本申请根据35U.S.C.§119(e)请求2016年4月4日提交的美国临时申请第62/317,950号且根据35U.S.C.§119(a)-(d)请求2015年8月31日提交的韩国专利申请第10-2015-0122727号的权益，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。关于序列表的表述与本申请相关的序列表是按文本格式提供以代替纸质副本，且以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_066_02WO_ST25.txt。文本文件是38KB，创建于2016年8月30日，并与经由EFS-Web以电子方式提交，同时进行说明书的编档。
技术领域：
本发明涉及改进组合物和用于治疗癌症的方法。更确切地说，本发明涉及包括抗抗STn抗体或其抗原结合片段的改进嵌合抗原受体(CAR)、基因修饰以表达这些CAR的免疫效应细胞以及用以有效地治疗表达STn的癌症的这些组合物的用途。
背景技术：
：唾液酸-Tn抗原(STn)为含有α2,6-连接到GalNAcα-O-Ser/Thr的唾液酸残基的短O-聚糖。STn的生物合成通过被称为ST6GalNAcI的特定唾液酸转移酶来介导，所述特定唾液酸转移酶与O-聚糖竞争拉长糖基转移酶且防止癌细胞展现更长O-聚糖。STn抗原的不同表位在糖蛋白和肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)上表达，所述糖蛋白包含粘蛋白和粘蛋白样蛋白，例如粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白16(MUC16)。STn通过胚胎和正常成年组织微弱地表达，但也通过大于80％的人类癌瘤来表达。STn检测通常与不利结果相关联且降低癌症患者的整体存活率。由于其泛癌瘤表达与不利结果相关联，已针对STn抗原设计了抗癌疫苗(称为Theratope)。尽管围绕这种免疫疗法的热情高涨，Theratope在阶段III临床试验时失败了。用于治疗表达STn的癌症的另一个失败的临床试验使用用嵌合抗原受体(CAR)工程改造的T细胞。细胞基因系统公司(CellGenesys)的科学家在患有转移性结肠癌的患者中使用抗STnCART细胞，所述抗STnCART细胞结合在糖蛋白TAG-72上表达的STn抗原。患者静脉内或肝内输注给予抗STnCART细胞。抗STnCAR不诱导任何抗肿瘤活性。因此，靶向STn的有效免疫疗法策略的潜能尚未实现。技术实现要素：本发明通常提供用于产生T细胞疗法的改进载体和其使用方法。更确切地说，本发明提供抗唾液酸Tn抗原(sTn)CAR分子和其在治疗、预防或改善表达sTn(其表达糖蛋白)的癌症中的用途。在各种实施例中，提供一种包括胞外域的嵌合抗原受体(CAR)，所述胞外域包括：a)抗STn抗体或其抗原结合片段，其结合STn抗原或在糖蛋白上表达的STn抗原的一个或多个表位，其中所述抗STn抗体或其抗原结合片段包括：可变轻链序列，其包括阐述于SEQIDNO:1-3、9-11或17-19中的CDRL1-CDRL3序列；和可变重链序列，其包括阐述于SEQIDNO:4-6、12-14或20-22中的CDRH1-CDRH3序列；b)跨膜域；c)一个或多个胞内共刺激信号传导域；和d)初级信号传导域。在各种实施例中，STn抗原在选自由以下组成的群组的糖蛋白上表达：粘蛋白或粘蛋白样糖蛋白。在特定实施例中，STn抗原在选自由以下组成的群组的粘蛋白上表达：粘蛋白1和粘蛋白16。在某些实施例中，STn抗原在粘蛋白样蛋白上表达。在各种实施例中，粘蛋白样蛋白为TAG-72。在特定实施例中，结合STn抗原的抗STn抗体或抗原结合片段选自由以下组成的群组：骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定型Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb，纳米抗体)。在某些实施例中，结合STn抗原的抗STn抗体或抗原结合片段为scFv。在特定实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:1-3中的任一个中的一个或多个轻链CDR和/或如阐述于SEQIDNO:4-6中的任一个中的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:9-11中的任一个中的一个或多个轻链CDR和/或如阐述于SEQIDNO:12-14中的任一个中的一个或多个重链CDR。在额外实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:17-19中的任一个中的一个或多个轻链CDR和/或如阐述于SEQIDNO:20-22中的任一个中的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:7、15或23中的任一个中的可变轻链序列和/或如阐述于SEQIDNO:8、16或24中的任一个中的可变重链序列。在某些实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:7中的可变轻链序列和/或如阐述于SEQIDNO:8中的可变重链序列。在另外的实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:15中的可变轻链序列和/或如阐述于SEQIDNO:16中的可变重链序列。在特定实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包括如阐述于SEQIDNO:23中的可变轻链序列和/或如阐述于SEQIDNO:24中的可变重链序列。在另外的实施例中，跨膜域来自选自由以下组成的群组的多肽：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1。在额外实施例中，跨膜域来自选自由以下组成的群组的多肽：CD8α；CD4、CD45、PD1以及CD152。在一些实施例中，跨膜域来自CD8α。在另外的实施例中，跨膜域来自PD1。在特定实施例中，跨膜域来自CD152。在另外的实施例中，一个或多个共刺激信号传导域来自选自由以下组成的群组的共刺激分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在某些实施例中，一个或多个共刺激信号传导域来自选自由以下组成的群组的共刺激分子：CD28、CD134以及CD137。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导域来自CD28。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导域来自CD134。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导域来自CD137。在特定实施例中，初级信号传导域从选自由以下组成的群组的多肽分离：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在特定实施例中，初级信号传导域从CD3ζ分离。在额外实施例中，CAR进一步包括铰链区多肽。在某些实施例中，铰链区多肽包括CD8α的铰链区。在另外的实施例中铰链区多肽包括PD1的铰链区。在特定实施例中，铰链区多肽包括CD152的铰链区。在额外实施例中，CAR进一步包括间隔区。在另外的实施例中，间隔区多肽包括IgG1、IgG4或IgD的CH2区和CH3区。在另外的实施例中，CAR进一步包括信号肽。在特定实施例中，信号肽包括IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽或人类GM-CSF受体α信号多肽。在特定实施例中，CAR包括阐述于SEQIDNO:25-27中的任一个中的氨基酸序列。在特定实施例中，CAR包括阐述于SEQIDNO:25中的氨基酸序列。在特定实施例中，CAR包括阐述于SEQIDNO:26中的氨基酸序列。在特定实施例中，CAR包括阐述于SEQIDNO:27中的氨基酸序列。在各种实施例中，提供包括本文中所涵盖的CAR的氨基酸序列的多肽。在各种实施例中，提供编码本文中所涵盖的CAR的聚核苷酸。在各种实施例中，提供包括编码本文中所涵盖的CAR的聚核苷酸的载体。在某些实施例中，载体为表达载体。在特定实施例中，载体为游离型载体。在另外的实施例中，载体为病毒载体。在另外的实施例中，载体为逆转录病毒载体。在特定实施例中，载体为慢病毒载体。在另外的实施例中，慢病毒载体选自主要由以下组成的群组：人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)；人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在特定实施例中，载体包括左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件；可操作地连接到聚核苷酸的启动子；以及右(3')逆转录病毒LTR。在另外的实施例中，载体进一步包括异源聚腺苷酸化序列。在特定实施例中，载体进一步包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)。在额外实施例中，用异源启动子置换5'LTR的启动子。在另外的实施例中，异源启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施例中，5'LTR或3'LTR为慢病毒LTR。在某些实施例中，3'LTR包括一个或多个修饰。在某些实施例中，3'LTR包括一个或多个缺失。在特定实施例中，3'LTR为自我失活(SIN)LTR。在特定实施例中，聚腺苷酸化序列为牛生长激素聚腺苷酸化序列或信号兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列。在额外实施例中，聚核苷酸包括优化后的Kozak序列。在额外实施例中，可操作地连接到聚核苷酸的启动子选自由以下组成的群组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)以及骨髓增生肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子。在各种实施例中，提供包括编码本文中所涵盖的CAR的载体的免疫效应细胞。在特定实施例中，免疫效应细胞选自由以下组成的群组：T淋巴细胞、自然杀手T(NKT)细胞以及自然杀手(NK)细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞用本文中所涵盖的载体转导且在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激，由此与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的转导免疫效应细胞的增殖相比维持所述转导免疫效应细胞的增殖。在特定实施例中，在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激的免疫效应细胞增加以下的表达：i)选自由CD62L、CD127、CD197以及CD38组成的群组的一个或多个标记；或ii)与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的免疫效应细胞相比的所有标记CD62L、CD127、CD197以及CD38。在特定实施例中，在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激的免疫效应细胞增加以下的表达：i)选自CD62L、CD127、CD27以及CD8组成的群组的一个或多个标记；或ii)与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的免疫效应细胞相比的所有标记CD62L、CD127、CD27以及CD8。在一个实施例中，PI3K抑制剂为ZSTK474。在各种实施例中，提供一种包括本文中所涵盖的免疫效应细胞和生理学上可接受的赋形剂的组合物。在各种实施例中，提供一种产生包括本文中所涵盖的CAR的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码本文中所涵盖的CAR的载体引入至免疫效应细胞中。在特定实施例中，所述方法进一步包括刺激免疫效应细胞且通过使细胞与结合CD3的抗体和与CD28结合的抗体接触来诱导细胞增殖；由此产生免疫效应细胞群。在某些实施例中，在引入载体之前，刺激免疫效应细胞并诱导其增殖。在额外实施例中，免疫效应细胞包括T淋巴细胞。在一些实施例中，T淋巴细胞包括自然杀手T(NKT)细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包括NK细胞。在特定实施例中，在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激细胞，由此与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的免疫效应细胞的增殖相比维持转导免疫效应细胞的增殖。在一些实施例中，在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激的免疫效应细胞增加以下的表达：i)选自由CD62L、CD127、CD197以及CD38组成的群组的一个或多个标记；或ii)与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的免疫效应细胞相比的所有标记CD62L、CD127、CD197以及CD38。在特定实施例中，在PI3K途径的抑制剂的存在下活化和刺激的免疫效应细胞增加以下的表达：i)选自CD62L、CD127、CD27以及CD8组成的群组的一个或多个标记；或ii)与在PI3K途径的抑制剂的不存在下活化和刺激的免疫效应细胞相比的所有标记CD62L、CD127、CD27以及CD8。在一个实施例中，PI3K抑制剂为ZSTK474。在各种实施例中，提供用于增加个体中的在糖蛋白上表达STn的癌细胞中的细胞毒性的方法，所述方法包括向个体投予一定量的本文中所涵盖的组合物，所述量足以使表达STn的癌细胞中的细胞毒性相比在投予之前的表达STn的癌细胞的细胞毒性增加。在各种实施例中，提供一种用于减少个体中的在糖蛋白上表达STn的癌细胞数目的方法，所述方法包括向个体投予一定量的本文中所涵盖的组合物，所述量足以使表达STn的癌细胞数目相比在投予之前的表达STn的癌细胞数目减少。在各种实施例中，提供一种治疗有需要的个体的癌症的方法，所述方法包括向个体投予治疗上有效量的本文中所涵盖的组合物。在特定实施例中，癌症为实体癌症。在另外的实施例中，癌症为食道癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰脏癌、胆管癌、胃癌、结肠癌或乳腺癌。在一个实施例中，癌症为食道癌。在一个实施例中，癌症为膀胱癌。在一个实施例中，癌症为肾癌。在一个实施例中，癌症为肺癌。在一个实施例中，癌症为卵巢癌。在一个实施例中，癌症为宫颈癌。在一个实施例中，癌症为胰脏癌。在一个实施例中，癌症为胆管癌。在一个实施例中，癌症为胃癌。在一个实施例中，癌症为结肠癌。在一个实施例中，癌症为乳癌。在特定实施例中，癌症为液体癌症。在一个实施例中，液体癌症为血液恶性病。在一个实施例中，血液恶性病选自由以下组成的群组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛状细胞白血病(HCL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性骨髓白血病(AML)或慢性骨髓白血病(CML)。在一个实施例中，血液恶性病为CLL。在各种实施例中，提供一种用于改善个体中的与在糖蛋白上表达STn的癌症相关联的至少一种或多种症状的方法，所述方法包括向个体投予一定量的本文中所涵盖的组合物，所述量足以改善与表达STn的癌细胞相关联的至少一种症状。在特定实施例中，所改善的一种或多种症状选自由以下组成的群组：虚弱、疲乏、呼吸急促、容易擦伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹胀或腹痛、骨痛或关节痛、骨折、体重突然下降、食欲不振、盗汗、持续轻度发烧以及排尿减少。在前述实施例中的任一个中，STn抗原在糖蛋白、TAG-72上表达。附图说明图1展示抗STnCAR构建体的示意图。图2展示抗STnCART细胞(E)但不是未转导的对照T细胞以不同E:T比率在共培养时杀死表达STn的LS174T细胞(T)。图3A展示用编码抗STnCAR的慢病毒载体转导的T细胞中的载体拷贝数(VCN)。图3B展示用编码抗STnCAR的慢病毒载体转导的T细胞中的抗STnCAR的细胞表面表达。图4展示示范性抗STnCAR的抗癌活性。图4A：当与在TAG72上表达STn的Jurkat和LS174T细胞系共培养时，抗STnCART细胞分泌IFNγ。图4B：抗STnCART细胞但不是未转导的T细胞在共培养时杀死LS174T细胞系。图4C：当以不同E:T比率与LS174T细胞(T)共培养时，抗STnCART细胞(E)展示剂量依赖性细胞毒性。图5展示投予抗STnCART细胞延迟接受皮下结肠腺癌细胞(LS174T)的NODscidγ(NSG)小鼠中的肿瘤生长。序列标识符的简要说明SEQIDNO:1-24阐述本文中所涵盖的抗STnCAR的示范性轻链CDR序列、重链CDR序列、可变域轻链和可变域重链的氨基酸序列。SEQIDNO:25-27阐述示范性抗STnCAR的氨基酸序列。SEQIDNO:28-38阐述不同连接子的氨基酸序列。SEQIDNO:39-51阐述蛋白酶裂解位点和自我裂解的多肽裂解位点的氨基酸序列。SEQIDNO:52阐述人类肿瘤相关的糖蛋白(TAG-72)的氨基酸序列。SEQIDNO:53阐述用于确定CDR-L3的示范性规则的氨基酸序列。SEQIDNO:54阐述用于确定CDR-H1的示范性规则的氨基酸序列。SEQIDNO:55阐述用于确定CDR-H2的示范性规则的氨基酸序列。SEQIDNO:56阐述用于确定CDR-H3的示范性规则的氨基酸序列。SEQIDNO:57阐述共有Kozak序列的核苷酸序列。具体实施方式A.概述本发明大体上涉及用于预防或治疗在糖蛋白上表达STn抗原的癌症，或预防、治疗或改善与表达STn的癌症相关联的至少一种症状的改进组合物和方法。在特定实施例中，本发明涉及使用遗传修饰的免疫效应细胞的在糖蛋白上表达STn抗原的癌症的改进过继性细胞疗法。遗传方法提供增强免疫识别和癌细胞消除的潜在手段一个有前景的策略为遗传工程改造免疫效应细胞以表达对癌细胞重导引细胞毒性的嵌合抗原受体(CAR)。本文中所涵盖过继性细胞疗法的改进组合物和方法提供可易于扩增的遗传修饰的免疫效应细胞，展现活体内的长期存留性且证实对在糖蛋白上表达唾液酸Tn抗原(STn)的细胞的抗原相关细胞毒性。STn(Neu5Acα2-6GalNAcα-O-Ser/Thr)也称为CD175s且为最简单唾液酸化粘蛋白型O-聚糖。STn为由α-O-连接到丝氨酸或苏氨酸残基的N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)的一个残基形成，且由碳6上的唾液酸(人类中的Neu5Ac)取代的二糖。这种唾液酸化防止形成在粘蛋白型O-聚糖中另外发现的各种核心结构。STn在胚胎组织中表达，例如来自两种性别的胎儿的食道、胃、胰脏、结肠(杯状细胞)、肺、乳房腺和性腺组织。然而，对胚胎发育期间STn的生物作用知道的很少。已进行各种研究，报道正常组织中的STn表达与癌组织相比是稀少的和/或低的。免疫组织化学证实与所匹配的健康细胞相比的癌细胞中的STn过表达。因此，STn被描述为肿瘤胚胎抗原。STn新表达或过度表达报道于许多上皮癌症中，其中在胰脏癌、膀胱癌、肺癌、结肠直肠癌以及卵巢癌中频率最高。在癌发生早期，据报道STn在被认为是癌症的潜在性前驱体的若干上皮良性病变中过度表达，例如食道发育异常鳞状上皮、胃肠化生、结肠中度异常增生、肺非典型腺瘤样增生、乳房乳腺管增生以及顶泌化生。STn表达也报道于胰脏和卵巢的良性病变中，这两个组织在健康状态中没有STn表达。还报道将STn表达与胃(胃炎)或结肠(溃疡性结肠炎和克罗恩氏结肠炎(Crohn'scolitis))的发炎性疾病联系起来。在胃炎中，在50-100％的病例中检测到STn。在溃疡性结肠炎中，显示脱-O-乙酰化STn为异常增生癌瘤序列的独立标记。在44％的克罗恩氏结肠炎(与结肠癌风险相关联的另一种发炎性疾病)病例中也检测到脱-O-乙酰化STn。在各种实施例中，包括抗STn抗体序列的CAR为高度有效的；经历稳健的活体内扩增；且识别在糖蛋白上表达STn的癌细胞并展示针对表达STn的癌细胞的细胞毒性活性。STn抗原在包含(但不限于)以下的各种实体肿瘤中高度表达：食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰脏癌、胆管癌、胃癌、结肠癌以及乳腺癌。在一个实施例中，提供包括抗STn抗体或抗原结合片段、跨膜域以及一个或多个胞内信号传导域的CAR。在一个实施例中，遗传修饰免疫效应细胞以表达CAR。表达CAR的T细胞在本文中被称作CART细胞或CAR修饰的T细胞。在各种实施例中，向具有在糖蛋白上表达STn的癌细胞(包含但不限于实体肿瘤和血液恶性病)的患者投予遗传修饰的免疫效应细胞。除非在相反意义上特别指出，否则特定实施例的实践将采用所属领域的技术内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，其中许多出于说明的目的在下文进行描述。在文献中全面解释了这些技术。参看例如：Sambrook等人,《分子克隆：实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual)》(第三版,2001)；Sambrook等人,《分子克隆：实验指南》(第二版，1989)；Maniatis等人,《分子克隆：实验指南》(1982)；Ausubel等人,《现代分子生物学实验技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology)》(约翰·威利父子出版公司(JohnWileyandSons),2008年7月更新)；《短分子生物学方案：来自现代分子生物学实验技术的方法概略(ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology)》,格林出版社联合公司和威立国际科学(GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆实用方法(DNACloning:APracticalApproach)》,第I卷和第II卷(牛津布,IRL出版社(IRLPress),1985)；Anand,《用于分析复合物基因组的技术(TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes)》(纽约(NewYork),学术出版社(AcademicPress),1992)；《转录与转译(TranscriptionandTranslation)》(B.Hames和S.Higgins编,1984)；Perbal,《分子克隆实践指南(APracticalGuidetoMolecularCloning)》(1984)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》(纽约冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.),冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),1998)；《免疫学最新方案(CurrentProtocolsinImmunology)》(Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach以及W.Strober编,1991)；《免疫学年度评述(AnnualReviewofImmunology)》；以及在例如《免疫学发展(AdvancesinImmunology)》的杂志上的专论。B.定义除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文中所描述的那些类似或相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施例，但在本文中描述组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，下文定义以下术语。本文中所使用的冠词“一(a/an)”和“所述”指的是冠词的一个或多于一个(即，至少一个或一个或多个)语法对象。借助于实例，“一元件”意味着一个元件或一个或多个元件。替代(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代方案的一个或两个。如本文中所使用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则措辞“包括(comprise/comprises/comprising)”将理解成暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素的群组。“由……组成”意指包含并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为需要或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其它要素。因此，短语“基本由…组成”指示所列要素是必需的或必选的，但不存在实质上影响所列要素的活动或动作的其它要素。在整个本说明书中，参考“一个实施例”、“一实施例”、“一特定实施例”、“一相关实施例”、“某一实施例”、“一额外实施例”或“一另外实施例”或其组合意指与实施例结合描述的特定特征、结构或特性包含于至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部参考同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，特定特征、结构或特性可以任何合适方式组合。还应理解，一个实施例中的特征的正面引述充当用于排除一特定实施例中的特征的依据。STn(Neu5Acα2-6GalNAcα-O-Ser/Thr)也称为CD175s且为最简单唾液酸化粘蛋白型O-聚糖。STn为由α-O-连接到丝氨酸或苏氨酸残基的N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)的一个残基形成，且由碳6上的唾液酸(人类中的Neu5Ac)取代的二糖。这种唾液酸化防止形成在粘蛋白型O-聚糖中另外发现的各种核心结构。在各种实施例中，STn抗原在选自由以下组成的群组的糖蛋白上表达：粘蛋白或粘蛋白样糖蛋白。在特定实施例中，STn抗原在选自由以下组成的群组的粘蛋白上表达：粘蛋白1和粘蛋白16。在某些实施例中，STn抗原在粘蛋白样蛋白上表达。在各种实施例中，粘蛋白样蛋白为TAG-72。C.嵌合抗原受体在各种实施例中，提供对表达STn抗原的癌细胞重导引免疫效应细胞的细胞毒性的遗传工程改造的受体。这些遗传工程改造的受体在本文中被称作嵌合抗原受体(CAR)。CAR为将用于所需抗原(例如，在糖蛋白上表达的STn)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化胞内域组合以产生展现特异性抗STn细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文中所使用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或DNA的部分组成。在特定实施例中，CAR包括与STn结合的胞外域(也被称作结合域或抗原特异性结合域)、跨膜域以及胞内信号传导域。CAR的抗STn抗原结合域与STn结合糖蛋白(例如，TAG-72)在靶细胞的表面上接合导致CAR的集群且向含CAR的细胞传递活化刺激。CAR的主要特性为其重导引免疫效应细胞特异性的能力，由此以主要组织相容(MHC)独立方式触发增殖、细胞因子产生、噬菌作用或产生可介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡的分子，利用单克隆抗体、可溶配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。在各种实施例中，CAR包括胞外结合域(包括STn特异性结合域)；跨膜域；一个或多个胞内共刺激信号传导域；以及初级信号传导域。在特定实施例中，CAR包括胞外结合域(包括抗STn抗体或其抗原结合片段)；一个或多个铰链域或间隔域；跨膜域；一个或多个胞内共刺激信号传导域；以及初级信号传导域。1.结合域在特定实施例中，CAR包括胞外结合域，所述胞外结合域包括与在靶细胞(例如，癌细胞)上表达的人类STn结合糖蛋白特异性结合的抗STn抗体或其抗原结合片段。如本文中所使用，术语“结合域”、“胞外域”、“胞外结合域”、“抗原特异性结合域”以及“胞外抗原特异性结合域”可互换地使用并提供具有与所关注靶抗原(例如，STn)特异性结合的能力的CAR。结合域可源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。如本文中所使用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specificallybinds/specificallybound/specificbinding)”或“特异性靶向”描述抗STn抗体或其抗原结合片段(或包括其的CAR)以比背景结合更大的结合亲和力与STn的结合。如果结合域以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，以1/M单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)与STn结合或缔合，那么所述结合域(或包括结合域的CAR或含有结合域的融合蛋白)与STn结合糖蛋白(例如TAG-72)“特异性地结合”。在某些实施例中，结合域(或其融合蛋白)以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka与靶标结合。“高亲和力”结合域(或其单链融合蛋白)是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大的Ka的那些结合域。替代地，可将亲和力定义为以M(例如，10-5M到10-13M或更低)为单位的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。根据本公开的结合域多肽和CAR蛋白的亲和力可例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附分析)或通过结合缔合或使用标记的配体的置换分析或使用表面等离子共振装置(例如BiacoreT100，其购自新泽西州皮斯卡塔威(Piscataway,NJ)Biacore有限公司)或光学生物传感器技术(例如EPIC系统或EnSpire，其分别地购自康宁(Corning)和珀金埃尔默(PerkinElmer))使用常规技术来轻易地测定(还参看例如Scatchard等人(1949)《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》51:660；美国专利案第5,283,173号、第5,468,614号或等效物)。在一个实施例中，特异性结合的亲和力比背景结合大约2倍，比背景结合大约5倍，比背景结合大约10倍，比背景结合大约20倍，比背景结合大约50倍，比背景结合大约100倍或比背景结合大约1000倍或更大。在特定实施例中，CAR的胞外结合域包括抗体或其抗原结合片段。“抗体”是指结合剂，所述结合剂是至少包括轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性地识别且结合抗原(例如脂质、碳水化合物、多糖或、糖蛋白、肽或含有抗原决定簇的核酸)的表位，例如通过免疫细胞所识别的那些抗原。“抗原(Ag)”是指可刺激动物中的抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注入或吸收到动物中的组合物(例如包含癌症特异性蛋白质的组合物)。示范性抗原包含(但不限于)脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物反应，所述产物包含通过异源抗原(例如所公开的抗原)诱导的那些产物。在特定实施例中，靶抗原为STn抗原。“表位”或“抗原决定簇”是指与结合剂结合的抗原的区。抗体包含其抗原结合片段，例如骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv蛋白质(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定型Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb，纳米抗体)和对抗原结合负责的全长抗体的部分。术语还包含遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如，人类化鼠抗体)、异结合抗体(例如，双特异性抗体)以及其抗原结合片段。还参看《皮尔斯目录与手册(PierceCatalogandHandbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL)皮尔斯化学公司(PierceChemicalCo.))；Kuby,J.,《免疫学(Immunology)》,第3版,纽约(NewYork),W.H.Freeman公司,1997。如将通过所属领域的技术人员所理解和如本文中其它地方所描述，完整抗体包括两个重链和两个轻链。每个重链由可变区以及第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区组成，而每个轻链由可变区和恒定区组成。将哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ以及μ。将哺乳动物轻链分类为λ和κ。将包括α、δ、ε、γ以及μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG以及IgM。完整抗体形成“Y”形。Y的茎由结合在一起的两个重链的第二恒定区和第三恒定区(且对于IgE和IgM，第四恒定区)组成，且二硫键(链间)形成于铰链中。重链γ、α和δ具有由三个串联(呈一行)Ig域组成的恒定区和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白域组成的恒定区。第二恒定区和第三恒定区分别被称作“CH2域”和“CH3域”。Y的每个臂包含与单个轻链的可变区和恒定区结合的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区对抗原结合负责。轻链和重链可变区含有间杂有三个高变区(也被称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。CDR可通过常规方法来定义或鉴别，例如通过根据Kabat等人的序列(Wu,TT和Kabat,E.A.,《实验医学杂志(JExpMed.)》132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和KabatE.A.,《美国国家科学院院刊》,84:2440-2443(1987)；(参看Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)》,美国卫生和人类服务部门(DepartmentofHealthandHumanServices),1991,其在此以引用的方式并入)，或通过根据Chothia等人的结构(Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(JMol.Biol.)》,196(4):901-917(1987),Chothia,C.等人,《自然(Nature)》,342:877-883(1989))。用于预测轻链CDR的规则的说明性实例包含：CDR-L1以约残基24开始，前面是Cys，为约10到17个残基，且接着为Trp(通常是Trp-Tyr-Gln，以及Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)；CDR-L2以CDR-L1的末端后的约16个残基开始，前面通常是Ile-Tyr，以及Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe，且为7个残基；以及CDR-L3以CDR-L2末端后的约33个残基开始，前面是Cys，为7到11个残基，且接着为Phe-Gly-XXX-Gly(XXX是任何氨基酸；SEQIDNO:53)。用于预测重链CDR的规则的说明性实例包含：CDR-H1以约残基26开始，前面是Cys-XXX-XXX-XXX(SEQIDNO:54)，为10到12个残基，且接着为Trp(通常是Trp-Val、以及Trp-Ile、Trp-Ala)；CDR-H2以CDR-H1的末端后的约15个残基开始，前面通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQIDNO:55)或数个变异体，为16到19个残基，且接着为Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala；以及CDR-H3以CDR-H2的末端后的约33个残基开始，前面是Cys-XXX-XXX(通常为Cys-Ala-Arg)，为3到25个残基，且接着为Trp-Gly-XXX-Gly(SEQIDNO:56)。在一个实施例中，根据Kabat方法测定轻链CDR和重链CDR。在一个实施例中，根据Kabat方法测定轻链CDR和重链CDR2和CDR3，且根据AbM方法测定重链CDR1，所述AbM方法是包括Kabat方法和Chothia方法，参看例如WhiteleggN及ReesAR,《蛋白质工程(ProteinEng.)》2000年12月；13(12):819-24和《分子生物学方法(MethodsMolBiol.)》2004；248:51-91。用于预测CDR的程序是公开可用的，例如AbYsis(www.bioinf.org.uk/abysis/)。不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其是成分轻链和重链的组合构架区)用于在三维空间中定位和对准CDR。CDR主要负责用于与抗原的表位结合。每个链的CDR通常称作CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依序编号，并且也通常通过特定CDR所位于的链鉴别。因此，位于抗体的重链的可变域中的CDR被称作CDRH1、CDRH2以及CDRH3，而位于抗体的轻链的可变域中的CDR被称作CDRL1、CDRL2以及CDRL3。具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的轻链CDR的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的CDR序列：SEQIDNO:1-3、9-11以及17-19。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的重链CDR的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的CDR序列：SEQIDNO:4-6、12-14以及20-22。参考“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所公开的其它抗体片段的免疫球蛋白轻链的可变区。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的轻链可变区的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的轻链可变区序列：SEQIDNO:7、15以及23。参考“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所公开的其它抗体片段的免疫球蛋白重链的可变区。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的重链可变区的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的重链可变区序列：SEQIDNO:8、16以及24。“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单克隆体或由其中已转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体由所属领域的技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合形成杂交抗体形成型细胞而产生。单克隆抗体包含人类化单克隆抗体。“嵌合抗体”具有来自一个物种(例如人类)的构架残基和来自另一物种(例如小鼠)的CDR(其通常赋予抗原结合)。在特定优选实施例中，CAR包括是嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合域。在优选实施例中，抗体是与表达糖蛋白的人类STn特异性结合的人类抗体(例如人类单克隆抗体)或其片段。可通过组合选自人类衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与如上文所描述的已知人类恒定域序列来构建人类抗体。替代地，人类单克隆抗体可通过融合瘤方法制得。已例如通过以下描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系：Kozbor《免疫学杂志(J.Immunol.)》,133:3001(1984)；Brodeur等人,《单克隆抗体产生技术和应用(MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications)》,第51-63页(纽约马塞尔德克尔有限公司(MarcelDekker,Inc.),1987)；以及Boerner等人,《免疫学杂志》,147:86(1991)。另外，在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下，转基因动物(例如，小鼠)可用于产生完整人类抗体库。参看例如Jakobovits等人,《美国国家科学院院刊》,90:2551(1993)；Jakobovits等人,《自然》,362:255(1993)；Bruggermann等人,《免疫学年鉴(YearinImmunol.)》,7:33(1993)。基因改组也可用于衍生来自非人类的人类抗体(例如，啮齿动物抗体)，其中人类抗体具有与起始非人类抗体类似的亲和力和特异性。(参看1993年4月1日公布的PCTWO93/06213。)不同于通过CDR移植进行的非人类抗体的传统人类化，这种技术提供完整人类抗体，其不具有非人类来源的FR或CDR残基。在一个实施例中，CAR包括“人类化”抗体。人类化抗体是包含人类构架区和来自非人类(例如，小鼠、大鼠或合成物)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供构架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施例中，所有CDR都来自人类化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但是如果其存在，那么其必须大体上等同于人类免疫球蛋白恒定区，即至少约85-90％，例如约95％或更高一致性。因此，有可能除CDR以外，人类化免疫球蛋白的所有部分与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分大体上一致。人类化或其它单克隆抗体可具有额外保守性氨基酸取代，其大体上对抗原结合或其它免疫球蛋白功能没有影响。可借助于基因工程改造来构建人类化抗体(参看例如美国专利第5,585,089号)。在特定实施例中，抗STn抗体或其抗原结合片段包含(但不限于)：骆驼Ig(骆驼科抗体(VHH))、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定型Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb，纳米抗体)。如本文中所使用的“骆驼Ig”或“骆驼科VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人,《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEBJ.)》,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼科抗体”是指含有两个VH域和无轻链的抗体(RiechmannL.等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,231:25-38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。“免疫球蛋白新抗原受体”的“IgNAR”是指来自鲨鱼免疫抗体库的抗体的种类，所述鲨鱼免疫抗体库由一个可变新抗原受体(VNAR)域和五个恒定新抗原受体(CNAR)域的同源二聚体组成。IgNAR表示最小已知的基于免疫球蛋白的蛋白质架构中的一些且为高度稳定的并具有有效结合特性。固有稳定性可归因于以下两者：(i)底层Ig架构，与在鼠类抗体中发现的常规抗体VH域和VL域相比，其呈现相当大的数目的带电残基和亲水性表面暴露残基；和(ii)在包含环间二硫桥的互补决定区(CDR)环中的稳定结构特征和环内氢键的模式。抗体的木瓜蛋白酶消化产生：两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)，其各自具有单个抗原结合位点；和残余“Fc”片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理得到F(ab′)2片段，其具有两个抗原组合位点且仍然能够交联抗原。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv物质由呈紧密、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物质中，一个重链可变域与一个轻链可变域可以通过柔性肽连接子共价地连接，使得轻链和重链可以类似于双链Fv物质中的结构的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变域的三个高变区(HVR)相互作用以界定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或仅包括对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但呈比整个结合位点更低的亲和力。Fab片段含有重链可变域和轻链可变域且还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1域的羧基末端增添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基载有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初产生为在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包括在相同多肽链(VH-VL)中连接到轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的连接子，迫使所述域与另一条链的互补域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可为二价或双特异性的。双功能抗体更完全地描述于以下中：例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,《自然医学(Nat.Med.)》,9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》90:6444-6448(1993)。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人,《自然医学》9:129-134(2003)中。“单域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”是指由抗体重链的可变区(VH域)或抗体轻链的可变区(VL域)组成的抗体片段(Holt,L.等人,《生物技术趋势(TrendsinBiotechnology)》,21(11):484-490)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH域和VL域，其中这些域存在于单个多肽链中且在任一定向(例如，VL-VH或VH-VL)上。一般来说，scFv多肽进一步包括在VH域与VL域之间的多肽连接子，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所要结构。关于scFv的综述，参看例如Pluckthün,《单克隆抗体的药理学(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编(纽约(NewYork),施普林格出版社(Springer-Verlag),1994),第269-315页。在优选实施例中，CAR包括为scFv的抗原特异性结合域且可为鼠类、人类或人类化scFv。可从对所要靶标具有特异性的融合瘤的V区基因克隆单链抗体。这类融合瘤的产生已变为例程。可用于克隆可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)的技术已描述于例如Orlandi等人,《美国国家科学院院刊》,1989；86:3833-3837中。在特定实施例中，抗原特异性结合域是结合表达STn的人类糖蛋白的scFv。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的可变轻链的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的氨基酸序列：SEQIDNO:7、15以及23。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的可变重链的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的氨基酸序列：SEQIDNO:8、16以及24。示范性STn特异性结合域是对包括至少一个人类构架区的STn具有特异性的免疫球蛋白可变区。“人类构架区”是指：人类免疫球蛋白可变区的野生型(即，天然存在的)构架区；人类免疫球蛋白可变区的更改构架区，其中所述区的少于约50％(例如，优选地少于约45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的氨基酸缺失或被取代(例如，其中在对应位置处有非人类免疫球蛋白构架区的一个或多个氨基酸残基)；或非人类免疫球蛋白可变区的更改构架区，其中所述区中的少于约50％(例如，少于45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的氨基酸缺失或被取代(例如，在暴露的残基的位置处和/或其中在对应位置处有人类免疫球蛋白构架区的一个或多个氨基酸残基)，使得在一个实施例中，减轻免疫原性。在某些实施例中，人类构架区是人类免疫球蛋白可变区的野生型构架区。在某些其它实施例中，人类构架区是人类免疫球蛋白可变区的更改构架区，其中在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置处有氨基酸缺失或取代。在其它实施例中，人类构架区是非人类免疫球蛋白可变区的更改构架区，其中在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置处有氨基酸缺失或取代。在特定实施例中，STn特异性结合域包括至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个人类构架区(FR)，所述人类构架区选自人类轻链FR1、人类重链FR1、人类轻链FR2、人类重链FR2、人类轻链FR3、人类重链FR3、人类轻链FR4以及人类重链FR4。可存在于STn特异性结合域中的人类FR还包含本文中所提供的示范性FR的变异体，其中示范性FR的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸被取代或缺失。在某些实施例中，STn特异性结合域包括：(a)人类化轻链可变区，其包括人类轻链FR1、人类轻链FR2、人类轻链FR3以及人类轻链FR4；和(b)人类化重链可变区，其包括人类重链FR1、人类重链FR2、人类重链FR3以及人类重链FR4。本文中所提供的STn特异性结合域还包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。这些CDR可为选自轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的CDRH1、CDRH2和CDRH3的非人类CDR或更改非人类CDR。在某些实施例中，STn特异性结合域包括：(a)轻链可变区，其包括轻链CDRL1、轻链CDRL2以及轻链CDRL3；和(b)重链可变区，其包括重链CDRH1、重链CDRH2以及重链CDRH3。在一个实施例中，STn特异性结合域包括阐述于以下中的轻链CDR序列：SEQIDNO:1-3、9-11或17-19。在一特定实施例中，STn特异性结合域包括与阐述于以下中的轻链CDR序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸一致性的轻链CDR序列：SEQIDNO:1-3、9-11或17-19。在一个实施例中，STn特异性结合域包括阐述于以下中的重链CDR序列：SEQIDNO:4-6、12-14或20-22。在一特定实施例中，STn特异性结合域包括与阐述于以下中的重链CDR序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸一致性的重链CDR序列：SEQIDNO:4-6、12-14或20-22。参考“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所公开的其它抗体片段的免疫球蛋白轻链的可变区。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的轻链可变区的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的轻链可变区序列：SEQIDNO:7、15或23。参考“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所公开的其它抗体片段的免疫球蛋白重链的可变区。适用于构建本文中所涵盖的抗STnCAR的重链可变区的说明性实例包含(但不限于)阐述于以下中的重链可变区序列：SEQIDNO:8、16或24。2.连接子在某些实施例中，CAR包括针对分子的合适间隔和构形添加的各种域(例如，VH域与VL域之间)的连接子残基。在特定实施例中，连接子是可变区连接序列。“可变区连接序列”是连接VH域和VL域且提供与两个子结合域的相互作用相容的间隔功能的氨基酸序列，使得所得多肽保留对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。在特定实施例中，连接子隔开一个或多个重链可变域或轻链可变域、铰链域、跨膜域、共刺激域和/或初级信号传导域。CAR包括一个、两个、三个、四个或五个或多于五个连接子。在特定实施例中，连接子的长度是约1到约25个氨基酸、约5到约20个氨基酸或约10到约20个氨基酸或任何中间长度的氨基酸。在一些实施例中，连接子长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸。连接子的说明性实例包含：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n为至少一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及在所属领域中已知的其它柔性连接子。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对地非结构化，且因此可能能够充当融合蛋白(例如本文中所描述的CAR)的域之间的中性系栓。甘氨酸比甚至丙氨酸明显地获得更多的空间，且比具有较长侧链的残基更少的受限(参看Scheraga,《计算化学综述(Rev.ComputationalChem.)》11173-142(1992))。所属领域的一般技术人员将识别特定实施例中的CAR的设计可包含为全部或部分地柔性的连接子，使得连接子可包含柔性连接子以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分，以提供所要CAR结构。其它示范性连接子包含(但不限于)以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQIDNO:28)；TGEKP(SEQIDNO:29)(参看例如Liu等人,《美国国家科学院院刊》5525-5530(1997))；GGRR(SEQIDNO:30)(Pomerantz等人,1995,同前文献)；(GGGGS)n(其中n＝1、2、3、4或5)(SEQIDNO:31)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQIDNO:32)(Chaudhary等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQIDNO:33)(Bird等人,1988，《科学(Science)》242:423-426)；GGRRGGGS(SEQIDNO:34)；LRQRDGERP(SEQIDNO:35)；LRQKDGGGSERP(SEQIDNO:36)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQIDNO:37)。替代地，可使用能够建模DNA结合位点和肽本身两个的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993)；《美国国家科学院院刊》91:11099-11103(1994))或通过噬菌体展示方法来合理地设计柔性连接子。在一个实施例中，连接子包括以下氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQIDNO:38)(Cooper等人,《血液(Blood)》,101(4):1637-1644(2003))。3.间隔域在特定实施例中，CAR的结合域后跟着一个或多个“间隔域”，所述间隔域是指将抗原结合域从效应细胞表面移开以实现恰当细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区(Patel等人,《基因疗法(GeneTherapy)》,1999；6:412-419)。间隔域可来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。在某些实施例中，间隔域是免疫球蛋白的一部分，包含(但不限于)一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔域可包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或更改免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一个实施例中，间隔域包括IgG1、IgG4或IgD的CH2域和CH3域。4.铰链域CAR的结合域通常后跟着一个或多个“铰链域”，所述铰链域在远离效应细胞表面定位抗原结合域以实现恰当细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。CAR通常包括在结合域与跨膜域(TM)之间的一个或多个铰链域。铰链域可来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。铰链域可包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或更改免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。“更改铰链区”是指：(a)具有高达30％氨基酸变化(例如，高达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链区；(b)长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分，其具有高达30％氨基酸变化(例如，高达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)；或(c)天然存在的铰链区的一部分，其包括核心铰链区(其长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施例中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可由一个或多个其它氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。更改免疫球蛋白铰链区可替代地或另外具有由另一氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。适用于本文中所描述的CAR的说明性铰链域包含来源于1型膜蛋白(例如CD8α和CD4)的胞外区的铰链区，其可为来自这些分子的野生型铰链区或可被更改。在另一实施例中，铰链域包括CD8α铰链区。在一个实施例中，铰链是PD-1铰链或CD152铰链。5.跨膜(TM)域“跨膜域”是融合胞外结合部分和胞内信号传导域且将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜的CAR的部分。TM域可来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。TM域可来源于(即，至少包括)T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1的跨膜区。在一特定实施例中，TM域是合成物且主要包括例如白氨酸和缬氨酸的疏水性残基。在一个实施例中，CAR包括来源于PD1、CD152或CD8α的TM域。在另一实施例中，CAR包括来源于PD1、CD152或CD8α的TM域和较短寡聚连接子或多肽连接子，优选地连接CAR的TM域与胞内信号传导域的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个之间的氨基酸。基于甘氨酸-丝氨酸的连接子提供尤其适合的连接子。6.胞内信号传导域在特定实施例中，CAR包括胞内信号传导域。“胞内信号传导域”是指参与将与人类TAG-72多肽结合的有效抗STnCAR的消息转导到免疫效应细胞的内部中以引发效应细胞功能(例如，活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性)的CAR的部分，所述效应细胞功能包含释放细胞毒性因子到结合CAR的靶细胞，或用与胞外CAR域结合的抗原引发的其它细胞应答。术语“效应功能”是指免疫效应细胞的特定功能。T细胞的效应功能例如可为溶细胞活性或包含细胞因子的分泌的帮助或活性。因此，术语“胞内信号传导域”是指转导效应功能信号且导引细胞以执行特定功能的蛋白质的部分。尽管通常可以采用整个胞内信号传导域，在多数情况下不必使用整个域。针对使用胞内信号传导域的截断部分的程度，只要所述胞内信号传导域的截断部分转导效应功能信号，这类截断部分可用于代替整个域。术语胞内信号传导域意图包含足以转导效应功能信号的胞内信号传导域的任何截断部分。众所周知，仅通过TCR产生的信号对于T细胞的完全活化是不充足的且还需要辅助信号或共刺激信号。因此，可将T细胞活化称为通过胞内信号传导域的两个不同种类介导：通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)引发抗原相关初级活化的初级信号传导域和以抗原独立方式作用以提供辅助信号或共刺激信号的共刺激信号传导域。在优选实施例中，CAR包括胞内信号传导域，所述胞内信号传导域包括一个或多个“共刺激信号传导域”和“初级信号传导域”。初级信号传导域以刺激方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式作用的初级信号传导域可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有适用于特定实施例中的初级信号传导域的ITAM的说明性实例包含来源于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的那些。在特定优选实施例中，CAR包括CD3ζ初级信号传导域和一个或多个共刺激信号传导域。胞内初级信号传导域和共刺激信号传导域可以任何次序串列连接到跨膜域的羧基端。在特定实施例中，CAR包括增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增的一个或多个共刺激信号传导域。如本文中所使用，术语“共刺激信号传导域”或“共刺激域”是指共刺激分子的胞内信号传导域。共刺激分子为提供在与抗原结合后为有效活化所需的第二信号和T淋巴细胞的功能的除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子。这些共刺激分子的说明性实例包含TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在一个实施例中，CAR包括选自CD28、CD137和CD134组成的群组的一个或多个共刺激信号传导域以及CD3ζ初级信号传导域。在另一实施例中，CAR包括CD28和CD137共刺激信号传导域以及CD3ζ初级信号传导域。在又一实施例中，CAR包括CD28和CD134共刺激信号传导域以及CD3ζ初级信号传导域。在一个实施例中，CAR包括CD137和CD134共刺激信号传导域以及CD3ζ初级信号传导域。在一个实施例中，CAR包括CD137共刺激信号传导域和CD3ζ初级信号传导域。在一个实施例中，CAR包括CD134共刺激信号传导域和CD3ζ初级信号传导域。在一个实施例中，CAR包括CD28共刺激信号传导域和CD3ζ初级信号传导域。在特定实施例中，CAR包括特异性结合于在癌细胞上表达糖蛋白的STn的抗STn抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；跨膜域，其来源于选自以下组成的群组的多肽：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；和一个或多个胞内共刺激信号传导域，其来自由选自以下组成的群组的共刺激分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70；以及初级信号传导域，其来自：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一个实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其选自由以下组成的群组：IgG1铰链/CH2CH3、IgG4铰链/CH2/CH3、PD1铰链、CD152铰链以及CD8α铰链；跨膜域，其来源于选自由以下组成的群组的多肽：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；和一个或多个胞内共刺激信号传导域，其来自选自由以下组成的群组的共刺激分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70；以及初级信号传导域，其来自：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一个实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其选自由以下组成的群组：IgG1铰链/CH2CH3、IgG4铰链/CH2/CH3、PD1铰链、CD152铰链以及CD8α铰链；跨膜域，其来源于选自由以下组成的群组的多肽：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；较短寡聚连接子或多肽连接子，优选地将CAR的TM域连接到胞内信号传导域的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个之间的氨基酸；和一个或多个胞内共刺激信号传导域，其来自选自由以下组成的群组的共刺激分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70；以及初级信号传导域，其来自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括IgG1铰链/CH2/CH3多肽以及CD8α多肽；CD8α跨膜域，其包括约3到约10个氨基酸的多肽连接子；CD137胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括CD8α多肽；CD8α跨膜域，其包括约3到约10各氨基酸的多肽连接子；CD134胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括CD8α多肽；CD8α跨膜域，其包括约3到约10个氨基酸的多肽连接子；CD28胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括PD1铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3到约10个氨基酸的多肽连接子；CD137胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括PD1铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3到约10个氨基酸的多肽连接子；CD134胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括PD1铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3到约10个氨基酸的多肽连接子；CD28胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括CD152铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3个到约10个氨基酸的多肽连接子；CD137胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括CD152铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3个到约10个氨基酸的多肽连接子；CD134胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。在一特定实施例中，CAR包括：抗STnscFv，其结合在糖蛋白上表达的STn；铰链域，其包括CD152铰链、多肽；PD1或CD152跨膜域，其包括约3个到约10个氨基酸的多肽连接子；CD28胞内共刺激信号传导域；以及CD3ζ初级信号传导域。此外，本文中所涵盖的CAR的设计在与未修饰的T细胞或修饰的T细胞相比的表达CAR的T细胞中实现改进的扩增、长期的存留性和细胞毒性性质以表达其它CAR。D.多肽本文中涵盖各种多肽，包含(但不限于)CAR多肽和其片段、包含其的细胞和组合物以及表达多肽的载体。在优选实施例中，提供包括一个或多个CAR的多肽。在特定实施例中，CAR是包括如阐述于SEQIDNO:25-27中的任一个中的氨基酸序列的抗STnCAR。除非在相反意义上指定且根据常规含义，“多肽”、“多肽片段”、“肽”以及“蛋白质”可互换地使用，即作为一连串氨基酸。多肽可为合成的或以重组方式产生的。多肽不限于特定长度，例如其可包括全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，且可包含多肽的转译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等，以及天然存在和非天然存在的所属领域中已知的其它修饰。在各种实施例中，CAR多肽包括在蛋白质的N端末端处的信号(或前导子)序列，其共转译或转译后地导引蛋白质的转移。适用于本文中所涵盖的CAR的适合信号序列的说明性实例包含(但不限于)IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽或人类GM-CSF受体α信号多肽。可使用多种熟知重组和/或合成技术中的任一种来制备多肽。确切地说，本文中所涵盖的多肽涵盖本公开的CAR或具有来自如本文中所涵盖的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。如本文中所使用的“分离的肽”或“经过分离的多肽”和类似物是指来自细胞环境和来自具有细胞的其它组分的关联物的肽或多肽分子的活体外分离和/或纯化，即其明显地不与活体内物质相关联。类似地，“分离的细胞”是指从活体内组织或器官获得的细胞且大体上不含胞外基质。多肽包含“多肽变异体”。多肽变异体可不同于呈一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的天然存在的多肽。这些变异体可为天然存在的或可以合成方式产生，例如通过修饰以上多肽序列中的一个或多个。举例来说，在特定实施例中，可能需要通过引入一个或多个取代、缺失、添加和/或插入到CAR多肽的结合域、铰链、TM域、共刺激信号传导域或初级信号传导域中来改进CAR的结合亲和力和/或其它生物性质。在特定实施例中，多肽包含与本文中所涵盖的参考序列中的任一种具有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％氨基酸一致性的多肽，通常其中变异体维持参考序列的至少一种生物活性。多肽包含“多肽片段”。多肽片段是指多肽，其可为具有天然存在的或以重组方式产生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或取代的单体或多聚体。在某些实施例中，多肽片段可包括长度为至少5到约500个氨基酸的氨基酸链。应了解，在某些实施例中，片段长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。尤其适用的多肽片段包含功能域，包含抗原结合域或抗体的片段。在抗STn抗体的情况下，适用的片段包含(但不限于)：重链或轻链的CDR区、CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或包含两个CDR的可变区等等。多肽还可框内融合或结合到连接子或其它序列以便于合成、纯化或识别多肽(例如，聚-His)，或增强多肽与固体载体的结合。如上文所提到，可以不同方式更改多肽，包含氨基酸取代、缺失、截断和插入。用于这些操控的方法是所属领域中一般已知的。举例来说，可通过DNA中的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变异体。用于突变引发和核苷酸序列更改的方法在所属领域中是众所周知。参看例如Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊》.82:488-492)；Kunkel等人(1987,《酶学方法(MethodsinEnzymol)》.154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人(《基因分子生物学(MolecularBiologyoftheGene)》,第四版,Benjamin/Cummings,加利福尼亚州门洛帕克(MenloPark,Calif.),1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导存在于Dayhoff等人,(1978)《蛋白序列和结构图集(AtlasofProteinSequenceandStructure)》(《国家生物医学研究基础(Natl.Biomed.Res.Found.)》,华盛顿(Washington,D.C.))的模型中。在某些实施例中，多肽变异体包括一个或多个保守取代。“保守取代”为氨基酸经另一个具有类似性质的氨基酸取代，使得肽化学方法领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质大体上不变。可以在特定实施例中所涵盖的聚核苷酸和多肽的结构中进行修饰并且仍获得编码具有理想特征的变异体或衍生物多肽的功能性分子。当期望更改多肽的氨基酸序列以创建等效物或甚至改进的变异体多肽时，所属领域的技术人员例如可例如根据表1改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。表1-氨基酸密码子确定哪一氨基酸残基可被取代、插入或缺失在且不消除生物活性的指导可使用在所属领域中熟知的计算机程序发现，所述计算机程序例如DNASTAR、DNAStrider、Geneious、MacVector或VectorNTI软件。优选地，本文中所公开的蛋白变异体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似地带电或不带电氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族中的一个的取代。通常将天然存在的氨基酸划分成四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)以及不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸有时共同地归类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，氨基酸的适合保守取代为所属领域的技术人员已知的且通常可在不改变所得分子的生物活性的情况下制得。一般来说，所属领域的技术人员认识到，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代大体上不更改生物活性(参看例如Watson等人,《基因的分子生物学(MolecularBiologyoftheGene)》,第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司(TheBenjamin/CummingsPub.Co.),第224页)。在进行此些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。所属领域中一般理解亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，以引用的方式并入本文中)。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特征指配亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异白氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；白氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。所属领域中已知某些氨基酸可以由具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。进行这些改变时，亲水指数在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些尤其优选，并且在±0.5之内的那些甚至更优选。所属领域中还应理解可以基于亲水性有效进行类似的氨基酸取代。如美国专利第4,554,101号所详述，将以下亲水性值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；白氨酸(-1.8)；异白氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以是由具有类似亲水性值的另一个氨基酸取代并且仍获得生物等效蛋白质，并且尤其免疫等效蛋白质。在这些改变时，亲水性值在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些尤其优选，并且在±0.5之内的那些甚至更尤其优选。如上文所概述，氨基酸取代可基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。多肽变异体进一步包含糖基化形式、具有其它分子的聚集结合物和具有不相关化学部分的共价结合物(例如，聚乙二醇化分子)。共价变异体可通过连接功能性到在氨基酸链中或在N端残基或C端残基处发现的基团来制备，如所属领域中所已知。变异体还包含等位基因变异体、物种变异体和突变蛋白。不影响蛋白质的功能活性的区域的截断或缺失也为变异体。在一个实施例中，在期望两个或多于两个多肽的表达的情况下，编码其的聚核苷酸序列可通过如本文中其它地方所论述的IRES序列隔开。在另一实施例中，两个或多于两个多肽可表达为包括一个或多个自我裂解的多肽序列的融合蛋白。特定实施例中所涵盖的多肽包含融合多肽。在优选实施例中，提供融合多肽和编码融合多肽的聚核苷酸，例如CAR。融合多肽和融合蛋白是指具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个多肽片段的多肽。融合多肽通常将C端连接到N端，尽管其也可将C端连接到C端，将N端连接到N端或将N端连接到C端。融合蛋白的多肽可呈任何次序或指定顺序。只要保留融合多肽的所要转录活性，融合多肽或融合蛋白还可包含保守修饰变异体、多晶变异体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物。融合多肽可通过化学合成物方法或通过两个部分之间的化学连接来产生或通常可使用其它标准技术来制备。包括融合多肽的连接的DNA序列如本文中其它地方所论述可操作地连接到适合转录或转译控制要素。在一个实施例中，融合搭配物包括有助于以比天然重组蛋白更高的产率表达蛋白质(表达增强子)的序列。可选择其它融合搭配物以便增加蛋白质的溶解度或使得蛋白质能够靶向所要胞内区室或以便于输送融合蛋白通过细胞膜。融合多肽可进一步包括本文中所描述的多肽域中的每一个之间的多肽裂解信号。另外，可将多肽裂解位点安放到任何连接肽序列中。示范性多肽裂解信号包含多肽裂解识别位点，例如蛋白酶裂解位点，核酸酶裂解位点(例如，罕见的限制酶识别位点、自我裂解核酶识别位点)，以及自我裂解病毒寡肽(参看deFelipe和Ryan,2004,《讯务(Traffic)》,5(8)；616-26)。适合蛋白酶裂解位点和自我裂解肽为所属领域的技术人员所已知的(参看例如，Ryan等人,1997，《遗传学病毒学(J.Gener.Virol.)》,78,699-722；Scymczak等人,(2004)《自然生物技术(NatureBiotech)》,5,589-594)。示范性蛋白酶裂解位点包含(但不限于)以下的裂解位点：马铃薯Y病毒属NIa蛋白酶(例如，烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒属HC蛋白酶、马铃薯Y病毒属P1(P35)蛋白酶、byo病毒NIa蛋白酶、byo病毒RNA-2编码的蛋白酶、口疮病毒属L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、细小核糖核酸3C蛋白酶、豇豆花叶病毒属24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(大米东格鲁球形病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风草黄斑病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa以及肠激酶。归因于其较高裂解严格度，TEV(烟草蚀刻病毒)蛋白酶裂解位点在一个实施例中是优选的，例如EXXYXQ(G/S)(SEQIDNO:39)，例如ENLYFQG(SEQIDNO:40)和ENLYFQS(SEQIDNO:41)，其中X表示任何氨基酸(通过Q与G或Q与S之间的TEV产生来裂解)。在一特定实施例中，自我裂解肽包含从马铃薯Y病毒属和心病毒属2A肽、FMDV(足部和口部疾病病毒)、马鼻炎A病毒、Thoseaasigna病毒和猪捷申病毒获得的那些多肽序列。在某些实施例中，自我裂解多肽位点包括2A或2A样位点、序列或域(Donnelly等人,2001,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》,82:1027-1041)。示范性2A位点展示于表2中。表2：SEQIDNO:42LLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:43TLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:44LLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:45NFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:46QLLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:47APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:48VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTSEQIDNO:49LNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:50LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO:51EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP在优选实施例中，多肽包括CAR多肽。E.聚核苷酸在优选实施例中，提供编码一个或多个CAR多肽的聚核苷酸。如本文中所使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。聚核苷酸包括单链聚核苷酸和双链聚核苷酸。在特定实施例中，聚核苷酸包含与本文中所涵盖的参考序列中的任一种具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列一致性的聚核苷酸或变异体。在各种说明性实施例中，聚核苷酸包含表达载体、病毒载体和转移质粒，以及包括其的组合物和细胞。在各种说明性实施例中，聚核苷酸编码本文中所涵盖的多肽，包含(但不限于)阐述于SEQIDNO:1-51中的多肽序列。在特定实施例中，聚核苷酸限制条件为编码多肽的至少约5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000个或更多个连续氨基酸残基，以及所有中间长度。容易理解，在这种情形下，“中间长度”意指所引述值之间的任何长度，例如6、7、8、9等，101、102、103等，151、152、153等，201、202、203等。如本文中所使用，术语“聚核苷酸变异体”和“变异体”和类似物是指与参考聚核苷酸序列呈现大体序列一致性的聚核苷酸或在下文中所定义的严格条件下与参考序列杂交的聚核苷酸。这些术语包括相较于参考聚核苷酸来说一个或多个核苷酸添加或缺失或由不同核苷酸置换的聚核苷酸。在这点上，在所属领域中充分理解，可以对参考聚核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此更改聚核苷酸保持参考聚核苷酸的生物功能或活性。如本文中所使用，叙述“序列一致性”或例如包括“与……50％一致的序列”是指比较窗口上逐核苷酸计或逐氨基酸计的序列相同程度。因此，“序列一致性的百分比”可通过以下来计算：在比较窗口上比较两个最优比对序列；确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)的位置数以得到匹配位置的数目；将匹配位置的数目除以比较窗口(即，窗口大小)中的位置的总数目；且将结果乘以100，从而得到序列一致性的百分比。所包含的为与本文中所描述的参考序列中的任一种具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列一致性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变异体维持参考多肽的至少一种生物活性。用于描述两个或更多个聚核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性的百分比”和“大体一致性”。“参考序列”的长度是至少12个，但常是15到18个，且通常是至少25个单体单元，包含核苷酸和氨基酸残基。因为两个聚核苷酸可各自包括(1)两个聚核苷酸之间类似的序列(即，完整聚核苷酸序列的仅一部分)，和(2)两个聚核苷酸之间相异的序列，两个(或更多个)聚核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个聚核苷酸的序列以鉴别和比较局部区域的序列相似性来进行。“比较窗口”是指至少6个、通常约50到约100个、更通常约100到约150个连续位置的概念性区段，其中在将两个序列最优比对后，将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。对于最优比对的两个序列，比较窗口可包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即间隙)。用于比对比较窗口的序列最优比对可以通过计算机化执行算法(美国威斯康星州的威斯康星州遗传学软件包7.0版本，遗传学计算机组，575科学驱动麦迪逊(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过多种选择方法中的任一个产生的检查和最优比对(即在比较窗口上导致最高同源性百分比)来进行。还可以参考如例如Altschul等人,1997,《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》25:3389所公开的BLAST程序家族。序列分析的详细论述可以见于Ausubel等人,《最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocolsinMolecularBiology)》,约翰·威利父子公司,1994-1998,第15章的19.3单元中。如本文中所使用，“分离的聚核苷酸”是指已经从在天然存在的状态下侧接其的序列纯化的聚核苷酸，例如从通常与片断相邻的序列移出的DNA片段。“分离的聚核苷酸”还指互补DNA(cDNA)、重组DNA或在自然界中不存在并且通过人力制得的其它聚核苷酸。描述聚核苷酸的定向的术语包含：5'(通常是具有游离磷酸酯基的聚核苷酸的末端)和3'(通常是具有游离羟基(OH)的聚核苷酸的末端)。聚核苷酸序列可以按5'到3'定向或3'到5'定向标注。对于DNA和mRNA，5'到3'链被命名为“有义”、“正”或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列相同[除了RNA中是尿嘧啶(U)，而非DNA中是胸嘧啶(T)以外]。对于DNA和mRNA，为由RNA聚合酶转录的链的互补3'到5'链被命名为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文中所使用，术语“反向定向”是指以3'到5'定向书写的5'到3'序列或以5'到3'定向书写的3'到5'序列。术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的聚核苷酸(即，一连串核苷酸)。举例来说，DNA序列5'AGTCATG3'的互补链是3'TCAGTAC5'。后一序列通常写成反向互补序列，5'端在左并且3'端在右，5'CATGACT3'。与其反向互补序列相等的序列被称为回文序列。互补性可为“部分”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。此外，所属领域一般技术人员应了解，如本文中所描述，由于遗传密码的简并，存在多种编码多肽或其变异体的片断的核苷酸序列。这些聚核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列携有最小同源性。尽管如此，归因于密码子使用差异而变化的聚核苷酸具体来说涵盖于特定实施例中，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的聚核苷酸。在特定实施例中，聚核苷酸为针对表达和/或稳定性优化的密码子。此外，还可以使用包括本文中所提供的聚核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(例如缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。如本文中所使用，术语“核酸盒”是指可表达RNA并且随后表达蛋白质的载体内的遗传序列。核酸盒含有所关注基因，例如CAR。核酸盒位置上并且依序地定向在载体内，使得盒中的核酸可以转录成RNA，并且当需要时翻译成蛋白质或多肽，经历转化的细胞的活性所需要的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当胞内区室或分泌到胞外区室中而易位到适当区室以获得生物活性。优选地，盒的3'和5'末端适用于预备插入到载体中，例如其在每一末端处具有限制性核酸内切酶。在一优选实施例中，核酸盒含有用于增加表达STn结合糖蛋白(例如，TAG-72)的癌细胞的细胞毒性的嵌合抗原受体的序列。盒可以按单一单位移出和插入到质粒或病毒载体中。在特定实施例中，聚核苷酸包含至少一种所关注聚核苷酸。如本文中所使用，术语“所关注聚核苷酸”是指编码插入到所要表达的表达载体中的多肽(即，所关注多肽)的聚核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种所关注聚核苷酸。在某些实施例中，所关注聚核苷酸编码在治疗或预防疾病或病症方面提供治疗效果的多肽。所关注聚核苷酸和由其编码的多肽包含编码野生型多肽的聚核苷酸以及其功能变异体和片段两个。在特定实施例中，功能变异体与相应野生型参考聚核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％一致性。在某些实施例中，功能变异体或片断具有相应野生型多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的生物活性。在一个实施例中，所关注聚核苷酸是转录miRNA、siRNA或shRNA、核酶或其它抑制性RNA的模板。在各种其它实施例中，聚核苷酸包括编码CAR的所关注聚核苷酸，以及一种或多种额外所关注聚核苷酸，其包含(但不限于)抑制性核酸序列，包含(但不限于)：siRNA、miRNA、shRNA以及核酶。如本文中所使用，术语“siRNA”或“短干扰RNA”是指介导动物中的序列特异性转录后基因沉默、转译抑制、转录抑制或表观遗传RNAi的过程的短聚核苷酸序列(Zamore等人,2000,《细胞(Cell)》,101,25-33；Fire等人,1998,《自然》,391,806；Hamilton等人,1999,《科学》,286,950-951；Lin等人,1999,《自然》,402,128-129；Sharp,1999,《基因与发育(Genes&Dev.)》,13,139-141；和Strauss,1999,《科学》,286,886)。在某些实施例中，siRNA包括具有相同数目核苷的第一链和第二链；然而，第一与第二链偏移，使得第一和第二链上的两个末端核苷与互补链上的残基不配对。在某些情况下，不配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应包含与靶基因具有充足同源性的区并且就核苷酸来说具有充足长度，使得siRNA或其片断可以介导靶基因的下调。因此，siRNA包含与靶RNA至少部分互补的区。siRNA与靶标之间不必存在完美互补性，但对应性必须足以使得siRNA或其裂解产物能够导引序列特异性沉默，例如通过靶RNA的RNAi裂解。与靶标链的互补性或同源性程度对于反义链最为关键。尽管完美的互补性是经常期望的(尤其在反义链中)，一些实施例包含关于靶标RNA的一个或多个，但是优选地10、8、6、5、4、3、2或更少个错配。错配最被容许在末端区中，且如果存在，优选在例如5'末端和/或3'末端的6、5、4或3个核苷酸内的一个或多个末端区中。有义链仅需要与反义链足够互补以维持分子的整体双链特征。另外，siRNA可以经修饰或包含核苷类似物。siRNA的单链区可以被修饰或包含核苷类似物，例如发夹结构的一个或多个未配对区(例如，连接两个互补区的区)可以具有修饰或核苷类似物。用以例如针对核酸外切酶稳定siRNA的一个或多个3'末端或5'末端或促进反义siRNA剂进入RISC中的修饰也是有用的。修饰可以包含C3(或C6、C7、C12)氨基连接子、硫醇连接子、羧基连接子、非核苷酸间隔子(C3、C6、C9、C12、无碱基、三乙二醇、六乙二醇)、以氨基磷酸酯形式出现并且具有另一受DMT保护的羟基的特定生物素或荧光素试剂，从而在RNA合成期间可进行多个偶合。每个siRNA链的长度可以等于或少于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸。链的长度优选是至少19个核苷酸。举例来说，每个链的长度可以在21与25个核苷酸之间。优选的siRNA具有17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋体区，和一个或多个2-3个核苷酸的突出端、优选一个或两个2-3个核苷酸的3'突出端。如本文中所使用，术语“miRNA”或“微RNA”是指典型地从称为前-miRNA的约70个核苷酸折回RNA前驱物结构切下的20-22个核苷酸的小非编码RNA。miRNA取决于miRNA与靶标之间的互补性程度以两种方式中的一种负调节其靶标。首先，以完美或几乎完美的互补性结合到蛋白质编码mRNA序列的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合到其mRNA靶标的3'非转译区(UTR)内的不完美互补位点来发挥其调节效果的miRNA通过与用于RNAi途径者类似或可能相同的RISC复合物明显在转译水平下抑制转录后靶基因表达。与转译控制一致，使用这种机制的miRNA降低其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平仅最低限度地受影响。miRNA涵盖天然存在的miRNA以及可以特异性靶向任何mRNA序列的人工设计的miRNA两个。举例来说，在一个实施例中，熟练的技术人员可设计表达为人类miRNA(例如，miR-30或miR-21)初级转录物的短发夹RNA构建体。这种设计向发夹构建体增添了Drosha加工位点并且据显示可极大地增加基因敲落效率(Pusch等人,2004)。发夹茎由22nt的dsRNA(例如，与所要靶标具有完美互补性的反义链)和来自人类miR的15-19nt的环组成。当与不具有微RNA的常规shRNA设计相比时，在发夹的任一侧或两侧上添加miR环和miR30侧接序列导致所表达发夹的Drosha和Dicer加工有大于10倍的增加。增加的Drosha和Dicer加工转换成更大的siRNA/miRNA产生和所表达发夹的更大效力。如本文中所使用，术语“shRNA”或“短发夹RNA”是指通过单一自互补RNA链形成的双链结构。含有与靶基因的编码或非编码序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA构建体优选用于抑制。相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现可有效用于抑制。抑制性RNA与靶基因部分之间的大于90％序列一致性或甚至100％序列一致性是优选的。在某些优选实施例中，shRNA的双螺旋体形成部分的长度是至少20、21或22个核苷酸长，例如大小相当于通过Dicer依赖性裂解产生的RNA产物。在某些实施例中，shRNA构建体的长度是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施例中，shRNA构建体的长度是400-800个碱基。shRNA构建体高度耐受环序列和环大小的变化。如本文中所使用，术语“核酶”是指能够使靶mRNA位点特异性裂解的催化活性RNA分子。已经描述了若干亚型，例如锤头核酶和发夹核酶。核酶催化活性和稳定性可以通过在非催化碱基处用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸而改进。虽然在位点特异性识别序列处使mRNA裂解的核酶可以用以破坏特定mRNA，但使用锤头核酶是优选的。锤头核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧接区指定的位置处使mRNA裂解。唯一要求是靶mRNA具有两种碱基的以下序列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和产生在所属领域中是熟知的。如本文中别处所描述，包括siRNA、miRNA、shRNA或核酶的所关注聚核苷酸的优选传递方法包括一个或多个调节序列，例如强组成型polIII，例如人类U6snRNA启动子、小鼠U6snRNA启动子、人类和小鼠H1RNA启动子以及人类tRNA-val启动子；或强组成型polII启动子。如本文中别处所公开或如所属领域中已知，本文中所涵盖的聚核苷酸(无关于编码序列本身的长度)可以与其它DNA序列组合，所述序列例如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、信号序列、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号和编码自我裂解多肽的聚核苷酸、表位标签，使得其总长度可以显著变化。因此设想可以采用几乎任何长度的聚核苷酸片断，其中总长度优选地受限于在预期的重组DNA方案中制备和使用的容易程度。聚核苷酸可以使用所属领域中已知并且可用的多种公认技术中的任一种来制备、操纵和/或表达。为了表达所要多肽，可将编码多肽的核苷酸序列插入到适当载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。其它示范性载体包含(但不限于)质粒；噬菌粒；粘粒；转座子；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，例如λ噬菌体或M13噬菌体；以及动物病毒。适用作载体的动物病毒的类别的实例包含(但不限于)逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多泡病毒(例如，SV40)。表达载体的实例是用于哺乳动物细胞中的表达的pClneo载体(普洛麦格(Promega))；用于哺乳动物细胞中的慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM以及pLenti6.2/V5-GW/lacZ(英杰(Invitrogen))。在特定实施例中，本文中所公开的嵌合蛋白的编码序列可以连接到所述表达载体中以用于使嵌合蛋白在哺乳动物细胞中表达。在特定实施例中，载体是非整合型载体，包含(但不限于)游离型载体或染色体外维持的载体。如本文中所使用，术语“游离型”是指载体能够复制且不整合到宿主的染色体DNA中并且不由分裂宿主细胞逐渐丧失，还意指所述载体在染色体外或游离地复制。载体被工程改造以具有编码淋巴疱疹病毒或γ疱疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒或酵母的DNA复制起点或“ori”(具体来说，淋巴疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起点，对应于EBV的oriP)的序列。在一特定实施例中，淋巴疱疹病毒可为埃-巴二氏病毒(EpsteinBarrvirus；EBV)、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(Kaposi'ssarcomaherpesvirus；KSHV)、松鼠猴疱疹病毒(HS)或马雷克氏疾病病毒(Marek'sdiseasevirus；MDV)。埃-巴二氏病毒(EBV)和卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)还是γ疱疹病毒的实例。通常，宿主细胞包括活化复制的病毒复制反式活化蛋白。在特定实施例中，使用转座子载体系统将聚核苷酸引入到靶细胞或宿主细胞中。在某些实施例中，转座子载体系统包括：载体，其包括转座元件和本文中涵盖的聚核苷酸；和转座酶。在一个实施例中，转座子载体系统是单个转座酶载体系统，参看例如国际申请第PCT/US07/18922号。示范性转座酶包含(但不限于)：piggyBac、SleepingBeauty、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、mini-Tol2、Tc3、MuA、HimarI、FrogPrince以及其衍生物。piggyBac转座子和转座酶描述于例如美国专利6,962,810中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。SleepingBeauty转座子和转座酶描述于例如Izsvak等人,《分子生物学杂志》302:93-102(2000)中，其以全文引用的方式并入本文中。首先从medakafishOryziaslatipes中分离且属于转座子的hAT家族的Tol2转座子描述于Kawakami等人(2000)中。Mini-Tol2是Tol2的变异体且描述于Balciunas等人(2006)中。当与Tol2转座酶共同作用时，Tol2和Mini-Tol2转座子有助于将转基因整合到生物的基因组中。FrogPrince转座子和转座酶描述于例如Miskey等人,《核酸研究》31:6873-6881(2003)中。存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区-复制起点、选择盒、启动子、增强子、转译起始信号(ShineDalgarno序列或Kozak序列)、内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非转译区-其与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录与转译。所述元件可以在其强度和特异性方面变化。取决于所用的载体系统和宿主，可以使用多种适合转录与转译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。在特定实施例中，包含(但不限于)表达载体和病毒载体的载体将包含外源、内源或异源控制序列，例如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是天然地与基因组中的既定基因连接的控制序列。“外源”控制序列是借助于遗传操纵(即，分子生物技术)与基因并接定位使得所述基因的转录通过所连接的增强子/启动子导引的控制序列。“异源”控制序列是来自与所遗传操纵的细胞不同的物种的外源序列。如本文中所使用，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合到的聚核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并且转录可操作地连接到启动子的聚核苷酸。在特定实施例中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包括位于转录起始位点上游约25到30个碱基处的富AT区，和/或见于转录起始上游70到80个碱基处的另一序列，N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于其相对于另一控制序列的定向起作用的一段DNA。增强子可以与启动子和/或其它增强元件协作地或叠加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能两个的序列的一段DNA。术语“可操作地连接”是指所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系的并接。在一个实施例中，术语是指核酸表达控制序列(例如启动子和/或强化子)与第二聚核苷酸序列(例如，所关注聚核苷酸)之间的功能性连接，其中表达控制序列导引对应于第二序列的核酸的转录。如本文中所使用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在多种细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子，或允许分别在多种限定细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。适用于特定实施例中的说明性普遍存在的表达控制序列包含(但不限于)巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核转译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA26基因座(Irions等人,《自然·生物技术(NatureBiotechnology)》25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challita等人,《病毒学杂志(JVirol.)》69(2):748-55(1995))。在一个实施例中，载体包括MND启动子。在一个实施例中，载体包括EF1a启动子，其包括人类EF1a基因的第一内含子。在一个实施例中，载体包括EF1a启动子，其不含人类EF1a基因的第一内含子。在一特定实施例中，可能需要从T细胞特异性启动子表达包括CAR的聚核苷酸。如本文中所使用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包含(但不限于)诱导型表达；阻抑型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态的细胞或组织中的表达；等。此定义不打算排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例所关注聚核苷酸的条件表达，例如表达通过使细胞、组织、生物体等经历导致聚核苷酸表达或导致由所关注聚核苷酸编码的聚核苷酸的表达增加或减弱的处理或条件来进行控制。诱导型启动子/系统的说明性实例包含(但不限于)类固醇诱导型启动子，例如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用相应激素处理而诱导)；金属硫蛋白启动子(通过用各种重金属处理而诱导)；MX-1启动子(通过干扰素诱导)；“GeneSwitch”米非司酮可调节系统(Sirin等人,2003,《基因(Gene)》,323:67)；cumate诱导型基因开关(WO2002/088346)；四环素依赖性调节系统；等。条件表达还可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现。根据某些实施例，载体包括用于通过位点特异性重组酶介导的重组的至少一个(通常两个)位点。如本文中所使用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含涉及一个或多个(例如，二、三、四、五、七、十、十二、十五、二十、三十、五十个等)重组位点的重组反应的切除型或整合型蛋白、酶、辅因子或相关蛋白，其可以是野生型蛋白(参看Landy,《生物技术新见(CurrentOpinioninBiotechnology)》3:699-707(1993))或其突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变异体。适用于特定实施例中的重组酶的说明性实例包含(但不限于)：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。载体可以包括一个或多个用于多种位点特异性重组酶中的任一种的重组位点。应理解，位点特异性重组酶的靶位点是除了载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)的整合所需要的任何位点之外存在的。如本文中所使用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶所识别并且结合的特定核酸序列。举例来说，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其是34个碱基对的序列，包括侧接8个碱基对的核心序列的两个13个碱基对的反向重复序列(充当重组酶结合位点)(参看SauerB.,《生物技术新见》5:521-527(1994)的图1)。其它示范性loxP位点包含(但不限于)：lox511(Hoess等人,1996；Bethke和Sauer,1997)、lox5171(Lee和Saito,1998)、lox2272(Lee和Saito,1998)、m2(Langer等人,2002)、lox71(Albert等人,1995)以及lox66(Albert等人,1995)。FLP重组酶的适合识别位点包含(但不限于)：FRT(McLeod等人,1996)、F1,F2,F3(Schlake和Bode,1994)、F4,F5(Schlake和Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff等人,1988)、FRT(RE)(Senecoff等人,1988)。识别序列的其它实例是attB、attP、attL和attR序列，其由重组酶λ整合酶(例如，)识别。SSR介导仅异型位点attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人,2000)。分别针对细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的连接位点而命名的attB和attP都含有很可能与同源二聚体结合的不完美反向重复序列(Groth等人,2000)。产物位点attL和attR对进一步介导的重组实际上是惰性的(Belteki等人,2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，与attP位点插入到基因组attB位点中相比，携有attB的DNA更容易插入到基因组attP位点中(Thyagarajan等人,2001；Belteki等人,2003)。因此，典型策略通过同源重组将携有attP的“对接位点”安置到界定的基因座中，所述基因座然后与携有attB的进入序列搭配以用于插入。如本文中所使用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进直接内部核糖体进入到顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子(例如ATG)，由此导致基因的帽非依赖性转译的元件。参看例如Jackson等人,1990.《生化科学趋势(TrendsBiochemSci)》15(12):477-83，和Jackson和Kaminski.1995.RNA1(10):985-1000。在特定实施例中，载体包含编码一种或多种多肽的一个或多个所关注聚核苷酸。在特定实施例中，为了实现多种多肽中的每一种的高效转译，聚核苷酸序列可以通过一个或多个编码自我裂解多肽的IRES序列或聚核苷酸序列隔开。如本文中所使用，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体的小亚单位的初始结合并且增加转译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQIDNO:57)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986.《细胞》44(2):283-92和Kozak,1987.《核酸研究》15(20):8125-48)。在特定实施例中，载体包括具有共有Kozak序列且编码所要多肽(例如，CAR)的聚核苷酸。在一些实施例中，聚核苷酸或具有所述聚核苷酸的细胞利用自杀基因(包含诱导型自杀基因)来降低直接毒性和/或不受控增殖的风险。在特定实施例中，自杀基因对具有所述聚核苷酸或细胞的宿主不具有免疫原性。可以使用的自杀基因的某一实例是半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。半胱天冬酶-9可以使用特定化学二聚诱导剂(CID)活化。在某些实施例中，载体包括使得免疫效应细胞(例如，T细胞)在活体内易受阴性选择影响的基因片段。“阴性选择”意指，输注的细胞可以由于个体的体内条件的变化而消除。阴性可选表型可以由赋予对所投予试剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入产生。阴性可选基因在所属领域中是已知的且尤其包含以下：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-ITK)基因(Wigler等人,《细胞》11:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,《美国国家科学院院刊》89:33(1992))。在一些实施例中，遗传修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞)包括进一步包括实现了阴性可选表型的细胞的体外选择的阳性标记的聚核苷酸。阳性可选标记可以是在引入到宿主细胞中后表达显性表型(允许携带所述基因的细胞的阳性选择)的基因。这种类型的基因在本领域中是已知的并且尤其包含：赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)；编码对抗生素G418的抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；腺苷脱氨酶基因(ADA)；和多药物抗性(MDR)基因。优选地，连接阳性可选标记和阴性可选元件，使得阴性可选元件的丧失必须还伴有阳性可选标记的丧失。甚至更优选地，融合阳性和阴性可选标记，使得一者的丧失强制性地导致另一者的丧失。以表达产物形式产生赋予上文所述的所要阳性和阴性选择特性两个的多肽的融合聚核苷酸的一实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。这种基因的表达产生了赋予潮霉素B抗性用于体外阳性选择和更昔洛韦敏感性用于体内阴性选择的多肽。参看LuptonS.D.等人,《分子与细胞生物学(Mol.andCell.Biology)》11:3374-3378,1991。另外，在优选实施例中，编码嵌合受体的聚核苷酸在含有融合基因的逆转录病毒载体、尤其赋予潮霉素B抗性用于活体外阳性选择和更昔洛韦敏感性用于体内阴性选择的逆转录病毒载体(例如Lupton,S.D.等人(1991)，同前文献中所描述的HyTK逆转录病毒载体)中。还参看S.D.Lupton的PCTUS91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了由融合显性阳性可选标记与阴性可选标记而衍生的双功能可选融合基因的用途。优选的阳性可选标记衍生自选自由以下组成的群组的基因：hph、nco和gpt，并且优选的阴性可选标记衍生自选自由以下组成的群组的基因：胞嘧啶脱氨酶、HSV-ITK、VZVTK、HPRT、APRT和gpt。尤其优选的标记是阳性可选标记衍生自hph或neo并且阴性可选标记衍生自胞嘧啶脱氨酶或TK基因或可选标记的双功能可选融合基因。在各种实施例中，聚核苷酸是引入到细胞中以便瞬时表达所要多肽的mRNA。如本文中所使用，“瞬时”是指在数小时、数天或数周的时期内表达未整合的转基因，其中在整合到基因组中或含于细胞中的稳定载体或质粒内时，表达的时间段少于表达聚核苷酸的时间段。在特定实施例中，编码多肽的mRNA是活体外转录的mRNA。如本文中所使用，“活体外转录的RNA”是指RNA，优选活体外合成的mRNA。一般来说，活体外转录的RNA由活体外转录载体产生。活体外转录载体包括用于产生活体外转录的RNA的模板。在特定实施例中，mRNA进一步包括5'帽或修饰的5'帽和/或poly(A)序列。如本文中所使用，5'帽(又称为RNA帽、RNA7-甲基鸟苷帽或RNAm7G帽)是在开始转录之后即刻添加到中真核信使RNA的“前部”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽包括连接到第一转录核苷酸且通过核糖体识别并受RNases保护的端基。可修饰帽部分以调节mRNA的功能，例如其转译的稳定性或效率。在一特定实施例中，mRNA包括约50与约5000个腺嘌呤之间的poly(A)序列。在一个实施例中，mRNA包括约100与约1000个碱基之间、约200与约500个碱基之间或约300与约400个碱基之间的poly(A)序列。在一个实施例中，mRNA包括约65个碱基、约100个碱基、约200个碱基、约300个碱基、约400个碱基、约500个碱基、约600个碱基、约700个碱基、约800个碱基、约900个碱基或约1000个或更多个碱基的poly(A)序列。可以化学方式或以酶方式修饰poly(A)序列以调节mRNA功能，例如转译的定位、稳定性或效率。F.病毒载体在特定实施例中，用编码CAR的逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)转导细胞(例如，免疫效应细胞)。举例来说，用编码CAR的载体转导免疫效应细胞，所述CAR包括结合表达糖蛋白(例如，TAG-72)的STn的抗STn抗体或其抗原结合片段；与CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40或其任何组合的胞内信号传导域。因此，这些转导的细胞可以引发CAR介导的细胞毒性应答。逆转录病毒是基因传递的常见工具(Miller,2000,《自然》357:455-460)。在特定实施例中，逆转录病毒用以将编码嵌合抗原受体(CAR)的聚核苷酸传递到细胞。如本文中所使用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中的RNA病毒。在将病毒整合到宿主基因组中后，其被称为“原病毒”。原病毒充当RNA聚合酶II的模板并且导引编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。适用于特定实施例中的说明性逆转录病毒包含(但不限于)：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠(Harveymurine)肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德鼠(Friendmurine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。如本文中所使用，术语“慢病毒”是指复杂的逆转录病毒组(或属)。说明性慢病毒包含(但不限于)：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV1型和HIV2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特定实施例中，慢病毒用以将包括CAR的聚核苷酸传递到细胞。逆转录病毒载体并且更具体地说慢病毒载体可用于中实践特定实施例。因此，如本文中所使用，术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”意图分别包含“慢病毒”和“慢病毒载体”。术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常连接到载体核酸分子，例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含在细胞中直接自主复制的序列，或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包含例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包含例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。如对于所属领域的技术人员显而易见，术语“病毒载体”广泛用以指包含典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，或介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒典型地将包含各种病毒组分并且有时还包含宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。术语“杂交载体”是指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列两个的载体、LTR或其它核酸。在一个实施例中，杂交载体是指包括用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如，慢病毒)序列的载体或转移质粒。在特定实施例中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用以指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。当在本文中对元件(例如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等)进行参考时，应理解这些元件的序列以RNA形式存在于慢病毒颗粒中且以DNA形式存在于DNA质粒中。在原病毒的每一端是被称为“长末端重复序列”或“LTR”的结构。术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA的末端处的碱基对域，其在其天然序列情形下是直接重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常提供对于逆转录病毒基因的表达(例如，基因转录物的启动、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制基本的功能。LTR含有众多调节信号，包含转录控制元件、聚腺苷酸化信号和病毒基因组的复制和整合所需的序列。将病毒LTR分成三个区，称为U3、R和U5。U3区含有增强子和启动子元件。U5区是引物结合位点与R区之间的序列并且含有聚腺苷酸化序列。R(重复序列)区由U3和U5区侧接。LTR由U3、R和U5区组成并且出现在病毒基因组的5'和3'两端。与5'LTR相邻的是基因组逆转录所需的序列(tRNA引物结合位点)和病毒RNA高效包装到颗粒中所需的序列(Ψ位点)。如本文中所使用，术语“包装信号”或“包装序列”是指将病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中所需的位于逆转录病毒基因组内的序列，参看例如Clever等人,1995.《病毒学杂志》,第69卷,第4期；第2101-2109页。若干逆转录病毒载体使用病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号(也称为psi[Ψ]序列)。因此，如本文中所使用，术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”是关于在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化所需要的非编码序列使用。在各种实施例中，载体包括修饰的5'LTR和/或3'LTR。LTR中的任一种或两种可以包括一个或多个修饰，包含(但不限于)一个或多个缺失、插入或取代。通常对3'LTR进行修饰以通过使病毒具复制缺陷性而提高慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。如本文中所使用，术语“复制缺陷型”是指病毒不能完全、有效复制，使得不产生感染性病毒粒体(例如，复制缺陷型慢病毒后代)。术语“复制胜任型”是指能够复制的野生型病毒或突变病毒，使得病毒的病毒复制能够产生感染性病毒粒体(例如，复制胜任型慢病毒后代)。“自我失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体(例如，逆转录病毒或慢病毒载体)，其中称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。这是因为右(3')LTRU3区在病毒复制期间用作左(5')LTRU3区的模板，并且因此法在无U3增强子-启动子的情况下制得病毒转录物无。在另一实施例中，修饰3'LTR，使得U5区由例如理想的poly(A)序列置换。应注意，还包含对LTR的修饰，例如对3'LTR、5'LTR或3'和5'LTR两个的修饰。额外安全性增强通过用异源启动子置换5'LTR的U3区以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录而提供。可使用的异源启动子的实例包含例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。典型启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。这种置换降低了重组以生成复制胜任型病毒的可能性，因为在病毒产生系统中不存在完整U3序列。在某些实施例中，异源启动子在控制转录病毒基因组的方式方面具有其它优势。举例来说，异源启动子可以是诱导型的，使得全部或部分病毒基因组的转录仅在诱导因子存在时发生。诱导因子包含(但不限于)一种或多种化合物或培养宿主细胞的生理条件(例如温度或pH)。在一些实施例中，病毒载体包括TAR元件。术语“TAR”是指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R区中的“反式活化应答”遗传元件。这种元件与慢病毒反式活化子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而，在5'LTR的U3区由异源启动子置换的实施例中不需要这种元件。“R区”是指逆转录病毒LTR内从封端基团开始(即，转录起始)处开始并且在polyA段起始之前立即结束的区。R区还定义为由U3和U5区侧接。R区在逆转录期间在允许初生DNA从基因组的一端转移到另一端方面起一定作用。如本文中所使用，术语“FLAP元件”是指其序列包含逆转录病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。在一些实施例中，术语“FLAP元件”和“cPPT/FLAP”可互换地使用以指前述FLAP元件。适合FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou等人,2000,《细胞》,101:173中。在HIV-1逆转录期间，中心多嘌呤段(cPPT)处正链DNA的中心起始和中心终止序列(CTS)处的中心终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中心DNAFLAP。虽然不希望受任何理论束缚，但DNAFLAP可以充当慢病毒基因组细胞核输入的顺式活性决定因子，和/或可以增加病毒的滴度。在特定实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体骨架在载体中的所关注异源基因的上游或下游包括一个或多个FLAP元件。举例来说，在特定实施例中，转移质粒包含FLAP元件。在一个实施例中，载体包括从HIV-1中分离的FLAP元件。在一个实施例中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包括一个或多个导出元件。术语“导出元件”是指调节RNA转录物从细胞的细胞核输送到细胞质的顺式作用的转录后调节元件。RNA导出元件的实例包含(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参看例如Cullen等人,1991.《病毒学杂志》65:1053；和Cullen等人,1991.《细胞》58:423)和B型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。一般来说，RNA导出元件位于基因的3'UTR内，并且可以一个或多个拷贝形式插入。在特定实施例中，病毒载体中异源序列的表达通过将转录后调节元件、高效聚腺苷酸化位点和任选地转录终止信号并入到载体中而增加。多种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质的表达，例如土拔鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人,1999,《病毒学杂志》,73:2886)；存在于B型肝炎病毒中的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人,《分子与细胞生物学》,5:3864)；等(Liu等人,1995,《基因与发育》,9:1766)。在特定实施例中，载体包括转录后调节元件，例如WPRE或HPRE。在特定实施例中，载体不具有或不包括转录后调节元件(例如WPRE或HPRE)，因为在一些情况下，这些元件增加了细胞转化的风险和/或不会实质上或显著地增加mRNA转录物的量或增加mRNA稳定性。然而，将WPRE包含于给定载体中的效果在一些实施例中可为不可预测的。因此，在一些实施例中，本发明的载体不具有或不包括WPRE或HPRE。导引异源核酸转录物的高效终止和聚腺苷酸化的元件增加了异源基因表达。转录终止信号通常见于聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施例中，载体在编码待表达的多肽的聚核苷酸的3′包括聚腺苷酸化序列。如本文中所使用，术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”表示通过RNA聚合酶II导引初生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化两个的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过添加polyA尾到编码序列的3′端而提升mRNA稳定性，并且因此促进转译效率增加。通过RNA中的poly(A)序列来导引裂解和聚腺苷酸化。哺乳动物预mRNA的核心poly(A)序列具有侧接裂解聚腺苷酸化位点的两个识别元件。典型地，几乎恒定的AAUAAA六聚物处于U或GU残基中富含的更可变元件的20-50个核苷酸上游。初生转录物的裂解发生在这两个元件之间且与添加多达250个腺苷到5'裂解产物偶合。在特定实施例中，核心poly(A)序列为理想的poly(A)序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，poly(A)序列为SV40poly(A)序列、牛生长激素poly(A)序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白poly(A)序列(rβgpA)或所属领域中已知的另一种适合异源或内源poly(A)序列。在某些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体进一步包括一个或多个隔离子元件。隔离子元件可以有助于保护慢病毒表达的序列(例如，治疗性多肽)免遭整合位点效应，所述效应可能由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导并且导致转移的序列的表达失调(即，位置效应；参看例如Burgess-Beusse等人,2002,《美国国家科学院院刊》,99:16433；和Zhan等人,2001,《人类遗传学(Hum.Genet.)》,109:471)。在一些实施例中，转移载体包括一个或多个隔离子元件，3′LTR，并且在原病毒整合到宿主基因组中后，原病毒凭借复制3′LTR在5′LTR或3′LTR两个处都包括一个或多个隔离子。用于特定实施例中的适合隔离子包含(但不限于)鸡β-珠蛋白隔离子(参看Chung等人,1993.《细胞》74:505；Chung等人,1997.《美国国家科学院院刊》94:575；和Bell等人,1999.《细胞》98:387，其以引用的方式并入本文中)。隔离子元件的实例包含(但不限于)来自β-珠蛋白基因座的隔离子，例如鸡HS4。根据某些特定实施例，大多数或所有病毒载体骨架序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或可以在不削弱转移载体执行本文中所描述功能的能力的情况下对某些慢病毒序列提供组合并且众多的取代和变化。此外，多种慢病毒载体在所属领域中是已知的，参见Naldini等人(1996a、1996b以及1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人，1998，美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，其中的许多可被适配成用于产生病毒载体或转移质粒。在各种实施例中，载体包括可操作地连接到编码CAR多肽的聚核苷酸的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一LTR包括一个或多个修饰，例如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可以进一步包括增加转导效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Ψ)包装信号，RRE)的更多辅助元件中的一个，和/或增加治疗基因表达的其它元件(例如，poly(A)序列)，并且可以任选地包括WPRE或HPRE。I在一特定实施例中，本发明的转移载体包括左(5')逆转录病毒LTR；中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒导出元件；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的多聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；和右(3')逆转录病毒LTR；以及任选地WPRE或HPRE。在一特定实施例中，本发明的转移载体包括左(5')逆转录病毒LTR；逆转录病毒导出元件；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；右(3')逆转录病毒LTR；和poly(A)序列；以及任选地WPRE或HPRE。在另一特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')LTR；cPPT/FLAP；RRE；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；右(3')LTR；和聚腺苷酸化序列；以及任选地WPRE或HPRE。在某一实施例中，慢病毒载体包括：左(5')HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；右(3')自我失活(SIN)HIV-1LTR；和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地WPRE或HPRE。在另一实施例中，载体包括：至少一个LTR；中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒导出元件；和可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；以及任选地WPRE或HPRE。在特定实施例中，载体包括：至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；和聚腺苷酸化序列；以及任选地WPRE或HPRE。在某一实施例中，载体包括：至少一个SINHIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；可操作地连接到编码本文中所涵盖的CAR多肽的聚核苷酸的在T细胞中具活性的启动子；和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地WPRE或HPRE。“宿主细胞”包含用重组载体或聚核苷酸活体内、离体或活体外电穿孔、转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包含包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞。在特定实施例中，向需要治疗的个体投予用病毒载体感染的宿主细胞。在某些实施例中，术语“靶细胞”与宿主细胞可互换使用并且是指所要细胞类型的转染、感染或转导的细胞。在优选实施例中，靶细胞是T细胞。大规模病毒颗粒产生通常为实现合理病毒滴度所必需。病毒颗粒通过将转移载体转染到包括病毒结构和/或辅助基因(例如，gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因)或其它逆转录病毒基因的包装细胞系中而产生。如本文中所使用，术语“包装载体”是指不具有包装信号并且包括编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的聚核苷酸的表达载体或病毒载体。典型地，包装载体包含于包装细胞中，并且经由转染、转导或感染引入到细胞中。用于转染、转导或感染的方法为所属领域的技术人员所熟知的。在特定实施例中，通过转染、转导或感染将逆转录病毒/慢病毒转移载体引入到包装细胞系中，以产生生产细胞或细胞系。在特定实施例中，通过标准方法将包装载体引入到人类细胞或细胞系中，所述方法包含例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施例中，包装载体与显性可选标记(例如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、博莱霉素、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入到细胞中，随后在适当药物存在下选择并且分离克隆。可选标记基因可例如通过IRES或自我裂解病毒肽实体地连接到通过包装载体编码的基因。病毒包膜蛋白(env)确定了最终可以被由细胞系生成的重组逆转录病毒感染和转化的宿主细胞的范围。在慢病毒(例如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV)的情况下，env蛋白包含gp41和gp120。优选地，在来自病毒gag和pol基因单独的载体上编码通过包装细胞表达的病毒env蛋白质，如先前已描述。可以用于特定实施例中的逆转录病毒衍生的env基因的说明性实例包含(但不限于)：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉(Ebola)、仙台(Sendai)、FPV(禽瘟疫病毒)以及流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自RNA病毒(例如，小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒家族)以及来自DNA病毒(肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae))的包膜的基因。这些病毒的代表性实例包含(但不限于)：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。在其它实施例中，用于假型化病毒的包膜蛋白包含(但不限于)以下病毒中的任一种：A型流感(例如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感))、B型流感、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组(Norwalkvirusgroup)的任何病毒、肠溶腺病毒、微小病毒、登革热(Denguefever)病毒、猴痘、单链负义病毒目(Mononegavirales)、狂犬病毒属(Lyssavirus)(例如狂犬病病毒)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagosbatvirus)、莫科拉病毒(Mokolavirus)、杜文黑基病毒(Duvenhagevirus)、欧洲蝙蝠病毒(Europeanbatvirus)1与2和澳大利亚蝙蝠病毒(Australianbatvirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1和2型)、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、人类疱疹病毒6和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(例如阿根廷(Argentine)出血热病毒、玻利维亚(Bolivian)出血热病毒、Sabia相关出血热病毒、委内瑞拉(Venezuelan)出血热病毒、拉沙热病毒(Lassafevervirus))、马丘波病毒(Machupovirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(例如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒)、汉坦病毒(Hantavirus)、导致出血热与肾综合征的病毒、立夫特山谷(RiftValley)热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)(包含埃博拉出血热和马堡(Marburg)出血热)、黄病毒科(包含卡依萨努森林病(KaysanurForestdisease)病毒)、鄂木斯克(Omsk)出血热病毒、导致蜱传脑炎的病毒和副粘病毒科(例如亨德拉病毒(Hendravirus)和尼帕病毒(Nipahvirus))、重型天花和轻型天花(天花)、甲病毒(alphavirus)(例如委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒(WestNilevirus)、任何导致脑炎的病毒。在一个实施例中，包装细胞产生用VSV-G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒(例如，慢病毒)。如本文中所使用，术语“假型”或“假型化”是指病毒包膜蛋白已经被另一具有优选特征的病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。举例来说，HIV可以用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，所述包膜蛋白使得HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈现细胞。在一优选实施例中，用VSV-G假型化慢病毒包膜蛋白。在一个实施例中，包装细胞产生用VSV-G包膜糖蛋白假型化的重组逆转录病毒(例如，慢病毒)。如本文中所使用，术语“包装细胞系”关于不含有包装信号但稳定或瞬时表达为正确包装病毒颗粒所需的病毒结构蛋白和复制酶(例如，gag、pol和env)的细胞系使用。可以采用任何适合细胞系来制备包装细胞。一般来说，细胞是哺乳动物细胞。在一特定实施例中，用以产生包装细胞系的细胞是人类细胞。可使用的适合细胞系包含(例如)：CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Ψ-2细胞、BOSC23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC1细胞、BSC40细胞、BMT10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞以及211A细胞。在优选实施例中，包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。在另一优选实施例中，细胞为A549细胞。如本文中所使用，术语“生产细胞系”是指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，包括包装细胞系和包括包装信号的转移载体构建体。感染性病毒颗粒和病毒储备溶液的产生可以使用常规技术执行。制备病毒储备溶液的方法在所属领域中是已知的并且由例如Y.Soneoka等人(1995)《核酸研究》23:628-633；和N.R.Landau等人(1992)《病毒学杂志》66:5110-5113说明。感染性病毒颗粒可以使用常规技术从包装细胞收集。举例来说，感染性颗粒可以通过细胞溶解或收集细胞培养物的上清液而收集，如所属领域中已知。任选地，可在必要时纯化所收集的病毒颗粒。适合的纯化技术为所属领域的技术人员所熟知的。基因或其它聚核苷酸序列使用逆转录病毒或慢病毒载体借助于病毒感染而非通过转染的传递被称为“转导”。在一个实施例中，逆转录病毒载体通过感染和原病毒整合而转导到细胞中。在某些实施例中，如果靶细胞(例如，T细胞)包括通过使用病毒或逆转录病毒载体感染而传递到细胞的基因或其它聚核苷酸序列，那么“转导”所述靶细胞。在特定实施例中，转导的细胞在其细胞基因组中包括一种或多种通过逆转录病毒或慢病毒载体传递的基因或其它聚核苷酸序列。在特定实施例中，向个体投予用表达一种或多种多肽的病毒载体转导的宿主细胞以治疗和/或预防B细胞恶性疾病。根据某些实施例可以利用的涉及病毒载体在基因疗法中的使用的其它方法可以见于例如Kay,M.A.(1997)《胸腔(Chest)》111(6增刊):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)《人类基因疗法(Hum.GeneTher.)》9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)《肝脏(Liver)》19:265-74；Oka,K.等人(2000)《脂类学新见(Curr.Opin.Lipidol.)》11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)《基因疗法》7:1744-52；Yang,N.S.(1992)《生物技术评论(Crit.Rev.Biotechnol.)》12:335-56；Alt,M.(1995)《肝脏病学杂志(J.Hepatol.)》23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)《纽约科学院年鉴》716:90-101；Strayer,D.S.(1999)《调研药物专家评论(ExpertOpin.Investig.Drugs)》8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)《最新心脏学报告(Curr.Cardiol.Rep.)》3:43-49；和Lee,H.C.等人(2000)《自然》408:483-8中。G.经遗传修饰的细胞在各种实施例中，提供用于治疗癌症的遗传修饰以表达本文中所涵盖的CAR的细胞。如本文中所使用，术语“遗传工程改造”或“遗传修饰”是指添加呈DNA或RNA形式的额外遗传物质到细胞中的总遗传物质中。术语“遗传修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重导引的细胞”可互换使用。如本文中所使用，术语“基因疗法”是指将呈DNA或RNA形式的额外遗传物质引入到细胞中的总遗传物质中，其恢复、纠正或修饰基因的表达或用于表达治疗多肽(例如，CAR)的目的。在特定实施例中，本文中所涵盖的CAR被引入和表达于免疫效应细胞中以便重导引其针对所关注的靶抗原(例如，表达糖蛋白的STn)的特异性。“免疫效应细胞”是免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的任何细胞。本文中所涵盖的说明性免疫效应细胞是T淋巴细胞，具体地说细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、TIL以及辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀手(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀手T(NKT)细胞。免疫效应细胞可为自身的/自体的(“自我”)或非自体的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中所使用，“自身的”是指来自同一个体的细胞。如本文中所使用，“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞。如本文中所使用，“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同个体的细胞。如本文中所使用，“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在优选实施例中，细胞为同种异体的。与本文中所涵盖的CAR一起使用的说明性免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是领域公认的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其它T细胞子组。适用于特定实施例中的其它说明性T细胞群包括原初T细胞和记忆T细胞。如技术人员将理解，其它细胞也可以用作具有如本文所描述的CAR的免疫效应细胞。具体来说，免疫效应细胞还包含NK细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞以及巨噬细胞。免疫效应细胞还包含效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导所述祖细胞以分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施例中，免疫效应细胞包含免疫效应细胞的祖细胞，例如含于衍生自脐血、骨髓或流动周边血液的CD34+细胞群内的造血干细胞(HSC)，其在个体中投予后分化成成熟免疫效应细胞，或其可以在体外被诱导以分化成成熟免疫效应细胞。如本文中所使用，遗传工程改造以含有STn特异性CAR的免疫效应细胞可以被称为“STn特异性重导引的免疫效应细胞”。如本文中所使用，术语“CD34+细胞”是指在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文中所使用，“CD34”是指通常充当细胞-细胞粘附因子并且参与T细胞进入淋巴结中的细胞表面糖蛋白(例如，唾液粘蛋白)CD34+细胞群含有造血干细胞(HSC)，其在投予到患者后分化并且贡献于所有造血谱系(包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)。用于制备表达本文中所涵盖的CAR的免疫效应细胞的方法提供于特定实施例中。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达一种或多种如本文所描述的CAR。在某些实施例中，免疫效应细胞从个体分离并且在无进一步体外操纵的情况下被遗传修饰。所述细胞然后可以直接再投予到个体中。在其它实施例中，免疫效应细胞首先在体外经活化和刺激以增殖，随后遗传修饰以表达CAR。在这点上，免疫效应细胞可以在被遗传修饰(即，转导或转染以表达本文中所涵盖的CAR)之前和/或之后进行培养。在特定实施例中，在体外操纵或遗传修饰本文所描述的免疫效应细胞之前，细胞来源是获自个体。在特定实施例中，CAR修饰的免疫效应细胞包括T细胞。在特定实施例中，可使用本文中所涵盖的方法直接地遗传修饰PBMC以表达CAR。在某些实施例中，在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施例中，细胞毒性和辅助T淋巴细胞两个都可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后分选成原初、记忆和效应T细胞亚群。可使用已知方法在分离之后遗传修饰免疫效应细胞(例如T细胞)，或可在遗传修饰之前活体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)免疫效应细胞。在一特定实施例中，用本文中所涵盖的嵌合抗原受体遗传修饰(例如，用包括编码CAR的核酸的病毒载体转导)免疫效应细胞(例如T细胞)且接着活体外活化和扩增。在各种实施例中，可使用如描述于以下中的方法在遗传修饰之前或之后活化和扩增T细胞以表达CAR：例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041以及美国专利申请公开第20060121005号。在一个实施例中，用本文中所涵盖的核酸构建体转导CD34+细胞。在某些实施例中，转导的CD34+细胞活体内分化成成熟的免疫效应细胞，随后投予给个体(通常为起初分离细胞的个体)。在另一实施例中，可在暴露于如本文中所描述的CAR之前或在用如本文所描述的CAR遗传修饰之后活体外用以下中的一个或多个细胞因子刺激CD34+细胞：Flt-3配体(FLT3)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长和分化因子(TPO)、根据先前所描述的方法的IL-3和IL-6(Asheuer等人,2004；Imren等人,2004)。在特定实施例中，用于治疗癌症的修饰的免疫效应细胞群包括如本文所公开的CAR。举例来说，修饰的免疫效应细胞群由从诊断患有本文中所描述的B细胞恶性疾病的患者(自身供体)获得的周边血液单核细胞(PBMC)制备。PBMC形成可为CD4+、CD8+，或CD4+和CD8+的异质T淋巴细胞群。PBMC还可包含其它细胞毒性淋巴细胞，例如NK细胞或NKT细胞。将携带本文中所涵盖的CAR的编码序列的表达载体引入到人类供体T细胞、NK细胞或NKT细胞群中。在特定实施例中，可使用流式细胞测量术分选携带表达载体的成功转导的T细胞以分离CD3阳性T细胞，且接着进一步繁殖以增加除使用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体和IL-2或如本文中其它地方所描述的在所属领域中已知的任何其它方法活化的细胞以外的表达T细胞的这些CAR蛋白质的数目。标准程序用于将表达CAR蛋白T细胞的T细胞冷冻保存以供存储和/或制备以用于人类个体。在一个实施例中，在非人动物衍生的产物(例如胎牛血清(fetalcalfserum和fetalbovineserum))不存在的情况下执行T细胞的活体外转导、培养和/或扩增。由于遗传修饰了异质PBMC群，所得转导的细胞为包括如本文中所涵盖的靶向CAR的表达糖蛋白的STn的异质的修饰的细胞群。在另一实施例中，例如一个、二个、三个、四个、五个或更多个不同表达载体的混合物可用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群，其中每个载体编码如本文中所涵盖的不同嵌合抗原受体蛋白。所得修饰的免疫效应细胞形成修饰的细胞的混合群，其中一部分修饰的细胞表达多于一种不同的CAR蛋白质。H.T细胞制造方法在各种实施例中，通过与刺激CD3TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞的表面上的共刺激分子的配体接触来扩增遗传修饰的T细胞。在特定实施例中，PBMC或分离的T细胞在具有适当细胞因子(例如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中与刺激试剂和共刺激试剂(例如可溶抗CD3和抗CD28抗体或附着到珠粒或其它表面的抗体)接触。在特定实施例中，PBMC或分离的T细胞在具有适当细胞因子(例如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基和/或调节PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的一种或多种试剂中与刺激试剂和共刺激试剂(例如可溶抗CD3和抗CD28抗体或附着到珠粒或其它表面的抗体)接触。在优选实施例中，通过本文中所涵盖的方法制造的T细胞提供改进的过继性免疫疗法组合物。不希望受任何特定理论束缚，相信通过本文中所涵盖的特定实施例中的方法制造的T细胞组合物富有优良性质，包含增加的存活率、分化的相对缺失的扩增和活体内存留率。在一个实施例中，一种制造T细胞的方法包括使细胞与调节PI3K细胞信号传导途径的一种或多种试剂接触。在一个实施例中，一种制造T细胞的方法包括使细胞与调节PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的一种或多种试剂接触。在各种实施例中，T细胞可从任何来源获得并在制造制程的活化和/或扩增阶段期间与试剂接触。所得T细胞组合物富含具有增殖和表达以下生物标记中的一种或多种的能力的发育有力T细胞：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、CD38以及CD8。在一个实施例中，已用一种或多种PI3K抑制剂处理的包括T细胞的细胞群富含共表达以下生物标记中的一种或多种或全部的CD8+T细胞群：CD62L、CD127、CD197以及CD38。在一个实施例中，已用一种或多种PI3K抑制剂处理的包括T细胞的细胞群富含共表达以下生物标记中的一种或多种或全部的CD8+T细胞群：CD62L、CD127、CD27以及CD8。在一个实施例中，制造包括维持的增殖水平和减少的分化的修饰的T细胞。在一特定实施例中，在一个或多个刺激信号和为PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的试剂的存在下通过刺激T细胞以变得活化且增殖来制造T细胞。可接着修饰T细胞以表达抗STnCAR。在一个实施例中，通过用包括本文中所涵盖的抗STnCAR的病毒载体转导T细胞来修饰T细胞。在某一实施例中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的存在下在刺激和活化之前修饰T细胞。在另一实施例中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的存在下在刺激和活化之后修饰T细胞。在一特定实施例中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的存在下在刺激和活化的12小时、24小时、36小时或48小时内修饰T细胞。在活化T细胞之后，培养细胞以增殖。可用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多轮的扩增培养T细胞至少1、2、3、4、5、6、或7天，至少2周，至少1、2、3、4、5或6个月或更久。在各种实施例中，在PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的一种或多种抑制剂的存在下制造T细胞组合物。抑制剂可靶向途径中的一种或多种活性或单一活性。不希望受任何特定理论束缚，设想在制造过程的刺激、活化和/或扩增阶段期间处理T细胞或使T细胞与PI3K途径的一种或多种抑制剂接触优选地增加幼龄T细胞，由此产生优良治疗性T细胞组合物。在一特定实施例中，提供一种用于增加表达工程改造的T细胞受体的T细胞的增殖的方法。这些方法可包含例如：收集来自个体的T细胞来源，在PI3K途径的一种或多种抑制剂的存在下刺激和活化T细胞，修饰T细胞以表达抗STnCAR，且扩增培养物中的T细胞。在某一实施例中，涵盖一种用于产生富含以下生物标记中的一种或多种的表达的T细胞群的方法：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、CD38以及CD8。在一个实施例中，幼龄T细胞包括以下生物标记中的一种或多种或全部：CD62L、CD127、CD197以及CD38。在一个实施例中，幼龄T细胞包括以下生物标记中的一种或多种或全部：CD62L、CD127、CD27以及CD8。在一个实施例中，提供不具有CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3以及LAG3的表达的幼龄T细胞。如本文中其它地方所论述，幼龄T细胞生物标记的表达水平与再分化的T细胞或免疫效应细胞群中的这些标记的表达水平有关。在一个实施例中，周边血液单核细胞(PBMC)用作本文中所涵盖的T细胞制造方法中的T细胞来源。PBMC形成可为CD4+、CD8+，或CD4+和CD8+且可包含例如单核细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞的其它单核细胞的异质T淋巴细胞群。可将包括编码本文中所涵盖的工程改造的TCR或CAR的聚核苷酸的表达载体引入到人类供体T细胞、NK细胞或NKT细胞群中。在一特定实施例中，可使用流式细胞测量术分选携带表达载体的成功转导的T细胞以分离CD3阳性T细胞且接着进一步繁殖以增加除了使用抗CD3抗体和或抗CD28抗体和IL-2、IL-7和/或IL-15活化的细胞以外的修饰的T细胞的数目。本文中所涵盖的制造方法可进一步包括冷冻保存修饰的T细胞以供存储和/或制备以用于人类个体。在一个实施例中，提供一种存储表达免疫效应细胞的遗传修饰的鼠类、人类或人类化CAR蛋白质(其靶向表达糖蛋白的STn)的方法，所述方法包括冷冻保存免疫效应细胞以使得所述细胞在解冻后保持可用。表达CAR蛋白质的一部分免疫效应细胞可通过所属领域中已知的方法冷冻保存以提供这些细胞的永久性来源以用于将来治疗罹患在癌细胞中表达的表达糖蛋白的STn的患者。冻保存T细胞，使得所述细胞在解冻后保持可用。在需要时，冷冻保存的转化后的免疫效应细胞可解冻、生长和扩增更多这些细胞。如本文中所使用，“冷冻保存”是指通过冷却到零下温度(例如(通常)77K或-196℃)(液氮的沸点)来保存细胞。通常在零下温度下使用冷冻保护的试剂以防止保存的细胞由于在低温下冻结或升温到室温免遭损坏。冷冻保存的试剂和最优冷却速率可保护细胞免受损伤。可使用的冷冻保护的试剂包含(但不限于)二甲亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,《自然》,1959；183:1394-1395；Ashwood-Smith,《自然》,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret,《纽约科学院年鉴》,1960；85:576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,《自然》,1962；196:48)。优选的冷却冷却是每分钟1℃到3℃。在至少两个小时之后，T细胞已到达-80℃的温度且可直接地放置到用于永久存储的液氮(-196℃)中，例如在长期的低温存储容器中。1.T细胞改进的CART细胞组合物的制造提供于特定实施例中。用于CART细胞产生的T细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在优选实施例中，从哺乳动物个体获得T细胞。在一更优选实施例中，从灵长类个体获得T细胞。在最优选实施例中，从人类个体获得T细胞。可从多种来源获得T细胞，包含(但不限于)周边血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、肋膜积液、脾组织以及肿瘤。在某些实施例中，可从使用多种为技术人员已知的技术(例如沉降，例如FICOLLTM分离)从个体收集的血液单位获得T细胞。在一个实施例中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白血细胞、红血细胞以及血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞放在适当缓冲剂或培养基中以用于后续加工。可以用PBS或用不具有钙、镁和大多数(如果不是全部)其它二价阳离子的另一适合溶液来洗涤细胞。如所属领域一般技术人员将理解，洗涤步骤可以通过所属领域技术人员已知的方法(例如通过使用半自动化流通式离心机)实现。举例来说，Cobe2991细胞加工器、BaxterCytoMate等。在洗涤之后，细胞可以再悬浮于多种生物相容性缓冲剂或具有或不具有缓冲剂的其它生理盐水溶液中。在某些实施例中，单采血液成分术样品的不合需要的组分可以在细胞直接再悬浮的培养基中被去除。在特定实施例中，包括T细胞的细胞(例如，PBMC)群用于本文中所涵盖的制造方法中。在其它实施例中，分离的或纯化的T细胞群用于本文中所涵盖的制造方法中。细胞可以通过以下方式从周边血液单核细胞(PBMC)分离：例如借助于通过PERCOLLTM梯度离心而溶解红血细胞和耗尽单核细胞。在一些实施例中，在分离PBMC之后，细胞毒性和辅助T淋巴细胞两个都可以在活化、扩增和/或遗传修饰之前或之后分选成原初、记忆和效应T细胞亚群。在特定实施例中，包括T细胞的细胞(例如，PBMC)群用于本文中所涵盖的制造方法中。在其它实施例中，分离的或纯化的T细胞群用于本文中所涵盖的制造方法中。细胞可以通过以下方式从周边血液单核细胞(PBMC)分离：例如借助于通过PERCOLLTM梯度离心而溶解红血细胞和耗尽单核细胞。在一些实施例中，在分离PBMC之后，细胞毒性和辅助T淋巴细胞两个都可以在活化、扩增和/或遗传修饰之前或之后分选成原初、记忆和效应T细胞亚群。在特定实施例中，免疫效应细胞群使用本文中所涵盖的方法由遗传修饰以表达CAR的PBMC制成，但未经受阳性或阴性选择。在某些实施例中，在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施例中，细胞毒性和辅助T淋巴细胞两个都可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后分选成原初、记忆和效应T细胞亚群。在某些实施例中，可进一步通过阳性或阴性选择技术来分离表达以下标记中的一种或多种的T细胞的特异性亚群：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127以及HLA-DR。在一个实施例中，进一步通过阳性或阴性选择技术来分离表达选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的T细胞的特异性亚群：i)CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；ii)CD62L、CD127、CD197以及CD38；或iii)CD62L、CD127、CD27以及CD8。在各种实施例中，制造的T细胞组合物不表达或实质上不表达以下标记中的一种或多种：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3以及LAG3。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的表达增加了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍数或更多倍：i)CD62L、CD127、CD197以及CD38；或ii)CD62L、CD127、CD27以及CD8。在一个实施例中，T细胞包括CD8+T细胞。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的表达减少了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3以及LAG3。在一个实施例中，T细胞包括CD8+T细胞。在一个实施例中，本文中所涵盖的制造方法增加了包括原初或发育有力的T细胞的一种或多种标记的CART细胞的数目。不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信，用一种或多种PI3K抑制剂处理包括T细胞的细胞群导致发育有力的T细胞的扩增增加，并且提供了相较于现有CART细胞疗法更稳定并且有效的过继CART细胞免疫疗法。在使用本文中所涵盖的方法制造T细胞中增加的原初或发育有力的T细胞的标记的说明性实例包含(但不限于)：i)CD62L、CD127、CD197以及CD38；或ii)CD62L、CD127、CD27以及CD8。在特定实施例中，原初T细胞不表达或实质上不表达以下标记中的一种或多种：CD57、CD244、CD160、PD-1、BTLA、CD45RA、CTLA4、TIM3以及LAG3。相对于T细胞，由本文中所涵盖的各种扩增方法产生的T细胞群可以取决于所利用的条件而具有多种特定表型性质。在各种实施例中，扩增的T细胞群包括以下表型标记中的一种或多种：CD62L、CD27、CD127、CD197、CD38、CD8以及HLA-DR。在一个实施例中，这些表型标记包含CD62L、CD127、CD197以及CD38中的一种或多种或全部的增强的表达。在特定实施例中，使特征在于原初T细胞的表型标记(包含CD62L、CD127、CD197以及CD38)的表达的CD8+T淋巴细胞扩增。在一个实施例中，这些表型标记包含CD62L、CD127、CD27以及CD8中的一种或多种或全部的增强的表达。在特定实施例中，使特征在于原初T细胞的表型标记(包含CD62L、CD127、CD27以及CD8)的表达的CD8+T淋巴细胞扩增。在特定实施例中，使特征在于中心记忆T细胞的表型标记(包含CD45RO、CD62L、CD127、CD197以及CD38)的表达并且对于粒酶B阴性的T细胞扩增。在一些实施例中，中心记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在某些实施例中，使特征在于原初CD4+细胞的表型标记(包含CD62L)的表达并且对于CD45RA和/或CD45RO的表达阴性的CD4+T淋巴细胞扩增。在一些实施例中，特征在于中心记忆CD4+细胞的表型标记(包含CD62L和CD45RO)的表达的CD4+细胞阳性。在一些实施例中，效应CD4+细胞是CD62L阳性并且CD45RO阴性的。在某些实施例中，T细胞从个体分离，并且在体外活化和刺激以增殖，随后遗传修饰以表达抗STnCAR。在这点上，T细胞可以在遗传修饰(即，转导或转染以表达本文中所涵盖的抗STn)之前和/或之后进行培养。2.活化和扩增为了实现T细胞组合物的充足治疗剂量，T细胞通常经历一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。T细胞可以通常使用如例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514和6,867,041中所描述的方法来活化和扩增，所述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。可以在修饰T细胞之前和/或之后活化和扩增修饰以表达抗STnCAR的T细胞。另外，T细胞可以在活化和/或扩增之前、期间和/或之后与一种或多种调节PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的试剂接触。在一个实施例中，通过本文中所涵盖的方法制造的T细胞历经一轮、两轮、三轮、四轮或五轮或更多轮活化和扩增，其中的每一者可以包含一种或多种调节PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的试剂。与天然APC的用途相反，人工抗原呈现细胞(aAPC)支持功能性人类CD8+T细胞的离体生长和长期扩增，且不需要添加外源细胞因子。在特定实施例中，PBMC或分离的T细胞在具有适当细胞因子(例如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中与刺激试剂和共刺激试剂(例如通常附着到珠粒或其它表面的抗CD3和抗CD28抗体)接触。在其它实施例中，人工APC(aAPC)通过工程改造K562、U937、721.221、T2和C1R细胞以导引多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌而制备。在一特定实施例中，K32或U32aAPC用于导引一个或多个基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上的显示。T细胞群可通过表达多种共刺激分子的aAPC来扩增，所述多种共刺激分子包含(但不限于)CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。aAPC提供用以扩展遗传修饰的T细胞且维持CD8+T细胞上的CD28表达的有效平台。aAPC提供于WO03/057171和US2003/0147869中，其以全文引用的方式并入本文中。在一个实施例中，共刺激配体呈现于特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈现细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上，由此除了通过例如结合TCR/CD3复合物而提供的初级信号之外，还提供介导所要T细胞应答的信号。适合的共刺激配体包含(但不限于)CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体，以及特异性结合B7-H3的配体。在一特定实施例中，共刺激配体包括特异性结合到存在于T细胞上的共刺激分子的抗体或其抗原结合片段，包含(但不限于)CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特异性结合CD83的配体。适合的共刺激配体进一步包含靶抗原，其可以以可溶形式提供或表达于结合表达于修饰的T细胞上的工程改造的TCR或CAR的APC或aAPC上。在各种实施例中，本文中所涵盖的制造T细胞的方法包括活化包括T细胞的细胞群和使T细胞群扩增。T细胞活化可以通过经由T细胞TCR/CD3复合物或经由刺激CD2表面蛋白提供初级刺激信号和通过经由辅助分子(例如，CD28)提供二级共刺激信号而实现。TCR/CD3复合物可以通过使T细胞与适合CD3结合剂(例如，CD3配体或抗CD3单克隆抗体)接触而受刺激。CD3抗体的说明性实例包含(但不限于)OKT3、G19-4、BC3和64.1。在另一实施例中，CD2结合剂可以用以向T细胞提供初级刺激信号。CD2结合剂的说明性实例包含(但不限于)CD2配体和抗CD2抗体，例如T11.3抗体组合T11.1或T11.2抗体(Meuer,S.C.等人(1984)《细胞》36:897-906)和9.6抗体(其识别与TI1.1相同的表位)组合9-1抗体(Yang,S.Y.等人(1986)《免疫学杂志》137:1097-1100)。也可以使用结合到与以上所描述抗体中的任一种相同的表位的其它抗体。额外抗体或抗体组合可以通过如本文别处所公开的标准技术制备和鉴别。除了经由TCR/CD3复合物或经由CD2提供的初级刺激信号之外，诱导T细胞应答需要第二共刺激信号。在特定实施例中，CD28结合剂可以用以提供共刺激信号。CD28结合剂的说明性实例包含(但不限于)：天然CD28配体，例如CD28的天然配体(例如，蛋白质B7家族的成员，例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86))；和能够交联CD28分子的抗CD28单克隆抗体或其片段，例如单克隆抗体9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2以及EX5.3D10。在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子(例如经由TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)与共刺激分子偶合到相同表面。在某些实施例中，提供刺激和共刺激信号的结合剂定位于细胞表面上。这可以通过用编码结合剂(呈适用于其于细胞表面上表达的形式)的核酸转染或转导细胞或者通过使结合剂偶合到细胞表面而实现。在另一实施例中，提供初级刺激信号的分子(例如经由TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)与共刺激分子呈现于抗原呈现细胞上。在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子(例如经由TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)与共刺激分子提供于独立表面上。在某一实施例中，提供刺激和共刺激信号的结合剂中的一种是可溶的(提供于溶液中)并且其它结合剂提供于一个或多个表面上。在一特定实施例中，提供刺激和共刺激信号的结合剂都以可溶形式提供(提供于溶液中)。在各种实施例中，本文中所涵盖的制造T细胞的方法包括用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞。通过本文中所涵盖的方法制造的T细胞组合物包括在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的试剂存在下活化和/或扩增的T细胞。可以在修饰T细胞之前和/或之后活化和扩增修饰以表达抗STnCAR的T细胞。在特定实施例中，T细胞群被活化，修饰以表达抗STnCAR，并且然后培养其以便扩增。在一个实施例中，通过本文中所涵盖的方法制造的T细胞包括增加数目的表达指示高增殖潜力并且能够自我更新的标记但不表达或实质上表达不可检测的T细胞分化标记的T细胞。这些T细胞可以以稳定方式反复地活化和扩增并且由此提供改进的治疗性T细胞组合物。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的试剂的存在下活化和扩增的T细胞群扩增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，特征在于幼龄T细胞标记的表达的T细胞群在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的试剂的存在下活化和扩增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。在一个实施例中，使通过本文中所涵盖的方法活化的T细胞扩增进一步包括培养包括T细胞的细胞群体数小时(约3小时)到约7天到约28天或中间的任何每小时整数值。在另一实施例中，可以培养T细胞组合物14天。在一特定实施例中，培养T细胞约21天。在另一实施例中，培养T细胞组合物约2-3天。还可能需要若干刺激/活化/扩增循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更久。在特定实施例中，适合于T细胞培养的条件包含适当培养基(例如，MinimalEssentialMedia或RPMIMedia1640、X-vivo15(隆萨(Lonza)))，且增殖和存活必需的一个或多个因子包含(但不限于)血清(例如，胎牛血清或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或所属领域的技术人员已知的适用于生长细胞的任何其它添加剂。细胞培养基的另外的说明性实例包含(但不限于)RPMI1640、Clicks、AIM-V、DMEM、MEM、MEM、F-12、X-Vivo15以及X-Vivo20、Optimizer，其中添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或已定义的一组激素和/或足以生长和扩增T细胞的细胞因子的量。其它用于T细胞扩增的添加剂的说明性实例包含(但不限于)表面活性剂、人血浆蛋白制剂、pH缓冲剂(例如HEPES)和还原剂(例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包含于实验培养物中，不包含于待输注到个体中的细胞培养物中。靶细胞在为支持生长所必需的条件下维持，例如适当温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。3.试剂在各种实施例中，提供了一种使未分化的或发育有力的T细胞扩增的制造T细胞的方法，其包括使T细胞与调节细胞中的PI3K途径的试剂接触。在各种实施例中，提供了一种使未分化的或发育有力的T细胞扩增的制造T细胞的方法，其包括使T细胞与调节细胞中的PI3K/AKT/mTOR途径的试剂接触。细胞可以在活化和扩增之前、期间和/或之后进行接触。T细胞组合物保留充足T细胞效力，使得其可以经历多轮扩增而不使分化实质性增加。如本文中所使用，术语“调节”、“调节剂(modulator)”或“调节剂(modulatoryagent)”或相当术语是指试剂引发细胞信号传导途径的变化的能力。调节剂可以增加或减小途径组分的量、活性或增加或减小细胞信号传导途径的所要效果或结果。在一个实施例中，调节剂是抑制剂。在另一实施例中，调节剂是活化剂。“试剂”是指化合物、小分子，例如用于调节PI3K/AKT/mTOR途径的小有机分子、核酸、多肽或片段、同工型、变异体、类似物或其衍生物。“小分子”是指分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约0.5kD的组合物。小分子可以包括核酸、肽、多肽、肽模拟物、类肽、碳水化合物、脂质、其组分或其它有机或无机分子。化学和/或生物混合物(例如真菌、细菌或藻类萃取物)的文库在所属领域中是已知的且可用分析中的任一种进行筛选。用于合成分子文库的方法的实例可以见于Carell等人,1994a；Carell等人,1994b；Cho等人,1993；DeWitt等人,1993；Gallop等人,1994；Zuckermann等人,1994中。“类似物”是指与化合物、核苷酸、蛋白质或多肽或具有所要活性的化合物具有类似或相同活性或功能的较小有机化合物、核苷酸、蛋白质或多肽，但不需要必须包括与优选实施例的序列或结构类似或相同的序列或结构。“衍生物”是指包括已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的亲本蛋白质或多肽，或已经通过引入核苷酸取代或缺失、添加或突变而修饰的核酸或核苷酸的氨基酸序列的化合物、蛋白质或多肽。衍生核酸、核苷酸、蛋白质或多肽具有与亲本多肽类似或相同的功能。在各种实施例中，调节PI3K途径的试剂活化途径组分。“活化剂”或“激动剂”是指促进、增加或诱导PI3K/AKT/mTOR途径中的分子的一种或多种活性的试剂，包含(但不限于)抑制PI3K的一种或多种活性的分子。在各种实施例中，调节PI3K途径的试剂抑制途径组分。“活化剂”或“激动剂”是指抑制、减小或降低PI3K/AKT/mTOR途径中的分子的一种或多种活性的试剂，包含(但不限于)抑制PI3K的一种或多种活性的分子。在一个实施例中，抑制剂是双重分子抑制剂。在特定实施例中，抑制剂可以抑制一类具有相同或实质上类似活性的分子(泛抑制剂)或可以特异性抑制分子的活性(选择性或特异性抑制剂)。抑制还可以是不可逆或可逆的。在一个实施例中，抑制剂的IC50是至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM或至少100μM。IC50测定可以使用所属领域中已知的任何常规技术实现。举例来说，IC50可以通过测量既定酶在一系列浓度的研究抑制剂存在下的活性而测定。然后绘制以实验方式获得的酶活性值相对于所用抑制剂浓度。展示出50％酶活性(相比于在不存在任何抑制剂情况下的活性)的抑制剂的浓度视为IC50值。类似地，可以通过活性的恰当测定定义其它抑制性浓度。在各种实施例中，T细胞与一种或多种以下浓度的PI3K/AKT/mTOR途径调节剂接触或用其处理或培养：至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM或至少1M。在特定实施例中，T细胞可以历经1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮或更多轮扩增与一种或多种PI3K/AKT/mTOR途径调节剂接触或用其处理或培养至少12小时，18小时，至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2周、至少1、2、3、4、5或6个月或更久。磷脂酰-肌醇-3激酶/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶途径充当整合生长因子信号传导与细胞增殖、分化、代谢和存活的渠道。PI3K是高度保守的胞内脂质激酶家族。IA类PI3K直接地或经由与胰岛素受体底物家族的衔接分子相互作用由生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)活化。这种活性导致产生3,4,5-三磷酸磷脂酰-肌醇(PIP3)，丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的调节子。mTOR通过典型PI3K途径经由2种各自特征在于赋予独特活性的不同结合伴侣的独特复合物作用。mTORC1(mTOR与PRAS40、raptor以及mLST8/GbL的复合物)充当PI3K/Akt信号传导的下游效应子，使生长因子信号与蛋白质转译、细胞生长、增殖和存活相关。mTORC2(mTOR与rictor、mSIN1、protor以及mLST8的复合物)充当Akt的上游活化子。在生长因子受体介导的PI3K活化后，Akt经由其普列克底物蛋白同源性域与PIP3的相互作用募集到膜，因此暴露其活化环并且通过组成型活性的磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)实现苏氨酸308(Thr308)处的磷酸化。为获得最大活化，Akt还通过mTORC2在其C末端疏水性基序的丝氨酸473(Ser473)处磷酸化。DNA-PK和HSP也已经显示在调节Akt活性方面很重要。Akt经由TSC2的抑制性磷酸化活化mTORC1，TSC2与TSC1一起通过抑制RhebGTP酶(mTORC1的正调节子)负调节mTORC1。mTORC1具有2种定义明确的底物，p70S6K(下文称为S6K1)和4E-BP1，其两个都审慎地调节蛋白质合成。因此，mTORC1是PI3K的重要下游效应子，使生长因子信号传导与蛋白质转译和细胞增殖相关。a.PI3K抑制剂如本文中所使用，术语“PI3K抑制剂”是指结合到PI3K并且抑制其至少一种活性的核酸、肽、化合物或小有机分子。PI3K蛋白可以分成三类，1类PI3K、2类PI3K以及3类PI3K。1类PI3K以由四种p110催化亚单位(p110α、p110β、p110δ和p110γ)中的一种和两种调节亚单位家族中的一种组成的杂二聚体形式存在。在特定实施例中，PI3K抑制剂优选地靶向1类PI3K抑制剂。在一个实施例中，PI3K抑制剂将呈现对1类PI3K抑制剂的一种或多种同工型的选择性(即，对p110α、p110β、p110δ和p110γ、或p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一种或多种的选择性)。在另一实施例中，PI3K抑制剂将不呈现同工型选择性并且被视为“泛PI3K抑制剂”。在一个实施例中，PI3K抑制剂将与ATP为结合到PI3K催化域而竞争。在某些实施例中，PI3K抑制剂可以例如靶向PI3K以及PI3K-AKT-mTOR途径中的其它蛋白质。在特定实施例中，靶向mTOR和PI3K两个的PI3K抑制剂可以被称为mTOR抑制剂或PI3K抑制剂。仅靶向PI3K的PI3K抑制剂可以被称为选择性PI3K抑制剂。在一个实施例中，选择性PI3K抑制剂可理解为是指展现比关于途径中的mTOR和/或其它蛋白质的抑制剂IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍的关于PI3K的50％抑制浓度的试剂。在一特定实施例中，示范性PI3K抑制剂以约200nM或更小、优选约100nM或更小、甚至更优选约60nM或更小、约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制PI3K。在一个实施例中，PI3K抑制剂以约2nM到约100nM、更优选约2nM到约50nM、甚至更优选约2nM到约15nM的IC50抑制PI3K。适用于本文中所涵盖的T细胞制造方法中的PI3K抑制剂的说明性实例包含(但不限于)BKM120(1类PI3K抑制剂，诺华(Novartis))、XL147(1类PI3K抑制剂，伊克塞利克斯(Exelixis))、(泛PI3K抑制剂，葛兰素史克(GlaxoSmithKline))和PX-866(1类PI3K抑制剂；p110α、p110β和p110γ同工型，赛瑞恩肿瘤药剂(Oncothyreon))。选择性PI3K抑制剂的其它说明性实例包含(但不限于)BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、ZSTK474以及IPI-145。泛PI3K抑制剂的另外的说明性实例包含(但不限于)BEZ235、LY294002、GSK1059615、TG100713以及GDC-0941。在一优选实施例中，PI3K抑制剂为ZSTK474。b.AKT抑制剂如本文中所使用，术语“AKT抑制剂”是指抑制AKT的至少一种活性的核酸、肽、化合物或小有机分子。AKT抑制剂可以分组成若干类，包括基于脂质的抑制剂(例如，靶向AKT的防止AKT定位到质膜的普列克底物蛋白同源性域的抑制剂)、ATP竞争性抑制剂和变构抑制剂。在一个实施例中，AKT抑制剂通过结合到AKT催化位点而作用。在一特定实施例中，Akt抑制剂通过抑制下游AKT靶(例如mTOR)的磷酸化而作用。在另一实施例中，AKT活性通过经由抑制例如AKT的DNA-PK活化、AKT的PDK-1活化和/或Akt的mTORC2活化来抑制活化Akt的输入信号而受抑制。AKT抑制剂可以靶向所有三种AKT同工型AKT1、AKT2、AKT3，或可以是同工型选择性的并且仅靶向一种或两种AKT同工型。在一个实施例中，AKT抑制剂可以靶向AKT以及PI3K-AKT-mTOR途径中的其它蛋白质。仅靶向AKT的AKT抑制剂可以被称为选择性AKT抑制剂。在一个实施例中，选择性AKT抑制剂可以理解为指展现比关于途径中的其它蛋白质的抑制剂IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍的关于AKT的50％抑制浓度的试剂。在一特定实施例中，示范性AKT抑制剂以约200nM或更小、优选约100nM或更小、甚至更优选约60nM或更小、约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制AKT。在一个实施例中，AKT以约2nM到约100nM、更优选约2nM到约50nM、甚至更优选约2nM到约15nM的IC50抑制AKT。用于与基于奥瑞他汀的抗体-药物结合物组合使用的AKT抑制剂的说明性实例包含例如哌立福新(克律克斯(Keryx))、MK2206(默克(Merck))、VQD-002(VioQuest)、XL418(伊克塞利克斯)、GSK690693、GDC-0068和PX316(PROLX制药)。选择性Akt1抑制剂的说明性非限制性实例是A-674563。选择性Akt2抑制剂的说明性非限制性实例是CCT128930。在特定实施例中，Akt抑制剂Akt的DNA-PK活化、Akt的PDK-1活化、Akt的mTORC2活化或Akt的HSP活化。DNA-PK抑制剂的说明性实例包含(但不限于)NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75以及PP-121。c.mTOR抑制剂术语“mTOR抑制剂”或“抑制mTOR的试剂”是指抑制其至少一种底物(例如，p70S6激酶1、4E-BP1、AKT/PKB和eEF2)上的mTOR蛋白的至少一种活性(例如，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性)的核酸、肽、化合物或小有机分子。mTOR抑制剂能够直接结合到并且抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2两个。mTORC1和/或mTORC2活性的抑制可以通过PI3K/Akt/mTOR途径的信号转导的降低来测定。多种多样的读出可以用以确立所述信号传导途径的输出的降低。一些非限制性示范性读出包含：(1)包含(但不限于)5473和T308的残基处Akt磷酸化的降低；(2)Akt活化的降低，如例如Akt底物(包含(但不限于)Fox01/O3aT24/32、GSK3a/β、S21/9和TSC2T1462)的磷酸化的降低所证明；(3)mTOR下游的信号传导分子(包含(但不限于)核糖体S6S240/244、70S6KT389和4EBP1T37/46)的磷酸化的降低；和(4)癌细胞的增殖的抑制。在一个实施例中，mTOR抑制剂是活性位点抑制剂。其是结合到mTOR的ATP结合位点(也称为ATP结合袋)并且抑制mTORC1和mTORC2两个的催化活性的mTOR抑制剂。适用于本文中所涵盖的T细胞制造方法中的一类活性位点抑制剂是靶向并且直接抑制PI3K和mTOR两个的双重特异性抑制剂。双重特异性抑制剂结合到mTOR和PI3K两个的ATP结合位点。所述抑制剂的说明性实例包含(但不限于)：咪唑并喹唑啉、渥曼青霉素、LY294002、PI-103(开曼化工(CaymanChemical))、SF1126(赛玛弗(Semafore))、BGT226(诺华)、XL765(伊克塞利克斯)和NVP-BEZ235(诺华)。适用于本文中所涵盖的方法中的另一类mTOR活性位点抑制剂相对于一种或多种I型磷脂酰肌醇3激酶(例如，PI3激酶α、β、γ或δ)选择性地抑制mTORC1和mTORC2活性。这些活性位点抑制剂结合到mTOR的活性位点但不结合到PI3K的活性位点。所述抑制剂的说明性实例包含(但不限于)：吡唑并嘧啶、Torin1(Guertin和Sabatini)、PP242(2-(4-氨基-1-异丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-醇)、PP30、Ku-0063794、WAY-600(惠氏(Wyeth))、WAY-687(惠氏)、WAY-354(惠氏)和AZD8055(Liu等人,《自然综述(NatureReview)》,8,627-644,2009)。在一个实施例中，选择性mTOR抑制剂是指展现比关于一种、两种、三种或更多种I型PI3激酶或所有I型PI3激酶的抑制剂IC50低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍的关于mTORC1和/或mTORC2的50％抑制浓度(IC50)的试剂。用于特定实施例中的另一类mTOR抑制剂在本文中称为“雷帕霉素类似物”。如本文中所使用，术语“雷帕霉素类似物”是指特异性结合到mTORFRB域(FKBP雷帕霉素结合域)、结构上与雷帕霉素相关并且保留mTOR抑制性质的化合物。术语雷帕霉素类似物排除了雷帕霉素。雷帕霉素类似物包含雷帕霉素的酯、醚、肟、腙和羟胺以及雷帕霉素核心结构上的官能团已经通过还原或氧化而改性的化合物。这些化合物的药学上可接受的盐也被视为雷帕霉素衍生物。适用于本文中所涵盖的方法中的雷帕霉素类似物的说明性实例包含(但不限于)坦罗莫司(CC1779)、依维莫司(RAD001)、地磷莫司(AP23573)、AZD8055(阿斯利康(AstraZeneca))和OSI-027(OSI)。在一个实施例中，试剂是mTOR抑制剂雷帕霉素(西罗莫司)。在一特定实施例中，示范性mTOR抑制剂以约200nM或更小、优选约100nM或更小、甚至更优选约60nM或更小、约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2两个。在一个实施例中，mTOR抑制剂以约2nM到约100nM，更优选约2nM到约50nM，甚至更优选约2nM到约15nM的IC50抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2两个。在一个实施例中，示范性mTOR抑制剂以约200nM或更小、优选约100nM或更小、甚至更优选约60nM或更小、约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制PI3K和mTORC1或mTORC2，或mTORC1和mTORC2两个和PI3K。在一个实施例中，mTOR抑制剂以约2nM到约100nM，更优选约2nM到约50nM，甚至更优选约2nM到15nM的IC50抑制PI3K和mTORC1或mTORC2，或mTORC1和mTORC2两个和PI3K。适用于特定实施例中的mTOR抑制剂的另外的说明性实例包含(但不限于)AZD8055、INK128、雷帕霉素、PF-04691502以及依维莫司。mTOR据显示对生理底物蛋白p70S6核糖体蛋白激酶I(p70S6K1)和eIF4E结合蛋白1(4EBP1)展现稳定并且特异性催化活性，如在蛋白质印迹法(Westernblotting)中通过磷光体特异性抗体所测量。在一个实施例中，PI3K/AKT/mTOR途径的抑制剂是选自由以下组成的群组的s6激酶抑制剂：BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK和AT7867。I.组合物和调配物本文中所涵盖的组合物可以包括一种或多种如本文中所涵盖的多肽、聚核苷酸、包括其的载体、遗传修饰的免疫效应细胞等。组合物包含(但不限于)药物组合物。“药物组合物”是指调配于药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中用于单独或与一种或多种其它治疗模式组合向细胞或动物投予的组合物。还应理解，必要时，所述组合物还可以与其它试剂(例如，细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药学上活性的试剂)组合投予。对也可以包含于组合物中的其它组分几乎没有限制，只要其它试剂不会不利地影响组合物传递预期治疗的能力即可。短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。如本文中所使用，“药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包含(但不限于)已经由美国食品和药物管理局(theUnitedStatesFoodandDrugAdministration)批准为对于用于人类或家畜可接受的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示范性药学上可接受的载剂包含(但不限于)：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动物和植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等张生理盐水；林格氏溶液(Ringer’ssolution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物调配物中采用的任何其它相容物质。在特定实施例中，组合物包括本文中所涵盖的表达CAR的免疫效应细胞的量。如本文中所使用，术语“量”是指遗传修饰的治疗细胞(例如，T细胞)实现有益或所要预防性或治疗性结果(包含临床结果)的“有效的量”或“有效量”。“预防有效量”是指遗传修饰的治疗细胞有效实现所要预防结果的量。典型地但未必，因为预防性剂量在疾病之前或在疾病的较早阶段用于个体，所以预防有效量小于治疗有效量。遗传修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据例如以下的因素而变化：疾病状态；个体的年龄、性别和体重；以及干细胞和祖细胞引发个体中的所要应答的能力。治疗有效量还是病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害效果被治疗有益效果超过的量。术语“治疗有效量”包含可有效地“治疗”个体(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待投予的组合物的精确量可通过医生考量年龄、体重、肿瘤大小、感染或癌转移程度的个体差异和患者(个体)的情况来确定。通常可以规定，包括本文中所描述T细胞的药物组合物可以按102到1010个细胞/kg体重、优选105到106个细胞/kg体重(包含那些范围内的所有整数值)的剂量投予。细胞数目将取决于组合物预期用于的最终用途和其中包括的细胞的类型。对于本文中所提供的用途，细胞通常呈一升或更少的体积，可为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。所要细胞的密度通常大于106个细胞/毫升，并且通常大于107个细胞/毫升，通常是108个细胞/毫升或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配成多个累积等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞的输注。在一些实施例中，具体地说由于所有输注的细胞将重导引到特定靶抗原，可投予在106/千克(每个患者106到1011)范围内的较低数目的细胞。表达CAR的细胞组合物可以按这些范围内的剂量多次投予。细胞对于经历治疗的患者可以是同种异体的、同基因的、异基因的或自身的。必要时，治疗还可以包含如本文中所描述投予有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强免疫应答的诱导。一般来说，包括如本文中所描述活化和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防在免疫功能不全的个体中产生的疾病。具体地说，包括本文中所涵盖的CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗癌症。在特定实施例中，CAR修饰的T细胞可单独投予或作为与载体、稀释剂、赋形剂和/或与例如IL-2的其它组分或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物。在特定实施例中，药物组合物包含一定量的遗传修饰的T细胞，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。包括表达CAR的免疫效应细胞群(例如T细胞)的药物组合物可包括：缓冲剂，例如中性缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在特定实施例中，组合物优选地被配制成用于肠胃外投予，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内投予。液体药物组合物不论是溶液、悬浮液或其它类似形式，都可以包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水溶液(优选生理食盐水)、林格氏溶液、等张氯化钠、不挥发性油(例如可以充当溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可以将肠胃外制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。在一个实施例中，在药学上可接受的细胞培养基中调配本文中所涵盖的T细胞组合物。这些组合物适用于向人类个体投予。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。无血清培养基具有优于含有培养基的血清的若干优点，包含简化的和更好的已定义的组合物、减轻程度的污染、感染剂的潜在来源的消除和低成本。在各种实施例中，无血清培养基是无动物的，且可任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可含有生物制药可接受的重组蛋白。“无动物”培养基是指其中组分衍生自非动物来源的培养基。重组蛋白替换无动物培养基中的天然动物蛋白且从合成物、植物或微生物来源获得养分。相反，“无蛋白质”培养基被定义为大体上不含蛋白质。用于特定组合物中的无血清培养基的说明性实例包含(但不限于)QBSF-60(品质生物有限公司(QualityBiological,Inc.))、StemPro-34(生命技术(LifeTechnologies))以及X-VIVO10。在一个优选实施例中，在包括PlasmaLyteA的溶液中调配包括本文中所涵盖的T细胞的组合物。在另一优选实施例中，在包括冷冻保存培养基的溶液中调配包括本文中所涵盖的T细胞的组合物。举例来说，具有冷冻保存试剂的冷冻保存培养基可用于维持解冻后的较高的细胞存活率结果。用于特定组合物中的冷冻保存培养基的说明性实例包含(但不限于)CryoStorCS10、CryoStorCS5以及CryoStorCS2。在一更优选实施例中，在包括50:50PlasmaLyteA比CryoStorCS10的溶液中调配包括本文中所涵盖的细胞的组合物。在一特定实施例中，组合物包括单独的或与一种或多种治疗剂组合的有效量的表达CAR的免疫效应细胞。因此，表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独或与其它已知癌症治疗(例如辐射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等)组合投予。组合物还可以与抗生素组合投予。所述治疗剂在所属领域中可以可接受为如本文中所描述的特定疾病状态(例如特定癌症)的标准治疗。所涵盖的示范性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、消炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗抗体或其它活性并且辅助性试剂。在某些实施例中，包括本文中所公开的表达CAR的免疫效应细胞的组合物可以与多种化学治疗剂结合投予。化学治疗剂的说明性实例包含：烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包含六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，例如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、二氯甲二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥、胆固醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、奥斯拉菌素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、更生霉素(dactinomycin)、道诺比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙碱(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；乙酸依利铵；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2\"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；类紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布肿瘤学(Bristol-MyersSquibbOncology)，普林斯顿(Princeton),新泽西州)和多西他赛(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony,法国(France))；氯芥苯丁酸；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，例如TargretinTM(贝瑟罗汀(bexarotene))、PanretinTM(亚利崔托宁(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素(denileukindiftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；和以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这个定义中还包含用以调节或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包含例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐、LY117018、奥那司酮((onapristone))和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。多种其它治疗剂可以与本文中所描述的组合物结合使用。在一个实施例中，包括表达CAR的免疫效应细胞的组合物与消炎剂一起投予。消炎剂或药物包含(但不限于)类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢皮质酮(hydrocortisoneacetate)、氢皮质酮(hydrocortisone)、氢皮质酮(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone))；非类固醇消炎药物(NSAIDS)，包含阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药剂、环磷酰胺和霉酚酸酯(mycophenolate)。其它示范性NSAID选自由以下组成的群组：布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂(例如(罗非昔布(rofecoxib))和(塞内昔布(celecoxib))和唾液酸酯。示范性止痛剂选自由以下组成的群组：对乙酰氨基酚、羟考酮、曲马多(tramadol)的丙氧吩盐酸盐。示范性糖皮质激素选自由以下组成的群组：可的松(cortisone)、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙或泼尼松。示范性生物应答修饰剂包含针对细胞表面标记(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂(例如TNF拮抗剂(例如依那西普(etanercept)阿达木单抗(adalimumab)和英利昔单抗(infliximab)))、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答修饰剂包含单克隆抗体以及重组形式的分子。示范性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢霉素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯奎宁、戈尔德(Gold)(口服(金诺芬(auranofin))和肌肉内)和米诺环素(minocycline)。适用于与本文中所涵盖的CAR修饰的T细胞组合的治疗抗体的说明性实例包含(但不限于)巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(avastin))、比伐珠单抗(bivatuzumab)、布林莫单抗(blinatumomab)、康纳木单抗(conatumumab)、达土木单抗(daratumumab)、杜丽戈图单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(HuLuc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、茚达昔单抗(indatuximab)、伊珠单抗(inotuzumab)、洛沃珠单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫昔土莫单抗(moxetumomab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、思图昔单抗(siltuximab)、替普罗木单抗(teprotumumab)以及乌布里图昔单抗(ublituximab)。在某些实施例中，本文中所描述的组合物与细胞因子结合投予。如本文中所使用，“细胞因子”意指由一种细胞群释放的以胞间介体形式作用于另一细胞的蛋白质的通称。所述细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子之中包含生长激素，例如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒氏(mullerian)抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包含LIF和kit配体(KL)。如本文中所使用，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，和天然序列细胞因子的生物活性等效物。在特定实施例中，组合物包括在如本文中所公开的PI3K抑制剂的存在下培养并且表达以下标记中的一种或多种的本文中所涵盖的CART细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127以及HLA-DR，可以进一步通过阳性或阴性选择技术分离所述组合物。在一个实施例中，组合物包括表达选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的T细胞的特异性亚群：i)CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；ii)CD62L、CD127、CD197、CD38；以及iii)CD62L、CD27、CD127以及CD8，进一步通过阳性或阴性选择技术分离所述组合物。在各种实施例中，组合物不表达或不实质上表达以下标记中的一种或多种：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3以及LAG3。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的表达增加了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍：CD62L、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群体相比，选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的表达增加了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍：CD62L、CD127、CD27和CD8。在一个实施例中，与在无PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，选自由以下组成的群组的标记中的一种或多种的表达减少了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3以及LAG3。J.靶细胞和抗原遗传修饰的免疫效应细胞重导引到靶细胞(例如，癌细胞)且包括具有与靶细胞上的表达糖蛋白(例如，TAG-72)的STn结合的结合域的CAR。如本文中所使用，术语“癌症”大体上涉及其中异常细胞分裂不受控制且可侵袭邻近组织的一类疾病或病况。如本文中所使用，术语“恶性”是指其中一组肿瘤细胞显示不受控生长(即，超出正常限制的分裂)、侵袭(即，相邻组织上的入侵和分解)和癌转移(即，通过淋巴或血液扩散到主体的其它位置)中的一个或多个的癌症。如本文中所使用，术语“转移”是指癌症从主体的一部分扩散到另一部分。由扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“癌转移”。转移性肿瘤含有相同原始(初级)肿瘤中的那些细胞的细胞。如本文中所使用，术语“良性的”或“非恶性的”是指可生长较大但不扩散到主体的其它部分的肿瘤。良性的肿瘤是自我限制的且通常不侵袭或转移。“癌细胞”是指癌症生长或组织的个别细胞。癌细胞包含实体癌症和液体癌症两种。“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常指由细胞的异常生长形成的肿胀或病变，其可为良性的、恶化前的或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但液体癌症(例如，白血病)未必形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换地使用。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以肿瘤的数目、体积或重量形式测量。在一个实施例中，靶细胞表达抗原，例如实质上不是在其它正常(所要)细胞的表面上发现的靶抗原。在一个实施例中，靶细胞是骨骼细胞、骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、软骨母细胞、肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌母细胞、肌细胞、平滑肌细胞、膀胱细胞、骨髓细胞、中枢神经系统(CNS)细胞、周边神经系统(PNS)细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、色素细胞、上皮细胞、皮肤细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、乳房细胞、结肠细胞、食道细胞、肠胃细胞、胃细胞、结肠细胞、头部细胞、颈部细胞、牙龈细胞、舌片细胞、肾脏细胞、肝细胞、肺细胞、鼻咽细胞、卵巢细胞、卵泡细胞、宫颈细胞、阴道细胞、子宫细胞、胰脏细胞、胰脏实质细胞、胰管细胞、胰岛细胞、前列腺细胞、阴茎细胞、性腺细胞、睾丸细胞、造血细胞、淋巴细胞或骨髓细胞。在一个实施例中，靶细胞表达STn(表达糖蛋白)。在一个实施例中，靶细胞为造血细胞、食道细胞、肺细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、胰脏细胞、胆囊或胆管的细胞、胃细胞、结肠细胞、乳房细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、干细胞、内皮细胞、上皮细胞或表达糖表位(例如，ST6GALNAC1)的任何细胞。在某些实施例中，靶细胞为肠(例如，食道、胃、结肠)内衬、乳房组织、肺组织、结肠组织、胰脏组织、胆囊或胆管组织、卵巢组织、宫颈组织、膀胱组织、肾脏组织或上皮组织的部分。在一特定实施例中，靶细胞为表达STn(表达糖蛋白)的癌细胞或癌症干细胞。在一个实施例中，靶细胞为表达STn(表达糖蛋白)的实体癌症细胞。可通过特定实施例中所涵盖的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含(但不限于)以下实体癌症的那些：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌/CNS癌症、乳腺癌、支气管肿瘤、心肌肿瘤、宫颈癌、胆管上皮癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、乳腺管原位癌(DCIS)子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’ssarcoma)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、输卵管癌、纤维性组织细胞肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、肠胃类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、神经胶瘤、神经胶母细胞瘤、头颈癌、成血管细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌症、眼内黑素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌瘤、恶性间皮瘤、髓质癌、神经管胚细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、中线道癌瘤、口癌、黏液肉瘤、骨髓发育不良症候群、骨髓增生赘瘤、鼻腔和副鼻窦癌症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口腔癌症、口咽癌症、骨肉瘤、卵巢癌、胰脏癌、胰脏胰岛细胞瘤、乳头状癌、副神经节瘤、副甲状腺癌症、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌症、横纹肌肉瘤、唾液腺癌症、皮脂腺癌瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌瘤、滑膜瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌症、甲状腺癌、尿道癌症、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌以及威尔姆斯肿瘤(WilmsTumor)。在另一实施例中，细胞为表达STn(表达糖蛋白)的实体癌症细胞。可用组合物预防、治疗或改善的示范性表达STn的实体癌症细胞包含(但不限于)：食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰脏癌、胆管癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌以及乳腺癌。在一特定实施例中，靶细胞为表达STn(表达糖蛋白)的液体癌症细胞或血液癌症细胞。可用特定实施例中所涵盖的组合物预防、治疗或改善的液体癌症或血液癌症的说明性实例包含(但不限于)：白血病、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。可通过特定实施例中所涵盖的抗STNCAR靶向的细胞的说明性实例包含(但不限于)以下白血病的那些细胞：急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓白血病(AML)、骨髓母细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、毛状细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)以及真性红细胞增多症。可通过特定实施例中所涵盖的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含(但不限于)以下淋巴瘤的那些：霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)、节状淋巴细胞突出的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包含(但不限于)B细胞非霍奇金淋巴瘤：伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；及T细胞非霍奇金淋巴瘤：蕈样真菌病、多形性大细胞淋巴瘤、塞扎莱症候群(Sézarysyndrome)和前体T成淋巴细胞性淋巴瘤。可通过特定实施例中所涵盖的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含(但不限于)以下多个骨髓瘤的那些：明显多发性骨髓瘤、郁积性多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨骼的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。在一特定实施例中，靶细胞为表达STn(表达糖蛋白)癌细胞或癌症干细胞。在另一特定实施例中，靶细胞为癌细胞，例如患有癌症的患者的细胞。K.治疗方法本文中所涵盖的遗传修饰的免疫效应细胞提供过继性免疫疗法的改进方法，以用于预防、治疗和改善表达STn(表达糖蛋白(例如TAG-72))的癌症或用于预防、治疗或改善与表达STn的癌症相关联的至少一种症状。在各种实施例中，本文中所涵盖的遗传修饰的免疫效应细胞提供过继性免疫疗法的改进方法，以用于增加个体中的表达STn(表达糖蛋白)的癌细胞的细胞毒性或以用于减少个体中的表达STn的癌细胞的数目。在特定实施例中，通过遗传修饰具有本文中所涵盖的CAR的初级免疫效应细胞将初级免疫效应细胞的特异性重导引到表达STn(表达糖蛋白)的细胞(例如，癌细胞)。在各种实施例中，病毒载体用以用编码CAR的特定聚核苷酸遗传修饰免疫效应细胞，所述CAR包括结合在糖蛋白上表达的STn的抗STn抗原结合域；铰链域；跨膜(TM)域；连接CAR的TM域与胞内信号传导域的短寡肽或多肽连接子；和一个或多个胞内共刺激信号传导域；以及初级信号传导域。在一个实施例中，提供其中遗传修饰T细胞以表达靶向表达STn(表达糖蛋白)的癌细胞的CAR，且将CART细胞输注到对其有需要的接受者的一种类型的细胞疗法。输注的细胞能够杀死接受者中的导致疾病的B细胞。不同于抗体疗法，CART细胞能够在体内复制，导致长期存留，其可以导致癌症疗法持续。在一个实施例中，CART细胞可经历稳固的活体内T细胞扩增且可保持延长的时间量。在另一实施例中，CART细胞进化为可再活化以抑制任何额外肿瘤形成或生长的特异性记忆T细胞。在特定实施例中，包括免疫效应细胞(包括本文中所涵盖的CAR)的组合物用于治疗与表达STn(表达糖蛋白)的癌细胞或癌症干细胞相关联的病况。可使用免疫效应细胞(包括本文中所涵盖的CAR)治疗、预防或改善的病况的说明性实例包含(但不限于)；血液癌症、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰脏癌、胆管癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌以及乳腺癌。在特定实施例中，包括本文中所涵盖的CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗实体癌症。在某些实施例中，实体癌症选自由以下组成的群组：食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰脏癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、肾癌以及乳腺癌。在一特定实施例中，包括本文中所涵盖的CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗液体癌症或血液癌症。在某些实施例中，液体癌症或血液癌症选自由以下组成的群组：白血病、淋巴瘤以及多个骨髓瘤。在某些实施例中，液体癌症或血液癌症选自由以下组成的群组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、骨髓母细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、毛状细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、节状淋巴细胞突出的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、多形性大细胞淋巴瘤、塞扎莱症候群、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、郁积性多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨骼的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。在某些实施例中，液体癌症或血液癌症选自由以下组成的群组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛状细胞白血病(HCL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性骨髓白血病(AML)或慢性骨髓白血病(CML)。在某些实施例中，液体癌症或血液癌症是CLL。在特定实施例中，提供了方法，其包括向有需要的患者单独或与一种或多种治疗剂组合投予治疗有效量的本文中所涵盖的表达CAR的免疫效应细胞或包括其的组合物。在某些实施例中，细胞用于治疗在产生与表达STn(表达糖蛋白)的癌细胞相关联的病况的风险下的患者。因此，在特定实施例中，用于治疗或预防或改善癌症的至少一种症状的方法包括向对其有需要的个体投予治疗有效量的本文中所涵盖的CAR修饰的细胞。如本文中所使用，术语“个人”和“个体”通常可互换地使用且指展现可用本文中其它地方所涵盖的基因疗法载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的疾病、病症或病况的症状的任何动物。在优选实施例中，个体包含展现涉及可用本文中其它地方所涵盖的基因疗法载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的癌症的疾病、病症或病况的症状的任何动物。适合个体(例如，患者)包含实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、农畜和家畜或宠物(例如猫或狗)。包含非人类灵长类动物，并且优选地人类患者。典型的个体包含患有在糖蛋白上表达STn的癌症，已诊断患有在糖蛋白上表达STn的癌症或在糖蛋白上表达STn癌症的风险下或具有其的人类患者。如本文所用，术语“患者”是指已经被诊断患有可以用本文别处所公开的基因疗法载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的特定疾病、病症或病况的个体。如本文中所使用，“治疗(treatment/treating)”包含对疾病或病理学病况的症状或病变的任何有益或理想作用，并且甚至可包含所治疗疾病或病况的一种或多种可测量标记的最小降低。治疗可以任选地涉及疾病或病况的减少，或疾病或病况的进展的延迟，例如延迟肿瘤生长。“治疗”并非必须指示完全根除或治愈疾病或病况或其相关症状。如本文中所使用，“预防(prevent)”和类似词语(例如“prevented”、“preventing”等)指示用于预防、抑制或降低疾病或病况出现或复发的可能性的方法。还指的是延迟疾病或病况发作或复发或延迟疾病或病况的症状出现或复发。如本文中所使用，“预防”和类似词语还包含在疾病或病况发作或复发之前降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负荷。如本文中所使用，短语“改善…的至少一种症状”是指减少所治疗的个体的疾病或病况的一种或多种症状。在特定实施例中，所治疗的疾病或病况是癌症，其中所改善的一种或多种症状包含(但不限于)：虚弱、疲乏、呼吸急促、容易擦伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹胀或腹痛(归因于扩大的腹部器官)、骨痛或关节痛、骨折、体重突然下降、食欲不振、盗汗、持续轻度发烧以及排尿减少(归因于减弱的肾脏功能)。“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”通常是指本文中所涵盖的组合物(例如，编码CAR的遗传修饰的T细胞或载体)与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比能够产生、引发或引起更大生理应答(即，下游作用)。可测量的生理应答可以尤其包含T细胞扩增、活化、存留的增加和/或癌细胞杀伤能力的增加，从所属领域中的理解和本文中的描述显而易见。“增加的”或“增强的”量通常是“在统计学上显著的”量，且可包含通过媒剂或对照组合物产生的应答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包含在1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)增加。“减小”或“降低”或“减轻”或“减少”或“减弱”通常是指本文中所涵盖的组合物与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比能够产生、引发或引起更小生理应答(即，下游作用)。“减小的”或“减少的”量通常是“在统计学上显著的”量，且可包含通过媒剂、对照组合物产生的应答(参考应答)或特定细胞谱系中的应答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包含在1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)减小。“维持(maintain)”或“保持”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无实质性变化”或“无实质性减小”通常是指本文中所涵盖的组合物与由媒剂、对照分子/组合物引起的应答或特定细胞谱系中的应答相比能够在细胞中产生、引发或引起更小生理应答(即，下游作用)。相当的应答是与参考应答并无显著不同或可测量不同的应答。在一个实施例中，治疗有需要的个体的癌症的方法包括投予有效量(例如，治疗有效量)的本文中所涵盖的包括遗传修饰的免疫效应细胞的组合物。投予的量和频率由例如患者的病况以及患者疾病的类型和严重程度的因素决定，但适当剂量可以通过临床试验确定。在一个实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞)在向个体投予的组合物中的量是至少0.1×105个细胞、至少0.5×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少0.5×107个细胞、至少1×107个细胞、至少0.5×108个细胞、至少1×108个细胞、至少0.5×109个细胞、至少1×109个细胞、至少2×109个细胞、至少3×109个细胞、至少4×109个细胞、至少5×109个细胞或至少1×1010个细胞。在特定实施例中，向个体投予约1×107个T细胞到约1×109个T细胞、约2×107个T细胞到约0.9×109个T细胞、约3×107个T细胞到约0.8×109个T细胞、约4×107个T细胞到约0.7×109个T细胞、约5×107个T细胞到约0.6×109个T细胞或约5×107个T细胞到约0.5×109个T细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞)在向个体投予的组合物中的量是每千克体重至少0.1×104个细胞、每千克体重至少0.5×104个细胞、每千克体重至少1×104个细胞、每千克体重至少5×104个细胞、每千克体重至少1×105个细胞、每千克体重至少0.5×106个细胞、每千克体重至少1×106个细胞、每千克体重至少0.5×107个细胞、每千克体重至少1×107个细胞、每千克体重至少0.5×108个细胞、每千克体重至少1×108个细胞、每千克体重至少2×108个细胞、每千克体重至少3×108个细胞、每千克体重至少4×108个细胞、每千克体重至少5×108个细胞或每千克体重至少1×109个细胞。在特定实施例中，向个体投予每千克体重约1×106个T细胞到每千克体重约1×108个T细胞、每千克体重约2×106个T细胞到每千克体重约0.9×108个T细胞、每千克体重约3×106个T细胞到每千克体重约0.8×108个T细胞、每千克体重约4×106个T细胞到每千克体重约0.7×108个T细胞、每千克体重约5×106个T细胞到每千克体重约0.6×108个T细胞或每千克体重约5×106个T细胞到每千克体重约0.5×108个T细胞。所属领域一般技术人员将认识到，可能需要多次投予本文中所涵盖的组合物以实现所要疗法。举例来说，组合物可以跨越1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更久的时间间隔投予1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。在某些实施例中，可能需要向个体投予活化的免疫效应细胞，且接着随后再抽取血液(或执行单采血液成分术)，活化来自其的免疫效应细胞且向患者再输注这些活化和扩增的免疫效应细胞。这个过程可以每隔数周执行多次。在某些实施例中，免疫效应细胞可以由10cc到400cc的抽血活化。在某些实施例中，免疫效应细胞由20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多的抽血活化。不受理论束缚，使用此多次抽血/多次再输注方案可以用以选出某些免疫效应细胞群。本文中所涵盖的组合物的投予可以按任何适宜方式执行，包含通过气溶胶吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。在一优选实施例中，肠胃外投予组合物。如本文中所使用，短语“肠胃外投予(parenteraladministration/administeredparenterally)”是指除经肠和局部投予以外的投予模式，通常通过注射并且包含(但不限于)血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内和胸骨内注射和输注。在一个实施例中，本文中所涵盖的组合物通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点中来向个体投予。在一个实施例中，向有需要的个体投予有效量的组合物以增加个体中对癌症的细胞免疫应答。免疫应答可以包含由能够杀伤受感染细胞的细胞毒性T细胞、调节T细胞和辅助T细胞应答介导的细胞免疫应答。主要由能够活化B细胞、因此导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫应答还可以是诱导性的。多种技术可用于分析通过组合物诱导的免疫应答的类型，其充分描述于所属领域中；例如《免疫学最新方案》,JohnE.Coligan、AdaM.Kruisbeek、DavidH.Margulies、EthanM.Shevach、WarrenStrober编(2001)约翰·威利父子公司,纽约州纽约(NY,N.Y)。在T细胞介导的杀伤的情况下，CAR-配体结合引发CAR信号传导到T细胞，导致通过各种机制诱导T细胞产生或释放能够诱导靶细胞细胞凋亡的蛋白质的多种T细胞信号传导途径活化。这些T细胞介导的机制包含(但不限于)胞内细胞毒性颗粒从T细胞向靶细胞中的转移；可以直接(或经由其它杀伤效应细胞的募集间接)诱导靶细胞杀伤的促炎性细胞因子的T细胞分泌；和T细胞表面上在结合到靶细胞上的其同源死亡受体(例如，Fas)之后诱导靶细胞细胞凋亡的死亡受体配体(例如，FasL)的上调。在一个实施例中，提供治疗诊断患有在糖蛋白上表达STn的癌症的个体的方法，所述方法包括：从诊断患有表达STn的癌症的个体去除免疫效应细胞，遗传修饰具有包括编码本文中所涵盖的CAR的核酸的载体的所述免疫效应细胞，由此产生修饰的免疫效应细胞群体，且向同一个体投予修饰的免疫效应细胞群体。在一优选实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。在某些实施例中，提供用于刺激免疫效应细胞介导的免疫调节剂对个体中的靶细胞群体发应答的方法，所述方法包括以下步骤：向所述个体投予表达编码CAR分子的核酸构建体的免疫效应细胞群。用于投予特定实施例中所涵盖的细胞组合物的方法包含有效导致以下现象的任何方法：将直接表达CAR的离体遗传修饰的免疫效应细胞再引入个体中；或免疫效应细胞的在引入个体中时分化成表达CAR的成熟免疫效应细胞的遗传修饰的祖细胞的再引入。一种方法包括用根据本文中所涵盖的核酸构建体离体转导周边血液T细胞，且使转导的细胞返回到个体中。本说明书中所引用的所有公开、专利申请和授权专利都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同每个个别公开、专利申请或授权专利经特定并且独立地指示以引用的方式并入一般。尽管已经出于清楚理解的目的借助于说明和实例相当详细地描述了前述实施例，但鉴于本文中所涵盖的传授内容，所属领域一般技术人员将容易地显而易见，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。所属领域的技术人员将容易识别出多种可以被改变或修改以产生基本类似结果的非关键参数。实例实例1抗STnCAR的构建含有人类化抗STnscFv抗体的CAR被设计成含有MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到抗STnscFv、来自CD8α和CD137共刺激域的铰链域和跨膜域、随后是CD3ζ链的胞内信号传导域。图1.抗STnCAR包括用于在免疫效应细胞上表面表达的CD8α信号肽(SP)序列。表3展示了示范性抗STnCAR慢病毒载体的各种核苷酸片段的身份、Genbank参考、来源名称和引用文件。表3.实例2抗STnCART细胞在人类结肠直肠癌的活体外模型中的细胞毒性包括具有根据SEQIDNO:15的轻链可变区和根据SEQIDNO:16的重链可变区的抗STnCAR的CART细胞展示结肠直肠癌的活体外模型中的LS174T细胞的选择性杀死。LS174T细胞为表达较高水平的STn(表达TAG-72糖蛋白)的人类结肠直肠癌细胞系。通过来免疫组织化学确认STn(表达TAG-72糖蛋白)在LS174T细胞上的表达。5×105个LS174T细胞悬浮于100μL的含有1％牛血清白蛋白(BSA)和5μgSTn特异性抗体(3E8)的PBS中。在4℃下培育反应物30分钟，随后用含有1％BSA的PBS洗涤细胞两次。随后，添加1μL小鼠抗人类IgG-PE(南方生物技术(SouthernBiotech))且在4℃下培育所述混合物30分钟。随后，用含有1％BSA的PBS洗涤细胞两次。用流式细胞测量术确认STn(表达TAG-72糖蛋白)表达。98％LS174T细胞表达STn(表达TAG-72糖蛋白)。来自人类胃癌细胞系的95％细胞也展示STn表达。相反，仅约2％TAG-72阴性人类脐部静脉内皮细胞(HUVEC)细胞表达STn。使用CellToxTMGreen分析LS174T细胞上的抗STnCART细胞的细胞毒性活性。将1×104个LS174T细胞悬浮于50μL培养基中且添加2.0μLCellToxTMGreen。将混合物等分于黑色96孔板中且将等分试样与含5×104、1×105、2×105或3×105个抗STnCART细胞的50μl培养基组合，所述培养基含有人类血清和IL-2(E:T比率＝5、10、20、30)。在37℃下培养24小时之后，如下计算细胞毒性。CellToxTMGreen荧光(RFU)＝{T细胞和E细胞的反应}-(E细胞的反应)}-(T细胞的反应，背景)结果展示，与STn缺失的HUVEC相比或与不表达抗STnCAR的对照T细胞相比，抗STn-CART细胞有效地杀死表达STn-TAG-72的LS174T癌细胞。实例3转导的T细胞中的抗STnCAR表达和载体拷贝数使用可直接扩展成大的临床制造方法的系统建立抗BCMACART细胞培养物。简单来说，在静态烧瓶中在含有IL-2(CellGenix)、对CD3和CD28(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec))和ZSTK474(赛莱克化学(Selleckchem))具有特异性的抗体的培养基中培养周边血液单核细胞(PBMC)。在培养开始后一天添加编码具有根据SEQIDNO:15的轻链可变区和根据SEQIDNO:16的重链可变区的抗STnCAR的2×108个慢病毒转导单元。通过添加含有IL-2和ZSTK474的新鲜培养基将抗STNCART细胞维持在对数期中，总共培养十天。在培养结束时，在从三个供体获得的转导的T细胞中测量抗STNCAR的细胞表面表达和载体拷贝数(VCN)。使用检测载体或基因组对照RNAseP的引物在培养结束时通过定量PCR来评定VCN。与未转导的T细胞相比，来自三个供体的转导的T细胞中的抗STnCARVCN的数据展示于图3A中。与未转导的对照细胞中的未检测VCN相比，转导的T细胞具有约4.5的VCN。在培养结束时通过流式细胞术来评定抗STnCAR在细胞的表面上的表达。确切地说，使用生物素化蛋白L随后抗生蛋白链菌素-PE的两步骤检测方法来识别抗STnCART细胞。来自三个正常供体的T细胞展示抗STnCAR的高表达。这个实验的结果展示于图3B中。实例4抗STnCART细胞的抗原特异性细胞毒性如实例3中所描述产生抗STnCART细胞。在培养结束时，针对两个独立分析中的抗原特异性应答分析抗STnCART细胞。使用基于珠粒的细胞因子分析(Luminex)检验抗STnCART细胞对在TAG72上表达STn的细胞系应答和产生IFNγ的能力将等效数目的肿瘤细胞和抗STnCART细胞(每个5×104个)共培养24小时。收集上清液且通过Luminex来定量所产生的IFNγ的量。当在不具有肿瘤细胞的情况下培养时，抗STnCART细胞几乎不产生IFNγ。当与二维培养物(A549和HDLM-2)中的不在其细胞表面上表达STn的肿瘤细胞共培养时，无IFNγ通过抗STnCART细胞产生。当抗STnCART细胞与在TAG72(Jurkat和LS174T)上表达STn的肿瘤细胞共培养时，存在所产生的IFNγ的量的显著增加。图4A。分析与抗STnCART细胞共培养的LS174T细胞的细胞溶解。用能够监测活细胞的电阻抗的iCELLigence仪器实时监测细胞溶解。抗STnCART细胞而非未转导的对照T细胞在共培养的LS174T细胞中诱导细胞溶解。图4B。以不同效应子:靶细胞比率将抗STnCART细胞(效应细胞)与LS174T细胞(靶细胞)共培养。抗STnCART细胞以剂量依赖性方式增加共培养LS174T细胞中的毒性。图4C。实例5抗STnCART细胞延迟侵蚀性活体内肿瘤模型中的肿瘤生长如实例3中所描述产生抗STnCART细胞。在侵蚀性活体内肿瘤模型中检验CART细胞的抗肿瘤活性。动物接受皮下投予结肠腺癌细胞(LS174T)且在第二天输注有当量CART细胞剂量(2×107个T细胞)。与媒剂治疗的动物相比，对照CART细胞(其包括不具有转导信号的能力的截断的CAR)对肿瘤生长不具有影响。抗STNCART细胞经延迟这种侵蚀性结肠癌模型中的肿瘤生长。图5。总体来说，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，但应理解为包含所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。序列表<110>百疗医株式会社(ViroMedCo.,Ltd.)蓝鸟生物公司(bluebirdbio,Inc.)理查德·摩根(Morgan,Richard)凯文·弗里德曼(Friedman,Kevin)柳承信(Yu,SeungShin)郑在均(Jeong,Jae-Gyun)蔡珒我(Chae,Jin-A)<120>抗唾液酸TN嵌合抗原受体<130>BLBD-066/02WO<150>US62/317950<151>2016-04-04<150>KR10-2015-0122727<151>2015-08-31<160>57<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>1LysSerSerGlnSerValLeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeu151015Ala<210>2<211>7<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>2TrpAlaSerThrArgGluSer15<210>3<211>9<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>3GlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThr15<210>4<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>4GlyTyrThrPheThrAspHisAlaIleHis1510<210>5<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>5TyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPheGln151015Gly<210>6<211>6<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>6SerLeuAsnMetAlaTyr15<210>7<211>113<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合轻链序列<400>7AspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerValLeuTyrSer202530SerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGln354045ProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGln859095TyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIle100105110Lys<210>8<211>115<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合重链序列<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspHis202530AlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgSerLeuAsnMetAlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr100105110ValSerSer115<210>9<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>9LysSerSerGlnSerValLeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeu151015Ala<210>10<211>7<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>10TrpAlaSerThrArgGluSer15<210>11<211>9<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>11GlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThr15<210>12<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>12GlyTyrThrPheThrAspHisAlaIleHis1510<210>13<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>13TyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPheGln151015Gly<210>14<211>6<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>14SerTrpIleMetGlnTyr15<210>15<211>113<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合轻链序列<400>15AspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerValLeuTyrSer202530SerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGln354045ProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGln859095TyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIle100105110Lys<210>16<211>115<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合重链序列<400>16GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspHis202530AlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgSerTrpIleMetGlnTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr100105110ValSerSer115<210>17<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>17LysSerSerGlnSerValLeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeu151015Ala<210>18<211>7<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>18TrpAlaSerThrArgGluSer15<210>19<211>9<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>19GlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThr15<210>20<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>20GlyTyrThrPheThrAspHisAlaIleHis1510<210>21<211>17<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>21TyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPheGln151015Gly<210>22<211>6<212>PRT<213>小家鼠(Musmusculus)<400>22SerTrpIleMetGlnTyr15<210>23<211>113<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合轻链序列<400>23AspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerValLeuTyrSer202530SerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGln354045ProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGln859095TyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIle100105110Lys<210>24<211>115<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>嵌合重链序列<400>24GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspHis202530AlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSerGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgSerTrpIleMetGlnTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr100105110ValSerSer115<210>25<211>488<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>合成的抗STNCAR<400>25MetGluTrpSerTrpValPheLeuPhePheLeuSerValThrThrGly151015ValHisSerAspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaVal202530SerLeuGlyGluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerVal354045LeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLys505560ProGlyGlnProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGlu65707580SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe859095ThrLeuThrIleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyr100105110CysGlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLys115120125ValGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly130135140GlyGlySerGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys145150155160ProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe165170175ThrAspHisAlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeu180185190GluTrpMetGlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSer195200205GlnLysPheGlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSer210215220ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal225230235240TyrTyrCysAlaArgSerLeuAsnMetAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr245250255LeuValThrValSerSerAlaAlaAlaThrThrThrProAlaProArg260265270ProProThrProAlaProThrIleAlaSerGlnProLeuSerLeuArg275280285ProGluAlaCysArgProAlaAlaGlyGlyAlaValHisThrArgGly290295300LeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAlaProLeuAlaGlyThr305310315320CysGlyValLeuLeuLeuSerLeuValIleThrLeuTyrCysLysArg325330335GlyArgLysLysLeuLeuTyrIlePheLysGlnProPheMetArgPro340345350ValGlnThrThrGlnGluGluAspGlyCysSerCysArgPheProGlu355360365GluGluGluGlyGlyCysGluLeuArgValLysPheSerArgSerAla370375380AspAlaProAlaTyrGlnGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeu385390395400AsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGly405410415ArgAspProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGlu420425430GlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSer435440445GluIleGlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGly450455460LeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeu465470475480HisMetGlnAlaLeuProProArg485<210>26<211>488<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>合成的抗STNCAR<400>26MetGluTrpSerTrpValPheLeuPhePheLeuSerValThrThrGly151015ValHisSerAspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaVal202530SerLeuGlyGluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerVal354045LeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLys505560ProGlyGlnProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGlu65707580SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe859095ThrLeuThrIleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyr100105110CysGlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLys115120125ValGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly130135140GlyGlySerGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys145150155160ProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe165170175ThrAspHisAlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeu180185190GluTrpMetGlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSer195200205GlnLysPheGlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSer210215220ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal225230235240TyrTyrCysAlaArgSerTrpIleMetGlnTyrTrpGlyGlnGlyThr245250255LeuValThrValSerSerAlaAlaAlaThrThrThrProAlaProArg260265270ProProThrProAlaProThrIleAlaSerGlnProLeuSerLeuArg275280285ProGluAlaCysArgProAlaAlaGlyGlyAlaValHisThrArgGly290295300LeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAlaProLeuAlaGlyThr305310315320CysGlyValLeuLeuLeuSerLeuValIleThrLeuTyrCysLysArg325330335GlyArgLysLysLeuLeuTyrIlePheLysGlnProPheMetArgPro340345350ValGlnThrThrGlnGluGluAspGlyCysSerCysArgPheProGlu355360365GluGluGluGlyGlyCysGluLeuArgValLysPheSerArgSerAla370375380AspAlaProAlaTyrGlnGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeu385390395400AsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGly405410415ArgAspProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGlu420425430GlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSer435440445GluIleGlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGly450455460LeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeu465470475480HisMetGlnAlaLeuProProArg485<210>27<211>488<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>合成的抗STNCAR<400>27MetGluTrpSerTrpValPheLeuPhePheLeuSerValThrThrGly151015ValHisSerAspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaVal202530SerLeuGlyGluArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnSerVal354045LeuTyrSerSerAsnAsnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLys505560ProGlyGlnProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGlu65707580SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe859095ThrLeuThrIleSerSerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyr100105110CysGlnGlnTyrTyrSerTyrProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLys115120125ValGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly130135140GlyGlySerGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys145150155160ProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe165170175ThrAspHisAlaIleHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeu180185190GluTrpMetGlyTyrPheSerProGlyAsnAspAspPheLysTyrSer195200205GlnLysPheGlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerAlaSer210215220ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal225230235240TyrTyrCysAlaArgSerTrpIleMetGlnTyrTrpGlyGlnGlyThr245250255LeuValThrValSerSerAlaAlaAlaThrThrThrProAlaProArg260265270ProProThrProAlaProThrIleAlaSerGlnProLeuSerLeuArg275280285ProGluAlaCysArgProAlaAlaGlyGlyAlaValHisThrArgGly290295300LeuAspPheAlaCysAspIleTyrIleTrpAlaProLeuAlaGlyThr305310315320CysGlyValLeuLeuLeuSerLeuValIleThrLeuTyrCysLysArg325330335GlyArgLysLysLeuLeuTyrIlePheLysGlnProPheMetArgPro340345350ValGlnThrThrGlnGluGluAspGlyCysSerCysArgPheProGlu355360365GluGluGluGlyGlyCysGluLeuArgValLysPheSerArgSerAla370375380AspAlaProAlaTyrGlnGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeu385390395400AsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGly405410415ArgAspProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGlu420425430GlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSer435440445GluIleGlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGly450455460LeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeu465470475480HisMetGlnAlaLeuProProArg485<210>28<211>5<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>28AspGlyGlyGlySer15<210>29<211>5<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>29AspGlyGlyGlySer15<210>30<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>30GlyGlyArgArg1<210>31<211>5<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>31GlyGlyGlyGlySer15<210>32<211>14<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>32GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysValAsp1510<210>33<211>18<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>33LysGluSerGlySerValSerSerGluGlnLeuAlaGlnPheArgSer151015LeuAsp<210>34<211>8<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>34GlyGlyArgArgGlyGlyGlySer15<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>35LeuArgGlnArgAspGlyGluArgPro15<210>36<211>12<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>36LeuArgGlnLysAspGlyGlyGlySerGluArgPro1510<210>37<211>16<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>37LeuArgGlnLysAspGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGluArgPro151015<210>38<211>18<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>示范性连接子序列<400>38GlySerThrSerGlySerGlyLysProGlySerGlyGluGlySerThr151015LysGly<210>39<211>7<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>通过TEV蛋白酶裂解序列<220><221>SITE<222>(2)..(3)<223>Xaa是任何氨基酸<220><221>SITE<222>(5)..(5)<223>Xaa是任何氨基酸<220><221>SITE<222>(7)..(7)<223>Xaa=Gly或Ser<220><221>UNSURE<222>(2)..(2)<223>The'Xaa'atlocation2standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<220><221>UNSURE<222>(3)..(3)<223>The'Xaa'atlocation3standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<220><221>UNSURE<222>(5)..(5)<223>The'Xaa'atlocation5standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<220><221>UNSURE<222>(7)..(7)<223>The'Xaa'atlocation7standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<400>39GluXaaXaaTyrXaaGlnXaa15<210>40<211>7<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>通过TEV蛋白酶裂解序列<400>40GluAsnLeuTyrPheGlnGly15<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>通过TEV蛋白酶裂解序列<400>41GluAsnLeuTyrPheGlnSer15<210>42<211>19<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>42LeuLeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsn151015ProGlyPro<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>43ThrLeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsn151015ProGlyPro<210>44<211>14<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>44LeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGlyPro1510<210>45<211>17<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>45AsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGly151015Pro<210>46<211>20<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>46GlnLeuLeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSer151015AsnProGlyPro20<210>47<211>24<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>47AlaProValLysGlnThrLeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGly151015AspValGluSerAsnProGlyPro20<210>48<211>40<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>48ValThrGluLeuLeuTyrArgMetLysArgAlaGluThrTyrCysPro151015ArgProLeuLeuAlaIleHisProThrGluAlaArgHisLysGlnLys202530IleValAlaProValLysGlnThr3540<210>49<211>18<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>49LeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnPro151015GlyPro<210>50<211>40<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>50LeuLeuAlaIleHisProThrGluAlaArgHisLysGlnLysIleVal151015AlaProValLysGlnThrLeuAsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGly202530AspValGluSerAsnProGlyPro3540<210>51<211>33<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>自我裂解包括2A位点的多肽<400>51GluAlaArgHisLysGlnLysIleValAlaProValLysGlnThrLeu151015AsnPheAspLeuLeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGly202530Pro<210>52<211>937<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>52MetHisArgProArgArgArgGlyThrArgProProLeuLeuAlaLeu151015LeuAlaAlaLeuLeuLeuAlaAlaArgGlyAlaAlaAlaGlnGluThr202530GluLeuSerValSerAlaGluLeuValProThrSerSerTrpAsnIle354045SerSerGluLeuAsnLysAspSerTyrLeuThrLeuAspGluProMet505560AsnAsnIleThrThrSerLeuGlyGlnThrAlaGluLeuHisCysLys65707580ValSerGlyAsnProProProThrIleArgTrpPheLysAsnAspAla859095ProValValGlnGluProArgArgLeuSerPheArgSerThrIleTyr100105110GlySerArgLeuArgIleArgAsnLeuAspThrThrAspThrGlyTyr115120125PheGlnCysValAlaThrAsnGlyLysGluValValSerSerThrGly130135140ValLeuPheValLysPheGlyProProProThrAlaSerProGlyTyr145150155160SerAspGluTyrGluGluAspGlyPheCysGlnProTyrArgGlyIle165170175AlaCysAlaArgPheIleGlyAsnArgThrValTyrMetGluSerLeu180185190HisMetGlnGlyGluIleGluAsnGlnIleThrAlaAlaPheThrMet195200205IleGlyThrSerSerHisLeuSerAspLysCysSerGlnPheAlaIle210215220ProSerLeuCysHisTyrAlaPheProTyrCysAspGluThrSerSer225230235240ValProLysProArgAspLeuCysArgAspGluCysGluIleLeuGlu245250255AsnValLeuCysGlnThrGluTyrIlePheAlaArgSerAsnProMet260265270IleLeuMetArgLeuLysLeuProAsnCysGluAspLeuProGlnPro275280285GluSerProGluAlaAlaAsnCysIleArgIleGlyIleProMetAla290295300AspProIleAsnLysAsnHisLysCysTyrAsnSerThrGlyValAsp305310315320TyrArgGlyThrValSerValThrLysSerGlyArgGlnCysGlnPro325330335TrpAsnSerGlnTyrProHisThrHisThrPheThrAlaLeuArgPhe340345350ProGluLeuAsnGlyGlyHisSerTyrCysArgAsnProGlyAsnGln355360365LysGluAlaProTrpCysPheThrLeuAspGluAsnPheLysSerAsp370375380LeuCysAspIleProAlaCysAspSerLysAspSerLysGluLysAsn385390395400LysMetGluIleLeuTyrIleLeuValProSerValAlaIleProLeu405410415AlaIleAlaLeuLeuPhePhePheIleCysValCysArgAsnAsnGln420425430LysSerSerSerAlaProValGlnArgGlnProLysHisValArgGly435440445GlnAsnValGluMetSerMetLeuAsnAlaTyrLysProLysSerLys450455460AlaLysGluLeuProLeuSerAlaValArgPheMetGluGluLeuGly465470475480GluCysAlaPheGlyLysIleTyrLysGlyHisLeuTyrLeuProGly485490495MetAspHisAlaGlnLeuValAlaIleLysThrLeuLysAspTyrAsn500505510AsnProGlnGlnTrpThrGluPheGlnGlnGluAlaSerLeuMetAla515520525GluLeuHisHisProAsnIleValCysLeuLeuGlyAlaValThrGln530535540GluGlnProValCysMetLeuPheGluTyrIleAsnGlnGlyAspLeu545550555560HisGluPheLeuIleMetArgSerProHisSerAspValGlyCysSer565570575SerAspGluAspGlyThrValLysSerSerLeuAspHisGlyAspPhe580585590LeuHisIleAlaIleGlnIleAlaAlaGlyMetGluTyrLeuSerSer595600605HisPhePheValHisLysAspLeuAlaAlaArgAsnIleLeuIleGly610615620GluGlnLeuHisValLysIleSerAspLeuGlyLeuSerArgGluIle625630635640TyrSerAlaAspTyrTyrArgValGlnSerLysSerLeuLeuProIle645650655ArgTrpMetProProGluAlaIleMetTyrGlyLysPheSerSerAsp660665670SerAspIleTrpSerPheGlyValValLeuTrpGluIlePheSerPhe675680685GlyLeuGlnProTyrTyrGlyPheSerAsnGlnGluValIleGluMet690695700ValArgLysArgGlnLeuLeuProCysSerGluAspCysProProArg705710715720MetTyrSerLeuMetThrGluCysTrpAsnGluIleProSerArgArg725730735ProArgPheLysAspIleHisValArgLeuArgSerTrpGluGlyLeu740745750SerSerHisThrSerSerThrThrProSerGlyGlyAsnAlaThrThr755760765GlnThrThrSerLeuSerAlaSerProValSerAsnLeuSerAsnPro770775780ArgTyrProAsnTyrMetPheProSerGlnGlyIleThrProGlnGly785790795800GlnIleAlaGlyPheIleGlyProProIleProGlnAsnGlnArgPhe805810815IleProIleAsnGlyTyrProIleProProGlyTyrAlaAlaPhePro820825830AlaAlaHisTyrGlnProThrGlyProProArgValIleGlnHisCys835840845ProProProLysSerArgSerProSerSerAlaSerGlySerThrSer850855860ThrGlyHisValThrSerLeuProSerSerGlySerAsnGlnGluAla865870875880AsnIleProLeuLeuProHisMetSerIleProAsnHisProGlyGly885890895MetGlyIleThrValPheGlyAsnLysSerGlnLysProTyrLysIle900905910AspSerLysGlnAlaSerLeuLeuGlyAspAlaAsnIleHisGlyHis915920925ThrGluSerMetIleSerAlaGluLeu930935<210>53<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>用于确定轻链CDR-L3基序的示范性规则<220><221>SITE<222>(3)..(3)<223>Xaa是任何氨基酸<220><221>UNSURE<222>(3)..(3)<223>The'Xaa'atlocation3standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<400>53PheGlyXaaGly1<210>54<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>用于确定重链CDR-H1基序的示范性规则<220><221>SITE<222>(2)..(4)<223>Xaa是任何氨基酸<220><221>UNSURE<222>(2)..(2)<223>The'Xaa'atlocation2standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<220><221>UNSURE<222>(3)..(3)<223>The'Xaa'atlocation3standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<220><221>UNSURE<222>(4)..(4)<223>The'Xaa'atlocation4standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<400>54CysXaaXaaXaa1<210>55<211>5<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>用于确定重链CDR-H2基序的示范性规则<400>55LeuGluTrpIleGly15<210>56<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>PEPTIDE<222>()..()<223>用于确定重链CDR-H3基序的示范性规则<220><221>SITE<222>(3)..(3)<223>Xaa是任何氨基酸<220><221>UNSURE<222>(3)..(3)<223>The'Xaa'atlocation3standsforGln,Arg,Pro,orLeu.<400>56TrpGlyXaaGly1<210>57<211>10<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>gene<222>()..()<223>共有Kozak序列<400>57gccrccatgg10当前第1页1 2 3