够抑制肥大刺激因子所诱导的心肌细胞肥大，包括肥大指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对刺激组相比都有明显的降低；在动物水平通过注射外源PiRNA也能够抑制肥大模型的肥大效应包括心脏表型、心脏体重比、边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)和心肌纤维化(Masson染色)都有明显的降低，同时心功能也有明显的改善。
[0010]本发明与现有技术相比，其药物组合物配方合理，药理可靠，制作工艺简单，治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。
【附图说明】
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[0011]图1为经心脏肥大刺激因子PE (苯肾上腺素)诱导的心肌细胞肥大过程中PiRNA表达水平的变化；
[0012]图2为经piRNA反义核苷酸抑制剂转染的原代细胞进行心肌细胞肥大效应的检测结果示意图；
[0013]图3为经piRNA转染的原代细胞进行PE处理，在细胞水平上对PE所诱导的肥大的抑制情况；
[0014]图4为小鼠静脉注射piRNA能抑制PE所诱导的肥大模型的检测结果示意图。【具体实施方式】:
[0015]下面通过具体实施例并结合附图对本发明作出进一步阐述。
[0016]实施例1、
[0017]piRNA过表达腺病毒载体及阴性对照腺病毒构建，本实施例采用人工合成piRNA序列，亚克隆连入Amb1n公司的pSi lencer Adeno 1.0-CMV系统，构建piRNA过表达腺病毒。其 piRNA 序列如下列 SEQ ID NO:1 所示:5’ -UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’ ；
[0018]按照公司说明书步骤，将Pac I线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(AdenovirTs LacZ Backbone)共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。
[0019]将上述所得的过表达piRNA的重组体腺病毒磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度lxl016PFU/ml，按Iml量无菌分装到安瓿瓶内，即得。
[0020]实施例2、
[0021]在PE刺激下P i RNA表达水平的变化，本实施例对于心肌细胞肥大模型，采用已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献:ff.-Q.Tan, etal, Foxo3aInhibits Card1myocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J B1lChem.20080ctober 31 ；283(44): 29730-29739)，对心肌细胞用PE进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测piRNA的表达水平。如图1所示，大鼠乳鼠原代心肌细胞经PE处理后piRNA随时间的表达水平，纵坐标表示以未处理的大鼠原代心肌细胞中PiRNA的表达水平为基准，在PE处理过程中大鼠原代心肌细胞中piRNA的表达水平。piRNA表达水平在PE处理6小时之内有显著的下降。
[0022]实施例3、
[0023]piRNA反义核苷酸能够在细胞水平上诱导的肥大，本实施例对原代心肌细胞转染PiRNA反义核苷酸(anta-piRNA)后，能有效的抑制piRNA的表达，同时细胞用anta-piRNA对心肌细胞进行处理，及同时用piRNA反义核苷酸的阴性对照(anta-NC)处理，经过24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如心肌细胞表面积(图2A)、蛋白/DNA(图2B)检测，实验结果证明piRNA反义核苷酸能够有效的诱导心肌细胞肥大。
[0024]实施例4、
[0025]piRNA能够在细胞水平上抑制PE所诱导的心肌细胞肥大，本实施例对原代心肌细胞感染piRNA腺病毒后，用PE对心肌细胞进行处理，经过处理24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如心肌细胞表面积(图3A)、蛋白/DNA(图3B)检测，如图3所示，实验结果证明PiRNA能够有效的抑制PE所诱导的心肌细胞的肥大。
[0026]实施例5、
[0027]小鼠静脉注射piRNA腺病毒能抑制PE所诱导的肥大模型，本实施例对小鼠用PE埋泵处理二周后，小鼠的心脏有明显的肥大表型，而同时加入piRNA可以明显减弱PE所诱导的肥大效应包括心肌细胞的横截面积大小(WGA染色)(如图4A)及心脏体重比(如图4B);同时向小鼠注射piRNA的阴性对照和PE，并不能减弱PE的肥大效应，实验结果证实PiRNA能够在整体水平抑制PE所诱导的心脏肥大的发生。
【主权项】
1.一种PiRNA药物组合物，其特征在于PiRNA序列为:5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’ ；该药物组合物包括感染滴度为116PFU过表达piRNA载体、病毒或辅料；所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种piRNA药物组合物，其特征在于药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种。
3.—种piRNA药物组合物的用途，其特征在于通过口服或注射用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰。
【专利摘要】本发明涉及一种piRNA药物组合物及其用途，piRNA序列为：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；该药物组合物包括感染滴度为1016PFU过表达piRNA载体、病毒或辅料；所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。该药物组合物用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰，其配方合理，药理可靠，制作工艺简单，治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。
【IPC分类】A61K48-00, A61K31-7088, A61P9-04, A61P9-10
【公开号】CN104548136
【申请号】CN201510039653
【发明人】李培峰, 王昆, 周露玙, 赵兵, 赵文科
【申请人】青岛大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月27日