用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液及其制备方法与流程

本发明涉及干细胞分泌物，尤其是一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液及其制备方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名。msc来源于中胚层间充质，主要存在于生物体全身结缔组织和器官间质中。间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、脂肪、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高，纯净，数量多。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化、组织修复、免疫调节和归巢的能力。间充质干细胞具有亚全能分化潜能，在特定的体内、外环境下能够诱导分化成为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞。

间充质干细胞在体外培养过程中可分泌内皮细胞生长因子(vegf)、干细胞生长因子(scf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮细胞生长因子(egf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬细胞击落刺激因子(m-csf)、白细胞介素(il)等多种细胞因子，发挥重要的旁分泌作用，并可产生一系列细胞外基质分子如粘连蛋白、层粘连蛋白、ⅰ-ⅳ型胶原、蛋白聚糖等。这些旁分泌因子参与机体组织损伤修复，抑制受损组织细胞凋亡，促进受损组织细胞增殖，抗炎症反应以及抑制损伤部位引发炎症的相关细胞增殖和迁移等。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液及其制备方法，利用高浓度的人间充质干细胞分泌的多种细胞因子，为间充质干细胞应用提供高效、快捷、方便的途径。利用间充质干细胞分泌的多种细胞因子为治疗免疫力低下，骨关节炎，骨营养不良性关节病，肌腱损伤，脊髓损伤，肾脏、肝脏等器官的衰竭与损伤，提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。对于小型宠物延缓衰老，提高生活质量与身体机能都有显著的功效。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(8)按体积份数5％-10％向步骤(7)中得到的上清中加入的量百分比浓度为20％的人血白蛋白，混匀后灌注至无菌转移袋，得到含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液。

所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、月经血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。

上述的制备方法得到的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液。

本发明的有益效果是：将人间充质干细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的各种活性成分的浓度都得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物浓度进一步增加，高浓度的人间充质干细胞分泌物可以抑制骨、心肌、视网膜等受损组织细胞凋亡，促进受损组织细胞增殖，降低炎症反应，抑制组织细胞的纤维化，提高骨愈合后机械强度和新生骨矿物质含量，促进肺损伤修复并增加肺血管数量。

附图说明

图1为本发明实施例1的方法培养的人间充质干细胞图；

图2为实施例1不同饥饿次数人间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图；

图3为实施例1各组小鼠建模后第3、7、14天scr含量变化；

图4为实施例1各组小鼠建模后第3、7、14天bun含量变化；

图5为实施例2的方法培养的人间充质干细胞图；

图6为实施例2不同饥饿次数人间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图；

图7为实施例2各组小鼠建模后第3、7、14天后alt含量变化；

图8为实施例2各组小鼠建模后第3、7、14天后ast含量变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(8)按体积份数5％-10％向步骤(7)中得到的上清中加入的量百分比浓度为20％的人血白蛋白，混匀后灌注至无菌转移袋，得到含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液，放于4℃冰箱中保存待用。

上述的制备方法得到的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞分泌物的修复注射液。

制备的高浓度含人间充质干细胞分泌物的修复注射液可用于修复家庭小型宠物心脏、肾脏、肝脏等器官的衰老与损伤。

人间充质干细胞在饥饿培养过程中会分泌大量的趋化因子、生长因子和激素等，这些因子可以抑制受损组织细胞凋亡，促进受损组织细胞增殖，降低炎症反应，抑制组织细胞的纤维化，从而提升家庭小型宠物的免疫力及生活质量，提高身体机能，延缓衰老。在家庭小型宠物的常见症状中，如骨关节炎，骨营养不良性关节病，肌腱损伤，脊髓损伤，肾脏、肝脏等器官的衰竭与损伤，都有修复与愈合的作用。

实施例1

(1)人脐带间充质干细胞培养：从细胞库中选取p4的人脐带间充质干细胞复苏，细胞总数4.2*10⁷。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的60％(每瓶接种细胞数：9*10⁶，接种细胞三瓶)、40％(每瓶接种细胞数：6*10⁶，接种细胞两瓶)、20％(接种细胞数：3*10⁶，接种细胞一瓶)，培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为t-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳浓度5％；

(2)培养30小时，此时第一批次细胞融合度达到75％时，见图1，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液(中国大冢制药有限公司生产的复方电解质葡萄糖mg3注射液)进行饥饿培养；

(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。

(8)检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)的备用上清细胞因子含量，见图2。

(9)向步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)的备用上清中分别加入体积分数5％的人血白蛋白(质量百分比浓度为20％)，混匀后灌注至无菌转移袋，放于4℃冰箱中保存待用,即分别得到饥饿一次、饥饿两次和饥饿三次的高浓度含人脐带间充质干细胞分泌物的修复注射液。

(10)用戊巴比妥钠溶液建立急性肾损伤(aki)小鼠模型，取90只小鼠随机分为6组，每组15只，分别为正常对照组、aki组、aki+复方电解质注射液组、aki+修复注射液-1组、aki+修复注射液-2组，aki+修复注射液-3组。

(11)正常对照组不作任何处理，正常饲养；aki组于夹闭双侧肾蒂后再开放的同时腹腔注射0.2ml生理盐水；aki+复方电解质注射液组于夹闭双侧肾蒂后再开放的同时腹腔注射0.2ml复方电解质注射液；aki+修复注射液-1组、aki+修复注射液-2组，aki+修复注射液-3组于夹闭双侧肾蒂后再开放的同时分别腹腔内注射0.2ml步骤(9)中饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次的含高浓度人脐带间充质干细胞分泌物的修复注射液。各组小鼠在通风、温度18-25℃、湿度60％-70％环境下饲养，自由进食水。各组于建模后0d、3d、7d、14d分别随机处死5只，取血后分离血清，检测各组血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)水平，见图3和图4。图2表明，人间充质干细胞饥饿三次培养，与饥饿一次、饥饿两次相比，各种细胞因子分泌量显著提高；图3和图4表明，急性肾损伤小鼠在分别注射步骤(9)中饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次的含高浓度人脐带间充质干细胞分泌物的修复注射液后，血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)水平呈明显下降趋势，急性肾损伤程度明显改善，并且注射饥饿三次的含高浓度人脐带间充质干细胞分泌物的修复注射液的小鼠，血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)数值已接近正常水平，急性肾损伤改善程度最为显著。

实施例2

(1)人脂肪间充质干细胞培养：从细胞库中选取p5的人脂肪间充质干细胞复苏，细胞总数3.84*10⁷。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％(每瓶接种细胞数：8*10⁶，接种细胞三瓶)、35％(每瓶接种细胞数：5.6*10⁶，接种细胞两瓶)、20％(接种细胞数：3.2*10⁶，接种细胞一瓶)，培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红amem和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为t-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳浓度5％；

(2)培养35小时，此时第一批次细胞融合度达到70％时，见图5，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，每瓶用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到75％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；

(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。

(8)检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)的细胞因子含量，见图6。

(9)向步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)的备用上清中分别加入体积分数5％的人血白蛋白(质量百分比浓度为20％)，混匀后灌注至无菌转移袋，放于4℃冰箱中保存待用,即分别得到饥饿一次、饥饿两次和饥饿三次的含高浓度人脂肪间充质干细胞分泌物的修复注射液。

(10)用ccl4橄榄油溶液建立急性肝衰竭(alf)小鼠模型，取90只小鼠随机分为6组，每组15只，分别为正常对照组、alf组、alf+复方电解质注射液组、alf+修复注射液-1组、alf+修复注射液-2组，alf+修复注射液-3组。

(11)正常对照组不作任何处理，正常饲养；alf组腹腔内注射0.2ml生理盐水；alf+复方电解质注射液组注射0.2ml复方电解质注射液；alf+修复注射液-1组、alf+修复注射液-2组，alf+修复注射液-3组分别注射0.2ml步骤(9)中饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次的高浓度含人脂肪间充质干细胞分泌物的修复注射液。各组小鼠在通风、温度18-25℃、湿度60％-70％环境下饲养，自由进食水。各组于建模后0d、3d、7d、10d分别随机处死5只，取血后分离血清，检测各组谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)水平，见图7和图8。图6表明，人脂肪间充质干细胞饥饿三次培养，与饥饿一次、饥饿两次相比，各种细胞因子分泌量显著提高；图7和图8表明，急性肝衰竭小鼠在分别注射步骤(9)中饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次的含高浓度人脂肪间充质干细胞分泌物的修复注射液后，谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)水平呈明显下降趋势，急性肝衰竭程度明显改善，并且注射饥饿三次的含高浓度人脂肪间充质干细胞分泌物的修复注射液的小鼠，谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)数值已接近正常水平，急性肝衰竭改善程度最为显著。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。