本发明属于生物医药和纳米材料技术领域，涉及一种氧化还原敏感型可降解纳米微球载体的制备方法。
背景技术：
近年来，提高抗癌药物载体转载效率的研究成为热点，主要研究方向是集多功能于同一载体，实现多因子靶向、复合载药和可控释药。载体的载药元件设计、靶向制导方法、药物释放策略等方面的新思路不断涌现，新型高效多功能纳米载体的构建越来越受到研究者的青睐。智能型药物载体一般由通过含有环境敏感基团相连的载药基质与药物共同组成。选取可降解的材料，如聚氨基酸、壳聚糖等作为载药基质，不但能提高载体对正常组织细胞的生物相容性，而且避免载体在生物体内的沉积，有效减少肿瘤治疗过程的副作用。智能型药物释放行为控制就是选择合适的链接基团，使之在特定的条件下快速降解，释放出药物，并且不会对药物的结构和功能产生任何影响。智能型药物载体在一定程度上能够克服临床普遍存在的多药耐药问题，智能型药物载体的研究对肿瘤治疗具有重要意义。解决载体存在的可引发不良反应、易被网状内皮组织吞噬、主动靶向性差等问题是目前研究的重点。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前肿瘤载体主动靶向性能不高，体内不可降解导致沉积引发不良发应，以及对载药的控释效率低等问题，提供一种有机-无机载药基质相结合、对肿瘤细胞的pH值和还原性环境高度敏感的氧化还原敏感型纳米靶向载体的制备方法。该微球载体具有靶向功能强、药物控释智能、结构稳定、无毒副作用等特点。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种氧化还原敏感型纳米靶向载体的制备方法，采用微乳液技术合成磷酸钙微粒，在微粒表面涂布一层可降解的有机大分子物质形成载药核心。把还原性环境敏感型交联元件组装到载药核心上，之后接枝改性的靶向因子，最终合成智能型靶向纳米微球载体。具体制备步骤如下：一、CaP微粒制备：(1)取浓度为0.1～0.5moL/L的CaCl2溶液加入到由环己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚组成的油相中，油相中环己烷与聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的体积比为70∶10～100，CaCl2溶液与油相的体积比为1∶10～30。(2)另取浓度为10～30mmoL/L的Na2HPO3溶液和浓度为20～50mmoL/L二羟基苯丙氨酸(DOPA)的三氯甲烷溶液滴入到另一份上述油相中，Na2HPO3溶液与油相的体积比为1∶10～30，DOPA的三氯甲烷溶液与油相体积比为1∶20～60，Na2HPO3与DOPA的摩尔比为1∶0.5～5。(3)两相混合搅拌2～8h，控制Na2HPO3与CaCl2的摩尔比为1∶10～25。(4)加入乙醇，乙醇与混合相总体积比为1∶3～8，高速离心，弃上清液，沉淀用乙醇清洗，冷冻干燥得到CaP微粒。二、载药核心装配：取CaP微粒用去离子水或者三氯甲烷重悬，CaP微粒浓度为5～20mg/mL，将改性活化的大分子和抗癌药物溶于DMSO，改性活化的大分子浓度为1～10mg/mL，抗癌药物浓度为0.5～5mg/mL，将两组溶液混合，控制CaP微粒与活化的大分子的摩尔比为1∶0.5～4，CaP微粒与抗癌药物的摩尔比为1∶0.1～10，室温环境下搅拌4～24h，组装成载药核心微粒，高速离心，冷冻干燥。三、氧化还原敏感型控释元件组装：取载药核心微粒分散到浓度为1～15mg/mL的N，N-二甲基甲酰胺(MSDS)溶液中，添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入含有二硫键的控释元件，控制载药核心微粒与含有二硫键的控释元件的摩尔比为1∶1～5，载药核心微粒与EDC·HCl的质量比为1∶1～5，载药核心微粒与NHS的质量比为1∶1～5，40～60℃条件下搅拌12～48h，将控释元件组装到载药核心上。四、靶向元件修饰：取上述含有控释元件的产物加入到浓度为0.1～1mmol/LEDTA的中性磷酸缓冲液中，含有控释元件的产物与缓冲液的比例为1∶0.5～4(m/v)，加入靶向分子，控制靶向分子浓度为1～20mmol/L，在室温氮气保护条件下反应12～48h，用去离子水透析，冻干，获得智能型纳米靶向载体。本发明中，所述载药核心的大分子为活化的壳聚糖(CS)、聚己内酯(PCL)或聚乙稀亚胺(PEI)的其中之一或任意两者的共聚物。本发明中，所述载药核心运载的抗癌药物为盐酸阿霉素(DOX)和/或siRNA。本发明中，所述氧化还原敏感型控释元件为巯基乙胺修饰的寡肽片段(PAsp(MEA))、胱氨二盐酸盐或二硫代二丙酸的一种。本发明中，所述靶向元件选用肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、双功能肽R13或叶酸的一种。本发明中，所述Na2HPO3与CaCl2的摩尔比可进一步优化为1∶12～20，Na2HPO3与DOPA的摩尔比可进一步优化为1∶0.8～4，油相中环己烷与聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的体积比可进一步优化为70∶20～80。本发明中，所述CaP微粒与活化的大分子的摩尔比可进一步优化为1∶0.8～3.4。本发明中，所述载药核心微粒与含有二硫键的控释元件的摩尔比可进一步优化为1∶1.2～4，载药核心微粒与EDC·HCl的质量比可进一步优化为1∶1.2～4，载药核心微粒与NHS的质量比可进一步优化为1∶1.2～4。本发明中，所述靶向分子浓度可进一步优化为1～16mmol/L。本发明具有如下优点：(1)对正常细胞无毒，释放药物伴随降解。(2)靶向性强，药物智能控释。(3)本发明所述智能靶向载体能够有效提高肿瘤治疗效果，具有较高的应用前景。附图说明图1为负载盐酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R扫描电镜图片。具体实施方式下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。实施例1本实施例按以下步骤制备负载盐酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R：a、取10mL0.3moL/L的CaCl2溶液加入到200mL油相中。油相的组成：环己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚为80/30(v/v)。另取10mL15mmoL/LNa2HPO3溶液和5mL浓度为30mmol/L的DOPA三氯甲烷溶液到另一份上述油相中。两相混合搅拌2h。加入100mL乙醇，10000rpm离心30min，除去上层环己烷和表面活性剂，用乙醇清洗3次，冷冻干燥得到CaP微粒。b、取100mgCaP微粒添加10ml去离子水，另取100mg改性活化的壳聚糖和10mgDOX溶于50mLDMSO，CaP乳浊液缓慢滴入到壳聚糖溶液中，25℃不断搅拌，反应8h，10000rpm离心30min，弃上清，冷冻干燥，获得负载DOX的GCP微粒。c、取100mgGCP微粒转移到50mL浓度为5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中缓慢滴加10mL(浓度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和10mL(浓度10％，m/v)NHS，室温反应，加入100mgPAsp(MEA)，不断搅拌，40℃氮气保护条件下反应20h，将控释元件组装到载药核心上。d、取50mg上述产物加入到含有50mL0.1mmol/LEDTA的中性磷酸缓冲液中，加入20μgR13，在室温氮气保护条件下反应24h。用截留分子量为8000的透析袋透析48h，冷冻干燥，获得智能型纳米靶向载体GCP-SS-R，其扫描电镜图如图1所示。检测结果显示，GCP-SS-R纳米微球粒径分布均匀，平均粒径为108-176nm。DOX包封率为75.3％，在谷胱甘肽的浓度为2mM，pH为5.0的PBS中8小时的释放量达到52.4％。实施例2本实施例按以下步骤制备负载siRNA的PCP-SS-T：a、按照实施例1的a步骤制备CaP微粒。b、取10mgCaP微粒添加5ml去离子水，另取10mg改性活化的PEI和100μgsiRNA溶于10mLDMSO，CaP乳浊液缓慢滴入到PEI溶液中，25℃条件下不断搅拌8h，10000rpm离心30min，弃上清，冷冻干燥，获得负载siRNA的PCP微粒。c、取10mgPCP微粒转移到10mL浓度为5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中缓慢滴加2mL(浓度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和2mL(浓度10％，m/v)NHS，室温反应，加入10mgPAsp(MEA)，不断搅拌，40℃氮气保护条件下反应48h，将控释元件组装到载药核心上。d、取10mg上述产物加入到含有10mL浓度为0.1mmol/LEDTA的中性磷酸缓冲液中，加入100μgTRAIL，在30℃氮气保护条件下反应48h。用截留分子量为8000的透析袋透析72h，低温冷冻干燥，获得智能型纳米靶向载体PCP-SS-T。PCP-SS-T纳米微球粒径分布均匀，平均粒径为150-197nm。siRNA包封率为89.3％，在谷胱甘肽的浓度为2mM，pH为5.0的PBS中8小时的释放量达到72.4％。实施例3本实施例按以下步骤制备负载DOX和siRNA的PCP-SS-T：a、按照实施例1的a步骤制备CaP微粒。b、取10mgCaP微粒添加5ml去离子水，另取10mg改性活化的PEI-CS共聚物和溶于10mLDMSO，加入100μgsiRNA和1mgDOX，将CaP乳浊液缓慢滴入到PEI-CS溶液中，25℃条件下不断搅拌8h，10000rpm离心30min，弃上清，冷冻干燥，获得负载siRNA和DOX的PCCP微粒。c、取10mgPCCP微粒转移到10mL浓度为5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中缓慢滴加2mL(浓度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和2mL(浓度10％，m/v)NHS，室温反应，加入10mg胱氨二盐酸盐，不断搅拌，40℃氮气保护条件下反应6h，将控释元件组装到载药核心上。d、取10mg上述产物加入到含有10mL浓度为0.1mmol/LEDTA的中性磷酸缓冲液中，添加100μgTRAIL，在30℃氮气保护条件下反应48h。用截留分子量为8000的透析袋透析72h，低温冷冻干燥，获得智能型纳米靶向载体PCCP-SS-T。检测结果显示，PCCP-SS-T纳米微球粒径分布均匀，平均粒径为214-299nm。siRNA包封率为84.9％，DOX包封率为85.2％。在谷胱甘肽的浓度为2mM，pH为5.0的PBS中8小时siRNA的释放量达到63.1％，DOX达到71.4％。