苄基异喹啉类生物碱的新用途的制作方法

本发明涉及苄基异喹啉类生物碱在制备抑制脂肪酸合成酶表达药物中的用途。

背景技术：

脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)是生物体内源性脂肪酸合成过程的关键酶，它通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。

在正常情况下，FAS可在肝脏和脂肪等各种组织中表达，其功能是将碳水化合物合成脂肪酸，以甘油三酯的形式储存。研究发现，FAS与肥胖密切相关。这是因为FAS在人的肝脏和脂肪组织中有较高的表达，特别是在肝脏中，其脂肪酸合成能力较脂肪组织高8～9倍，同时其表达水平受摄食成分和激素水平的影响，含碳水化合物的饮食通过刺激FAS的高表达诱导脂肪的生成。

研究还发现，在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等组织中的FAS表达远高于正常组织。进一步的研究证明，抑制FAS的表达，可以有效控制肿瘤细胞的增生或诱导其凋亡。

因此，抑制FAS的表达对于抑制内源性脂肪酸的生物合成，进而有效控制肿瘤、肥胖及各种相关代谢综合症等的发生、发展有着重要的意义(徐晓伟等，脂肪酸合成酶抑制剂的研究进展，国际药学研究杂志，2009年4月第36卷第2期，第105-120页；赵励彦等，脂肪酸合成酶抑制剂减肥作用机制的研究进展，中国药理学通报，2006，22(7)，第780-784页)。

苄基异喹啉类生物碱是自然界中很重要的一类生物碱，数量多、结构类型复杂。苄基异喹啉类生物碱来源丰富，可从多种生物中提取得到，并且具有多种的生理活性。

但是，目前尚未有关于苄基异喹啉类生物碱可以抑制FAS表达的报道。

技术实现要素：

本发明提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示苄基异喹啉类生物碱或其药学上可接受的盐在制备抑制脂肪酸合成酶表达药物中的用途：

其中，R₁-R₄表示氢或甲基，Me表示甲基。

本发明的化合物可根据现有技术从生物中提取或是制备得到，例如：

Yi Zhou等人报道的Five alkaloids from Hypecoum leptocarpum，Phytochemistry，50(1999)：339-343；

Kenneth W.Bentley报道的β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids，Nat.Prod.Rep.,2000,17,247–268。

丁晨旭等报道的从藏药细果角茴香中提取分离四种或五种生物碱的方法(CN 104761562 A)。

优选的苄基异喹啉类生物碱选自leptopidine或hypecocarpine，其均可以从藏药细果角茴香中分离提取得到：

优选地，所述药物是抗肿瘤药物或治疗代谢综合征的药物。

更优选地，所述抗肿瘤药物是治疗乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌的药物。

更优选地，所述治疗代谢综合征的药物是治疗肥胖或肥胖并发症的药物。更进一步优选地，所述治疗肥胖或肥胖并发症的药物是治疗非胰岛素依赖型糖尿病、高血压或冠状动脉栓塞的药物。

本发明还提供一种药物组合物，它是以上述苄基异喹啉类生物碱或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

优选地，所述的药物组合物在制备抑制脂肪酸合成酶表达药物中的用途。

优选地，所述药物是抗肿瘤药物或治疗代谢综合征的药物。

更优选地，所述抗肿瘤药物是治疗乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌的药物。

更优选地，所述治疗代谢综合征的药物是治疗肥胖或肥胖并发症的药物。更进一步优选地，所述治疗肥胖或肥胖并发症的药物是治疗非胰岛素依赖型糖尿病、高血压或冠状动脉栓塞的药物。

经试验证明，本发明的化合物可以有效抑制FAS表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。同时，本发明化合物原料来源丰富，具有良好的临床应用前景。

在本发明的含义之内，“治疗”也包括复发性(relapse)预防或阶段性(phase)预防，以及急性或慢性体征、症状和/或功能失常的治疗。治疗可以是对症治疗，例如抑制症状。它可以在短期内实现，在中期内调整，或者可以说是长期治疗，例如在维持疗法里面。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为hypecocarpine和leptopidine对乳腺癌细胞的细胞毒性，其中，左边的图为药物在不同浓度下下作用乳腺癌细胞24h的结果，右边的图为药物在不同浓度下作用乳腺癌细胞48h的结果。

图2为hypecocarpine和leptopidine脂肪酸合酶FAS表达的影响。

具体实施方式

实施例1本发明hypecocarpine和leptopidine的制备

实验材料来源为市售的商品。

1、细果角茴香粗提物的制备

将2.0千克细果角茴香加入20L 95％乙醇提取3h，重复3次。合并3次提取液收集滤液后旋转蒸发仪浓缩除去乙醇，得到浸膏。浸膏用2L 2％的盐酸溶解，过滤，除去不溶物，得到生物碱的酸液。酸液用2L石油醚萃取，重复三次，除去脂溶性杂质。酸液用浓氨水调节PH值至9-10。然后用氯仿萃取，得到12.6g生物碱粗样，用于后面的高速逆流色谱。

2、PH区带高速逆流色谱法结合半制备色谱法分离制备hypecocarpine和leptopidine

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:5:2:5,v/v/v/v)两相溶剂系统，充分振摇后静置过夜。下相加盐酸使其浓度为5mM作为固定相，上相加三乙胺使其浓度为10mM作为流动相，使用前分别超声脱气30min。取200mg待分离样品粉末，震荡完全溶解于10mL下相溶液中，备用。

用20mL/min流速将溶剂系统下相泵入主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设定为25℃。开启主机电源以850r/min正向旋转，待转速稳定后，以1.5mL/min流速泵入流动相，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在280nm波长下连续检测，根据逆流色谱图手动收集各色谱峰组分。从1.2g粗样中分离得到45mg hypecocarpine和leptopidine混合物物(组分a)，31mg(-)-N-methylanadine(组分b),21mg oxohydrastinine(组分c),57mg hydroprotopine(组分d)四种生物碱。

其中，接收出峰时间为49-57min的目标成分，即可得到组分a；接收出峰时间为70-75min的目标成分，即可得到(-)-N-methylanadine；接收出峰时间为102-106min的目标成分，即可得到oxohydrastinine；接收出峰时间为126-133min的目标成分，即可得到hydroprotopine。

组分a经半制备色谱可得到有效的分离，得到9mg hypecocarpine(组分a-1)和15mg leptopidine(组分a-2)。其中，接收出峰时间为22.7-23.2min的目标成分，即可得到组分a-1；接收出峰时间为24.8-25.4min的目标成分，即可得到leptopidine。

半制备条件：NU 3000SERIALS UV/VIS(汉邦公司)检测器；NP 7000SERIALS(汉邦公司)泵；半制备柱：Dubhe C18柱(20*250mm)汉邦科技有限公司；检测波长280nm；梯度条件：甲醇:0-10min,40-42％；10-30min,42-42％。

HPLC分析条件：HPLC/DAD系统为Agilent 1200系统，配有G1313A自动进样器；G1316A柱温箱；G1315B UV-vis检测器。色谱柱为XBridge Shield RP18分析柱(5μm,4.6×250mm)，进样量15ul；检测波长为：280；DAD扫描波长为200-800nm。梯度洗脱的条件：甲醇:0-15min,20-50％；20-25min,50-80％；25-30min,80-95％.

化合物a-1(hypecocarpine)的确认：

¹H NMR(600MHz,CD₃OD,δppm):3.75(s,3H,N-Me),3.97(t,2H,J＝7.5Hz,H-3),3.09(t,2H,J＝7.5Hz,H-4),6.91(s,1H,H-5),7.17(s,1H,H-8),3.80(s,3H,4’-OMe),3.49(s,3H,7-OMe),3.87(s,3H,6-OMe),6.94(d,1H,J＝7.5Hz,H-5’),6.68(d,1H,J＝7.5Hz,H-6’).¹³C NMR(600MHz,CD₃OD,δppm):178.30(C-1),44.30(N-Me),53.80(C-3),26.6(C-4),134.9(C-4a),111.4(C-5),156.5(C-6),149.0(C-7),114.5(C-8),120.6(C-8a),130.3(C-1’),118.5(C-2’),154.9(C-3’),149.8(C-4’),114.40(C-5’),120.7(C-6’),38.4C-7’),56.5(4’-OMe),56.8(6-OMe),56.6(7-OMe)。经过一维、二维核磁以及高、低分辨率质谱鉴定，确定为hypecocarpine。

化合物a-2(leptopidine)的确认：

¹H NMR(600MHz,CD₃OD,δppm):3.69(s,3H,N-Me),3.97(t,2H,J＝7.5Hz,H-3),3.09(t,2H,J＝7.5Hz,H-4),6.85(s,1H,H-5),6.00(s,2H,6,7-OCH2-),7.15(s,1H,H-8),3.81(s,3H,4’-OMe),6.91(d,1H,J＝7.5Hz,H-5’),6.53(d,1H,J＝7.5Hz,H-6’).¹³C NMR(600MHz,CD₃OD,δppm):178.30(C-1),44.42(N-Me),53.57(C-3),27.01(C-4),137.16(C-4a),108.98(C-5),148.67(C-6),155.15(C-7),110.63(C-8),122.39(C-8a),129.30(C-1’),117.77(C-2’),154.73(C-3’),149.76(C-4’),114.40(C-5’),120.29(C-6’),38.89(C-7’),104.22(6,7-OCH2-),56.39(4’-OMe)。根据其核磁数据和参考相关文献可以确定此化合物为leptopidine.

实施例2本发明hypecocarpine和leptopidine的用途

1.实验材料

实验材料来源为自制或是市售的商品。

1.1细胞株：

人类乳腺上皮癌细胞(MDA-MB-231)：由中国科学院大学马晓丰酶学实验室提供。

1.2主要试剂：

化合物hypecocarpine和leptopidine由本实施例1的方法制得，纯度均大于97.8％；胎牛血清(FBS)购于北京市四季青生物工程材料公司；DMEM培养基购于日本东京市Nissui Seiyaku公司；CCK-8盒日本熊本市同仁化学研究所生产；乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)，均购于Sigma-Sidrich公司；抗体：两个一抗，FAS的抗体和GAPDH的抗体都是鼠抗，二抗是非特异性抗体，是山羊抗鼠的抗体。两个抗体都购于promega公司。

DMSO为AMRECCO公司产品，其他化学试剂若无特殊说明，均来自上海淡宁化工有限公司。

1.3主要实验仪器：

SW-CJ-IF型单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；CO2INCUBATOR MCO-15AC培养箱(日本三洋电器公司)；BDS200倒置生物显微镜(奥特光学)；DK-S11型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；Synergy H11型酶标仪(BioTec)；GA99-IID超声波细胞粉碎机(无锡市上佳生物科技有限公司)；冷冻离心机(赛默飞)；DYY-60D型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.4主要溶液配制：

①试剂A，1L：分别称取10g BCA(1％)，20g Na₂CO₃·H₂O(2％)，1.6g Na₂C₄H₄O₆·2H₂O(0.16％)，4g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO₃(0.95％)，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO₃调节pH值至11.25。

②试剂B，50mL：取2g CuSO₄·5H₂O(4％)，加蒸馏水至50mL。

③BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。

④10×电转液(Transfer buffer)的配制：

Tris 33.0g

Gly 144.1g

甲醇(先用现加) 750mL

定容于1000mL蒸馏水中。

⑤5×SDS凝胶加样缓冲液(5×SDS-PAGE-DTT)的配置：

定容于10mL蒸馏水中，混匀后，分装于1.5mL EP管中，4℃保存。

⑥10×TBS的配置：

5M Tris-HCL(PH 7.5) 100mL(60.6g)

NaCl 9.0g

加水至1L

⑦1×TBST的配置：1L 1×TBS+1m L Tween20。

⑧10×SDS电泳缓冲液(SDS Running buffer)的配置：

定容于1000mL蒸馏水中，溶解后室温保存。

⑨8％分离胶(8％SDS-PAGE)的制备：

⑩磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：称量KCl 10.5g，KH2PO40.25g,NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.6g，去离子水定容至1L，调PH为7.2-7.4，高压蒸汽灭菌20min,4℃保存备用。

Loading Buffer的配制：EDTA4.4g，(溴酚蓝)Bromophenol Blue 250mg，二甲苯蓝FF(Xylene Cyanol FF)250mg，溶于200ml H₂O，加热搅拌溶解。加入180ml甘油后，用NaOH调节PH7.0。用蒸馏水定容500ml，室温保存。

2.实验方法

2.1细胞培养

MDA-MB-231细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％二氧化碳培养，贴壁生长。

2.2细胞传代

在25cm²培养瓶中培养细胞，细胞密度度达到80-90％时进行细胞传代或者接种。吸掉原培养基，加入5mL的PBS润洗，除净PBS后加入0.5mL的胰蛋白酶消化细胞，消化时间依据细胞系种类而定，一般在十几秒到几分钟不等。显微镜下观察至细胞收缩，细胞间空隙增大后加入相应的培养基终止消化，并将细胞均匀吹打，按比例稀释至培养瓶或者接种于培养板中。

2.3细胞冻存

取对数生长期细胞，常规消化收集于15mL离心管中，1200rpm离心5min，弃掉原培养基，加入含5-10％DMSO的培养基重悬，将细胞悬液转入细胞冻存管中并作记录，冻存管置于程序降温盒中于-80℃超低温冰箱中梯度降温。24h后细胞冻存管取出，转移到液氮灌中进行长期保存。

2.4细胞复苏

细胞复苏将冻存的细胞从液氮罐中取出置于37℃水浴锅中，迅速摇动使其快速解冻。解冻后，将细胞转入培养瓶中并补足培养基至5mL，培养24h后更换新鲜培养基，细胞经过两次传代后可供实验用。

2.5 CCK-8法检测化合物hypecocarpine和leptopidine对乳腺癌细胞活力的影响。

将MDA细胞传入96孔板，每个孔内加200μl DMEM培养基，其中加入10％的胎牛血清，放入恒温培养箱内。待细胞贴壁后(6小时左右)，将培养基吸走，加入药物配制为不同药物浓度的培养基，每个浓度重复4次，恒温培养箱中培养24和48小时后，将每个小孔中培养液吸走，加入含10％CCK-8的培养基100mL，培养1.5小时，用酶标仪于450nm波长下测定每孔中的OD值，然后重复一次。上述细胞培养条件均为：37℃，95％空气和5％CO₂的潮湿空气。

2.6 Western blot方法检测化合物hypecocarpine和leptopidine对脂肪酸合酶(FAS)表达的影响。

①细胞培养

将MDA细胞传入直径为6cm的培养皿中，待细胞长满培养皿低，更换培养基并加药，配制为不同药物浓度的培养基，培养24小时后收样。

②样品的收集

将培养好的细胞用冷的PBS洗3次，然后加入200μl RIPA裂解液，混匀5-10min后浆细胞挂下，吸入1.5mL的EP管中，超声破碎(2×3次，超声功率300-500W,超声时间5-8min)，冷冻离心10min，将上清液取出，弃沉淀。以上操作均在4℃下进行。

③BCA法测蛋白浓度

离心后的上清液取1-2μl与96孔板的小孔内，用PBS补到200μl，其中以小孔只加PBS做为空白对照，然后每孔中加入BCA液200μl，然后与590nm条件下测OD值。根据OD值算出蛋白浓度，并把所有样品中蛋白浓度调到一致。加入Loading Buffer，95℃加热10min。

④聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳

根据要检测的蛋白的分子量选取分离胶的浓度，配置分离胶和基层胶，加入蛋白样品和蛋白Marker进行垂直电泳的跑胶。样品在积层胶中于80V的电压下进行电泳，待样品进入分离胶中后，电压调整至100V直至溴酚蓝指示剂(购自北京华科盛精细化工产品贸易有限公司)前端至分离胶底端，终止电泳。

⑤蛋白的膜转移

采用湿转的方法将分离胶上蛋白样品电转至PVDF膜上，于100V下转膜120min或者30V下转膜过夜，转膜时要保持在低温(4℃)环境下进行。

⑥免疫反应

将转有蛋白的PVDF膜用脱脂牛奶常温封闭1-2小时或4℃封闭过夜。用TBSB清洗PVDF膜3次，然后加一抗，4℃条件下敷16小时或常温下4小时。TBSB清洗3次后，加二抗，常温下敷1.5小时后TBST洗膜3次。

⑦化学发光，显影，定影

将1×显影液和定影液分别先倒入塑料盘中，将膜放入X-光片盒中，将A和B两种试剂再EP管中等体积混匀，用移液枪加到蛋白所在位置。在暗室中，在红灯下取出X-光片，放在膜上，一旦放上就不能移动，关上X-光片夹，开始计时。根据信号的强弱调整曝光时间，一般为1-5min，也可以选择不同的时间多次压片，已达到最佳效果。曝光完成后，打开X-光片夹，迅速浸入显影液中，带出现明显条带后，即可终止显影，马上把X-光片放入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片透明为止，用自来水冲洗取出残留定影液后，室温晾干。

2.4实验结果

2.4.1化合物hypecocarpine和leptopidine对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响。

CCK-8比色法检测的结果如图1所示，横坐标为药物在培养基中的浓度。

结果显示，化合物hypecocarpine对乳腺癌细胞增殖的抑制比较弱，而化合物leptopidine对乳腺癌细胞具有较强的细胞毒性，在2μg/mL的时候对乳腺癌细胞的抑制率就已经达到了50％以上，并且呈浓度和时间依赖性。

2.4.2化合物hypecocarpine和leptopidine对脂肪酸合酶FAS表达的影响

Western blot方法检测hypecocarpine和leptopidine对脂肪酸合酶(FAS)表达量的影响结果如图2所示。各组的内参GAPDH蛋白条带一致，说明各组所加样本的蛋白含量基本相同，具有可比性。

结果显示，化合物hypecocarpine和leptopidine对FAS的表达均有抑制作用。其中，化合物leptopidine的抑制作用极为明显。

综上所述，本发明的化合物可以有效抑制FAS表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。同时，本发明化合物原料来源丰富，具有良好的临床应用前景。