，接种 MS/B16肿瘤细胞，测量肿瘤大小（A)至26天，生存情况观察至肿瘤接种后50天（B)。
[0032] 图13.不同形式MS基因疫苗对MS/B16肿瘤细胞体内生长的免疫治疗作用。在 给C57BL/6小鼠皮下接种MS/B16肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、卡铂、VR-MS/VR-IL2/ Ad-MS、VR-MS/VR-IL2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-IL2/Ad-MS/ 卡铂组，测量肿瘤大小（A)至 27 天，生存情况观察至肿瘤接种后50天（B)。
【具体实施方式】
[0033] - .上述片段33M和S8的制备方法和条件
[0034] L 33M 的制备
[0035] MUC1VNTR为一个含有60个碱基的重复片段，GenBank号为NM_002456(SEQ ID NO: 1)。根据一个VNTR的碱基序列设计了两对引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE PCR)合 成1个VNTR (Im)重复区片段，然后利用限制性内切酶Sal I和XhoI酶切产生相同粘性末端 的特性，依次进行连接，构建33M基因片段。具体方法如下：
[0036] 1)重叠延伸PCR技术
[0037] PCR 反应条件为：95°C 20s、55°C 20s、72°C 30s，进行 30 个循环，利用引物 P1(SEQ ID N0:2)和 P2(SEQ ID N0:3)扩增出无 ATG的l拷贝MUClVNTR(简写为m)，以P2和P3(SEQ ID N0:4)为引物扩增出含ATG的1拷贝MUC1VNTR(简写为Am)片段。
[0038] 2)pGEM-T-33M的构建、酶切鉴定及序列分析
[0039] 将上述PCR产物m和Am分别和pGEM-T-easy (Promega公司）载体进行连接，分 别获得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T-Am两个质粒，然后利用限制性内切 酶Sail和XhoI酶切产生相同粘性末端的特性，依次进行连接获得含有所述33M片段的 PGEM-T-33M质粒，经Sail和XhoI酶切鉴定后进行序列分析，测序结果正确。具体过程即先 将pGEM-T-m用Sail和XhoI双酶切得目的片断m，然后再将其插入pGEM-T-m的XhoI位点， 即得到pGEM-T-2m。然后再将pGEM-T-2m用Sail和XhoI双酶切得目的片断2m，然后再将其 插入pGEM-T-2m的XhoI位点，即得到pGEM-T-4m，同理得pGEM-T-32m，然后再将pGEM-T-Am 用Sail和XhoI双酶切得目的片断Am，然后再将其插入pGEM-T-32m的Sail位点，即得到了 质粒 pGEM-T-33m。
[0040] 2. S8 的制备
[0041] 生存素，GenBank号为NM_001168,根据生存素的序列设计了两对引物，采用 RT-PCR技术从293细胞的总RNA中扩增出了 S8的基因片段，序列为SEQ N0:8所示的碱基 序列。具体方法如下：
[0042] DRT-PCR 技术
[0043] 采用TRIzol RNA提取试剂盒（Gibco公司）提取293细胞的总RNA，采用 Super-Script反转录酶试剂盒（Gibco公司）从中获得293细胞的cDNA，然后以其为模板， 以P4(SEQ ID N0:5)和P5(SEQ ID N0:6)为引物进行PCR(反应条件为：95°C30s、55°C30s、 72°C lmin，进行30个循环）扩增生存素 cDNA。
[0044] 2)pGEM-T-S8的构建、酶切鉴定及序列分析
[0045] 将生存素 cDNA的PCR产物与pGEM-T-easy载体进行连接得到含有生存素 cDNA的 pGEM-T-Surv质粒。经序列分析证实正确后，以pGEM-T-Surv为模板，以P6 (SEQ ID NO: 7) 和P5为引物通过PCR扩增S8片段（SEQ ID N0:8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI和Sail 的酶切位点，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位点。将S8PCR产物连入pGEM-T-easy载体 获得含有所述S8片段的pGEM-T-S8质粒，经Sail和BamHI酶切鉴定后进行序列分析，测序 结果正确。
[0046] 二.重组疫苗的获得方法及相应的条件
[0047] I. DNA载体疫苗
[0048] 1)VR-33M 的构建
[0049] VR1012载体（VR1012是Vical公司开发的经美国FDA正式批准的可以用于人体基 因疫苗临床试验的载体，已经完成的临床试验表明其在人体的应用是安全的，该载体的构 建过程参见文献（Human Gene Therapy 1996,7:1205-1217))含有CMV启动子，卡那霉素抗 性基因，内含子A和BGH PolyA翻译终止信号等常规部件组成，共4913bp，图谱见图1A。
[0050] 将上述制得的PGEM-T-33M质粒经Sall/Xhol双酶切后用胶回收试剂盒（北京天 根生化科技有限公司）回收33M基因片段，将真核表达载体VR1012载体经Sail单酶切后 用胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收载体片段，利用经Sail和XhoI酶切 后具有相同粘性末端这一性质将所回收的目的基因片段和载体片段，以T4 DNA连接酶，在 16°C下连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌ToplOQnvitrogen公司），涂布卡 那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37°C下培养 16h，l，2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取质 粒，用Sall/BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒VR-33M，图谱见图 IC。
[0051] 2)VR-S8 的构建
[0052] 将PGEM-T-S8和真核表达载体VR1012载体分别经Sall/BamHI双酶切，用胶回收 试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的基因片段S8和VR1012载体片段，用T 4DNA 连接酶，16°C连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌ToplO (invitrogen公司），涂 布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37°C下 培养16h，1，2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提 取质粒，用Sall/BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒VR-33M，图谱 见图1B。
[0053] 3) VR-MS 的构建
[0054] 将pGEM-T-33M经Sall/Xhol双酶切后回收目的基因片段33M，将VR-S8载体经 Sail单酶切后回收载体片段，利用经Sail和XhoI酶切后具有相同粘性末端这一性质将回 收目的基因片段和载体片段用T 4DNA连接酶，16°C连接3h。获得VR-33M-S8,简称VR-MS质 粒，用Sall/BamHI进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒VR-MS，图谱见图 ID。
[0055] MS序列为如SEQ ID NO:9所示的碱基序列。
[0056] 2.重组腺病毒疫苗（Ad-S8、Ad-MS)的获得
[0057] 腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结 构，直径约80-110nm。腺病毒基因组的两端各有一段IOObp的反向末端重复序列（ITR)，是 复制的起始位点。在左端ITR的3'侧有一段长约300bp的包装信号（Φ )介导腺病毒基因 组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（Φ)的约0.5kb的序 列是顺式作用元件，即必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助 病毒（或细胞）反式补足。
[0058] 本实验中米用的腺病毒系统是AdMax? Adenovirus载体系统（Microbix公司）， 该系统是位点特异性重组系统，位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组， 重组的发生需一段同源序列即特异性位点和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重 组酶只能催化特异性位点间的重组，不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重 组，因而重组具有特异性和高度保守性。据此，位点特异性重组又称保守重组，该重组过 程不需RecA酶参与。目前应用较多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系统，其中Cre、 FLP和BP均为特异性重组酶，属重组酶λ整合酶家族，它们催化的反应类型、靶位点及重组 机制十分相似，loxP、FRT和attBP为特异性位点，也有相似的结构。AdMaxTM Adenovirus 载体应用的是Cre/loxP系统，Cre基因表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为 38kDa，它是位点特异性重组发生所需的特异性重组酶，其识别位点被称为IoxP (locus of crossing-over Pl)，为一段34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的不 对称间隔序列（又称为核心序列）组成Y -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。 IoxP位点碱基重排后形成十字形的结构，核心序列形成一单链环，它为Cre重组酶切割的 底物，也是DNA识别与重组的位点，对称的13bp反向重复序列是Cre重组酶结合的序列。
[0059] AdMaxTM Adenovirus载体系统是由穿梭载体和骨架载体（pBHGlox Δ El, 3Cre)构 成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。 将穿梭载体与骨架载体共转染包装细胞株293,骨架载体所携带的Cre基因开始表达，介导 两个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架载体上的细菌内复制元件、抗性基因以及Cre基因， 同时完成目的基因的插入。由于骨架载体虽然携带有大部分的腺病毒基因组DNA却缺少 形成有感染能力腺病毒颗粒所必需的包装信号（Φ)，而穿梭载体则含有Φ，因此只有在两 个载体之间发生了重组，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重组腺病毒颗粒；另 夕卜，骨架载体缺失El基因，因此需要转染组成型表达El蛋白的293细胞。将骨架载体和穿 梭载体（本研宄选用的穿梭载体为PDC316,图谱见图2B)共转染293细胞，利用293细胞 中的El蛋白，10左右天就可以产生出含有外源基因的重组腺病毒噬斑（见图2A)，挑取噬 斑，进行PCR(反应条件为：95°C 30s、53°C 30s、72°C lmin，进行30个循环）鉴定，选取正确 的克隆进行大量扩增、纯化和滴度测定。
[0060] 1)穿梭重组质粒pDC316-S8和pDC316-MS的获得
[0061] 将pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI双酶切后回收得到S8目的片段，将pDC316用EcoRI/ Bgin双酶切后回收作为载体，利用BamHI和Bgin具有相同粘性末端的性质，将回收目的 基因片段和载体片段用T4DNA连接酶，16°C连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌 ToplO (Invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌 落于5mlLB培养基中37°C下培养16h，1，2000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒（北京 天根生化科技有限公司）提取质粒，用EcoRI/Bgin进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即 得到了重组质粒pDC316-S8(图谱见图2C)质粒。将VR-MS用Bgin单酶切后回收得到MS 目的片段，将PDC316用Bgin单酶切后回收作为载体，将回收目的基因片段和载体片段进 行连接，经双酶切和测序鉴定结果正确，即获得PDC316-MS(图谱见图2D)质粒。
[0062] 2) Ad-S8和Ad-MS重组病毒的获得
[0063] 将 pBHGlox Δ El, 3Cre 和 pDC316-S8 或 pDC316-MS 共转染 293 细胞后，经过筛选、 扩增、纯化后，获得分别含有S8和MS片段的重组腺病毒Ad-S8或Ad-MS。
[0064] 3.重组MVA疫苗（MVA-MS)的获得
[0065] 改良安卡拉痘苗（MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量 大等优点使其得以广泛应用于肿瘤免疫治疗中。MVA含有胸苷激酶基因（TK)(参见图3A); pSCll(参见图3B)是它的穿梭质粒，具有多克隆酶切位点可以插入外源基因、具有胸苷激 酶的左臂和右臂（TKUTKR)可以与MVA进行同源重组，同时含有IacZ基因，可以用于重组 MVA(rMVA)的蓝斑筛选。所述MVA系统（含穿梭质粒pSC 11)购自ATCC。
[0066] 1)穿梭重组质粒pSClI-MS的获得
[0067] 将VR-MS和pSCll经Sall/Kpnl双酶切后回收，将回收目的基因片段MS和 pSCll载体片段用T4DNA连接酶，16 °C连接3h。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌 ToplO (invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌 落于5mlLB培养基中37°C下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒（北京天 根生化科技有限公司）提取质粒，用Sall/Kpnl进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到 了重组质粒PSCll-MS (见图3C)。
[0068] 2) MVA-MS重组病毒的获得
[0069] 首先以滴度 0· 05pfu/cell 的 MVA 感染 tk-tsl3 细胞（购自 ATCC，ATCC 号为CRL-1632?，是不含有TK基因的BHK-21的突变株）。感染2小时后，利用 Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法将 pSClI-MS 转染到感染了 MVA 的 tk-tsl3 细胞中。 MVA在tk-tsl3细胞内复制的过程中，由于pSCll-MS具有与MVA的TK基因同源的TKL和 TKR，所以有一定比例的MVA病毒与pSCl I-MS发生重组，结果MS和LacZ阅读框架被重组到 MVA病毒基因组中。形成如图3C所示的MVA-MS重组病毒。
[0070] 以上被感染细胞培养三天后，收集细胞，裂解细胞，超声波处理，2000rpm离心 IOmin除去细胞残渣保留上清。取一定量上清，作为种毒，在6孔板中将病毒依次稀释成 10_2、10_ 3、10_4、10_5、10_6，感染〖1^813细胞211。将等体积的在45°〇下预温的2%低熔点琼 脂糖和2 XDMEM-10/BrdU (BrdU，5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可掺入到野生 型MVA中，产生致死性突变，从而可以使野生型MVA逐渐减少）培养基混匀，每孔加入3ml 培养基，在室温下凝固，在37°C下于含5% 0)2的培养箱中培养48h。铺上层选择性培养基， 成分比下层琼脂多了 1/120体积的4% X-gal。培养过夜，挑选蓝色单斑，反复冻融三次裂 解释放病毒，进行下一轮的筛选，步骤相同，如此进行6轮以上筛选，最后直至得到只含重 组病毒MVA-MS的克隆株。
[0071] 三.疫苗免疫效果
[0072] I. S8疫苗免疫效果
[0073] I. 1S8疫苗的免疫原性
[0074] 本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨生存素 DNA疫苗和重组腺病毒 疫苗，以及其与IL-2质粒共免疫诱导小鼠的免疫应答。实验将C57/BL/6小鼠按表1进行分 组，1组在第〇、2、4、6周注射PBS ;2-4组在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐剂；5 组在第〇、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐剂，在第6周注射重组腺病毒疫苗。考察 生存素 DNA单独免疫的免疫效果、IL-2质粒的佐剂效果，以及重组腺病毒的免疫增强作用。
[0075] 表I S8疫苗免疫原性
[0076]
【权利要求】
1. 一种SEQ ID N0:9所示的DNA片段MS在制备用于进行抗肿瘤免疫的蛋白疫苗、DNA 疫苗、病毒载体疫苗或树突状细胞疫苗中的用途，其中所述片段MS包含一个含有33个拷贝 的MUC1 VNTR的DNA片段33M和一种序列为SEQ ID N0:8的DNA片段S8片段。
2. 权利要求1中所述的用途，其中所述疫苗中还包含免疫佐剂；优选地，所述免疫佐剂 选自细胞因子白介素2(IL-2)、细胞因子粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF)和非甲基化的 CpG基序免疫刺激DNA序列。
3. 权利要求1或2所述的用途，其中所述疫苗中还包含化疗药物；优选地，所述化疗药 物选自卡铂、顺铂、奥沙利铂和紫杉醇。
4. 一种重组质粒VR-MS在制备用于进行抗肿瘤免疫的DNA疫苗中的用途，其中所述重 组质粒VR-MS的特征在于所述重组质粒的骨架载体为载体VR1012,在所述VR1012的多克隆 位点中插入一个SEQ ID NO:9所示的MS片段；优选地，所插入的MS片段位于所述VR1012 的多克隆位点Sail和BamHI之间。
5. 权利要求4中所述的用途，其中所述疫苗中还包含一种重组腺病毒Ad-MS或者 一种重组改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，并且以VR-MS进行初免，以Ad-MS或MVA-MS进 灯加强免疫，其中所述重组腺病毒Ad_MS的特征在于在腺病毒中插入SEQ ID N0:9所不 的MS片段；优选地，所述重组腺病毒Ad-MS的特征在于所述重组腺病毒的骨架载体为 pBHGlox A El，3Cre，所插入的MS片段位于所述重组腺病毒的多克隆位点Bglll处，并且其 中所述重组改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS的特征在于在改良安卡拉痘苗病毒中插入SEQ ID NO:9所示的MS片段；优选地，所述的重组改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS的特征在于所插入 的MS片段位于所述重组改良安卡拉痘苗病毒的多克隆位点Sail和Kpnl之间。
6. 权利要求4或5中所述的用途，其中所述疫苗中还包含免疫佐剂，并且其中所述免疫 佐剂与所述VR-MS -同给予。
7. 权利要求6中所述的用途，其中所述免疫佐剂选自细胞因子白介素2(IL-2)、细胞因 子粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
8. 权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述疫苗中还包含化疗药物。
9. 权利要求8所述的用途，其中所述化疗药物选自卡铂、顺铂、奥沙利铂和紫杉醇。
10. 前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述肿瘤为表达生存素和MUC1的肿瘤。
【文档编号】A61K39/39GK104491852SQ201410788971
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2009年12月4日 优先权日:2009年12月4日
【发明者】孔维, 张海红, 于湘晖, 于永慧 申请人:长春百克生物科技股份公司