一种提高聚乙烯亚胺抗大肠杆菌性能的方法与流程

本发明属于抗菌技术领域，具体涉及一种提高聚乙烯亚胺抗大肠杆菌性能的方法。

背景技术：

大肠杆菌(escherichiacoli)是一种生活中常见的致病菌，常引起腹泻和败血症，它是一种两端钝圆、周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，广泛分布于自然界中，因此食品受其污染几率很大，易引发食物中毒。例如，2006年美国的菠菜被大肠杆菌污染，疾病波及半个美国；2011年欧洲的“毒黄瓜”事件，也是由于大肠杆菌污染蔬菜引发的感染。大肠杆菌在全球已经引发了多次大规模的感染，导致很多人死亡。为了保证食品安全，让消费者能安心购买绿色、健康食品。研究一种新型的大肠杆菌杀菌方法，具有十分重要的意义。

目前常见的大肠杆菌杀菌方法主要采取抗生素进行杀菌，由于大量使用抗生素，使大肠杆菌对许多抗生素产生了耐药性，其中70％的菌至少对一种药有抗性，并且高浓度的抗生素对人体具有一定的危害。针对细菌的抗生素耐药性问题，新型的抗生素成为研究热点。阳离子聚合物作为一种全新的抗菌剂，有不同于常规抗生素的抗菌机理，使细菌很难产生耐药性，而聚乙烯亚胺是阳离子抗菌剂中的典型代表之一。

聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，pei)一种新型多聚阳离子化合物，具有水溶性。根据分子结构的不同，可分为直线型(l-pei)和分支型(b-pei)两类，其分子结构式如下：

在pei的结构中，含有大量的氨基，正是由于大量的氨基赋予了pei重要的特性，即具有较高的正电荷。因此，单独的pei(未被修饰的)可以通过库仑引力作用与带负电荷的细菌接触，破坏细菌的结构，从而抑制细菌生长。2012年katherinea课题组报道(macromolecularbioscience,2012,12,1279–1289)，单独的pei对细菌的抑制具有选择性，对金黄色葡萄球菌的抑制作用比较明显(最低抑菌浓度比较低)；另外，不同分子量的pei抑菌效果也不一样，对大肠杆菌来说，b-pei600最低抑菌浓度为500μg/ml，b-pei1800最低抑菌浓度为250μg/ml，b-pei10000的最低抑菌浓度大于1g/ml；对金黄色葡萄球菌来说，b-pei600(mw:600)最低抑菌浓度为16μg/ml，b-pei1800最低抑菌浓度为32μg/ml，b-pei10000的最低抑菌浓度16μg/ml。由此可见，b-pei对金黄色葡萄球菌的抗菌效果远优于对大肠杆菌的抑菌效果，而b-pei对大肠杆菌的抗菌效果不理想限制了它的应用；另一方面，随着b-pei分子量的增大，细胞毒性也随之增加。因此，如何降低pei的细胞毒性并提高其对大肠杆菌的抗菌效果亟待解决。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种简单快速提高聚乙烯亚胺抗大肠杆菌性能的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：在分支型聚乙烯亚胺上修饰甘露糖。

上述在分支型聚乙烯亚胺上修饰甘露糖的方法为：将分支型聚乙烯亚胺和甘露糖加入ph＝7.4的pbs缓冲液中，在80～100℃下搅拌30～60分钟。

上述在分支型聚乙烯亚胺上修饰甘露糖的方法进一步优选：将分支型聚乙烯亚胺和甘露糖加入ph＝7.4的pbs缓冲液中，在90℃下搅拌40分钟。

上述方法中，所述的分支型聚乙烯亚胺与甘露糖的质量比为1:0.09～0.72，优选分支型聚乙烯亚胺与甘露糖的质量比为1:0.24～0.36。

本发明在分支型聚乙烯亚胺上修饰甘露糖的合成过程，甘露糖上的醛基和分支型聚乙烯亚胺上的氨基可以发生如下反应：

r2c＝o+r'nh2——r2c＝nr'+h2o

即醛基与伯胺生成含碳氮双键的亚胺(席夫碱结构)，从而形成具有荧光的聚合物粒子——甘露糖修饰的聚乙烯亚胺(man-peicps)。

本发明可以快速有效地将甘露糖修饰在聚乙烯亚胺上，所合成的man-peicps一方面通过甘露糖和大肠杆菌表面的鞭毛蛋白fimh的特异性结合，增加了聚乙烯亚胺与大肠杆菌的结合机会；另一方面甘露糖和聚乙烯亚胺之间形成的席夫碱结构也有助于提高聚乙烯亚胺对大肠杆菌的杀菌能力。本发明操作简单，反应时间短，成本低廉，不需要过多的化学修饰和复杂的大型仪器，且合成所得man-peicps具有优良的抗菌性能和较低的细胞毒性。

附图说明

图1是甘露糖(man)、b-pei(mw:600)、实施例3中man-peicps的紫外-可见吸收光谱图以及man-peicps的荧光发射光谱图。

图2是b-pei(mw:600)的sem图。

图3是实施例3中man-peicps的sem图。

图4是b-pei(mw:600)和实施例3中man-peicps的¹hnrm光谱(d2o，600mhz)。

图5是实施例1～4中以不同配比(b-pei:man)合成的man-peicps(10μg/ml)杀菌3h后在lb肉汤琼脂培养板上菌落总数(cfu)的照片。

图6是实施例3、5、6中不同分子量的b-pei和man-peicps(10μg/ml)对大肠杆菌的杀菌率。

图7是b-pei(mw:600)在不同浓度下对大肠杆菌的杀菌率。

图8是实施例3的man-peicps在不同浓度下对大肠杆菌的杀菌率。

图9是hela细胞在不同浓度b-pei(mw:600)和实施例3的man-peicps下的存活率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为600的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.09g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，置于冰箱中4℃保存。

实施例2

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为600的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.18g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，置于冰箱中4℃保存。

实施例3

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为600的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.36g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，置于冰箱中4℃保存。

实施例4

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为600的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.72g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，置于冰箱中4℃保存。

由图1可知，man-peicps在352nm处出现新的吸收峰，而b-pei和甘露糖在250nm以上没有吸收峰。另一方面，man-peicps溶液在λem＝460nm处显示出强烈的荧光。由图2和图3可见，与b-pei相比，man-peicps是单分散的，呈现直径约15μm的粗糙球体。这些结果都证明了甘露糖被成功地修饰在了聚乙烯亚胺上，形成了新的聚合物粒子。由图4可见，man-peicps的¹hnmr光谱在8.40ppm处出现新的峰，而b-pei在该位置没有峰，而这正是属于h2c＝n-的峰位置，这一结果进一步证实了甘露糖是通过希夫碱结构被修饰到聚乙烯亚胺上。

实施例5

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为1800的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.36g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，随后置于冰箱中4℃保存。

实施例6

在7ml10mmph＝7.4的pbs缓冲液中加入1g重均分子量为10000的b-pei，搅拌均匀，然后加入0.36g甘露糖，在90℃下搅拌40min，冷却后置于透析袋中透析24h，得到man-peicps，随后置于冰箱中4℃保存。

为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1～6中的b-pei及相应的man-peicps的性能进行了对比测试，具体试验情况如下：

1、抗大肠杆菌性能试验

抗菌剂的抗菌性能通常由最小杀菌浓度(mbc)来表征。mbc是指完全杀死某种受试细菌所需抗菌剂的最小浓度，mbc值越小，表明这种材料杀死该种微生物生长的能力越强。最小杀菌浓度的测定由以下步骤组成：

(1)称取lb肉汤25.0g加入1l蒸馏水中，煮沸使其充分溶解后，调节ph至7.2～7.3，加入15g琼脂粉，煮沸溶解后，于121℃高压灭菌20min。灭菌后，于无菌操作台上倾注平板备用。从-80℃冰箱中取出大肠杆菌菌种冻存管，待菌液溶解后，将菌液用无菌水稀释适当倍，取100μl涂于平板上，在37℃下培养18h。

(2)在超净台中，取出20ml灭菌后的液体培养基转移到100ml锥形瓶中，用10μl移液枪吸取上述平板上一个完整的菌落，将枪头打入锥形瓶中，放入摇床(37℃，260r/min)孵育14h使细菌悬浮液od600＝1。

(3)取出摇床中孵育14h后的菌液，吸取5ml于10ml离心管中，离心(6000r/min,2min)，去上清液，加入5ml生理盐水，混匀后离心(6000r/min，2min)，重复两次，再向洗去培养基的菌体中加入5ml生理盐水，混匀待用。用ph＝7.4的pbs缓冲液将上述菌液稀释1×10⁵倍后，向其中加入不同浓度的b-pei或man-peicps溶液，放入摇床(37℃，260r/min)孵育3h，取100μl涂于平板上，于37℃下倒置培养18h，观察菌落生长情况；以pbs缓冲液代替b-pei、man-peicps做空白对照实验，平行实验3次。

杀菌率的计算方法：

杀菌率＝(1-实验组菌落数/空白组菌落数)×100％

从图5可以看出，实施例1～4中，随着甘露糖量的不断增加，man-peicps的抗菌效果显著提高，在b-pei:man＝1:0.36(实施例3)时对大肠杆菌的杀菌率为100％。不仅是分子量为600的b-pei，图6表明，对其它分子量的b-pei，通过连接相同比例的甘露糖后，杀菌效果均有明显的提高。

图7、8进一步确定了分子量为600时，b-pei的最低杀菌浓度为220μg/ml，而man-peicps在10μg/ml时就可以达到99.9％的杀菌率，因此，相比较b-pei，man-peicps使b-pei的最小杀菌浓度降低了22倍，有效地提高了b-pei对大肠杆菌的杀菌率。

2、细胞毒性试验

根据3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)方法评价对hela细胞的细胞毒性。用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，并在37℃、5％co2中孵育12h。用培养液将b-pei和man-peicps等浓度梯度稀释，使加入96孔板的最终浓度分别为10、50、100、250、500μg/ml，每个浓度重复3次。培养24h后，用pbs缓冲液洗涤细胞，然后向每孔中加入20μl等份的mtt，以除去b-pei和man-peicps，继续培养4h。最后，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

如图9所示，man-peicps在mbc(10μg/ml)下没有细胞毒性，而b-pei在mbc(220μg/ml)下却表现出一定的细胞毒性。将抗菌药物浓度增加到500μg/ml时，加入man-peicps培养24h后，细胞活力仍保持在75％，而加入b-pei的细胞活力下降至56％。因此，相比较b-pei，man-peicps在提高b-pei对大肠杆菌杀菌效果的同时，也降低了b-pei的细胞毒性，这进一步证明了其作为抗菌剂具有良好的应用前景。