br>[0054]裂解液 A 液：0?6057g Tris 碱，I. 7532g NaCl，0. 1017g MgCl2?6H20,0. 0742g EDTA，IOmL甘油，IOmL 10% NP40,加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7. 6,定容至191mL， 充分混匀，0. 45 y m滤膜过滤，4°C储存。
[0055]裂解液 B 液：200 y L 2M 0-磷酸甘油，4mL 2. 5M NaF，2mL IOOmM NaVO3, 2mL100mM PMSF，200 y L IM DIT，lmg/mL 的 Leu、P印、Apr 各 200 y L，总体积共 9mL。母液于-20°C储 存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。
[0056] Protein A/G Plus-Agarose 购自美国 Santa cruz 公司。
[0057] 具体操作步骤如下：
[0058] (1)将肺组织大叶取下称量。
[0059] (2)以免疫共沉淀裂解液肺组织，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至 相同浓度。每组蛋白各取200 yg，将各组蛋白取出200 yg作为细胞裂解液的输入组，并将 所得输入组的细胞裂解液作为对照。
[0060] (3)剩余蛋白加入2yg P62抗体（购买自Sigma，编号为P0067)或者与P62抗 体种属相同的普通IgG抗体（购买自cell signaling，商品编号为2729)，同时加入10 y L Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4°C缓慢旋转摇动过夜。4°C，3000rpm离心5min，小 心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0. 5mL免疫共沉淀裂解液，混勾， 冰浴静置lmin，4°C，3000rpm离心3〇sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静 置5min。小心吸除上清，加入20-30 y L 2 X SDS凝胶加样缓冲液，混勾，95°C变性3min，迅 速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进 行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0061] 所得结果见图2 (A)和图2 (B)，其中图2 (A)显示初始肺组织裂解液所含TRB3蛋白 与P62蛋白的蛋白含量；图2 (B)显示肺组织裂解液经过P62抗体或对照抗体IgG沉淀之后 所含TRB3蛋白与P62蛋白的蛋白量，由图2(A)和图2(B)结果可见肺纤维化组织内TRB3 蛋白与P62蛋白存在相互结合的现象。其中输入的细胞裂解液制备方法如上文所示，输入 代表初始肺组织裂解液中TRB3蛋白与P62的蛋白含量，即蛋白原液在经过P62抗体或对照 抗体IgG (由于P62抗体为IgG型抗体，故选择IgG抗体作为对照）沉淀之前的TRB3蛋白 和P62蛋白含量，结果表明，输入组细胞裂解液中的TRB3蛋白及P62蛋白的含量一致。
[0062] 其中输出代表蛋白原液经过P62抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含蛋白量，由于 IgG抗体作为P62抗体的对照抗体，不能将P62蛋白沉淀下来，因此IgG抗体处理的细胞裂 解液中P62蛋白印迹泳道显示为空白，而P62抗体作为实验组抗体，能与P62蛋白结合并且 将其沉淀下来，因此P62抗体处理后的细胞裂解液结果为P62蛋白印迹泳道显示为黑色。 正是因为P62蛋白与TRB3蛋白之间存在相互作用，因此使用P62抗体沉淀P62蛋白时也能 将TRB3蛋白沉淀下来，故P62抗体处理后的细胞裂解液的TRB3蛋白印迹泳道显示为黑色。 由于IgG抗体不能将P62蛋白沉淀下来，因此也无法将P62相互作用蛋白TRB3蛋白沉淀下 来，故IgG抗体处理的后的细胞裂解液的TRB3蛋白印迹泳道为空白。上述实验结果充分证 明，TRB3蛋白与P62蛋白能够直接发生相互作用
[0063] 实施例4流式细胞术方法验证肺上皮细胞对胶原的吞噬作用，并验证p印2-A1、 p印2-A2、p印2-A3以及自噬激动剂和自噬抑制剂对细胞内胶原的清除作用
[0064] (1)MLE-12细胞（MLE-12细胞购于ATCC)，细胞加入密度为I. 2X106(个/孔），于 6孔板进行培养。
[0065] (2)除对照孔外均加入FITC标记的胶原（FITC标记胶原购自invitrogen公司）， 加入浓度为I y g/m作用1小时。
[0066] (3) 1小时后用培养基清洗细胞3次，并加入p印2-Al、p印2-A2、p印2-A3(5 yM)，以 及雷帕霉素（雷帕霉素购自默克）（10 U M)和3-MA (3-MA购买自sigma) (2mM)。
[0067] (4)刺激2小时后，细胞用胰酶消化并收集，通过流式细胞仪，应用488nm激光激 发，FLl通道进行检测。
[0068] 结果见图3(A)和图3(B)，3(A)为流式结果图，图3(B)为流式结果统计图。从图 3(A)和图3(B)可见，加入胶原-FITC后，MLE-12细胞内胶原含量明显增加，说明有胶原的 摄取。使用P印2-Al、p印2-A2、p印2-A3后细胞内胶原含量明显降低。使用自噬通路激动剂 雷帕霉素也可使细胞内胶原含量显著降低，而使用自噬信号抑制剂3-MA则能进一步加剧 细胞内胶原的堆积，统计数据为均值土SE。其中##为与假手术组相比p〈0. 01，*为与模型 组相比p〈〇. 05, #为与模型组相比p〈0. 01。
[0069] 实施例5利用肺纤维化动物模型验证pep2_Al、pep2_A2、pep2_A3治疗肺纤维化 作用
[0070] 将实施例1制备的动物模型在造模10天后分组给药，分组和给药情况如表1所示 (i.p.为腹腔注射给药，i.g.为灌胃给药）。
[0071] 表1肺纤维化动物模型在造模后的分组给药情况
[0072]
【主权项】
1. 一种可特异性结合TRB3蛋白的多肽或其衍生物在制备预防或治疗肺纤维化的药物 中的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3蛋白的多肽是如序列表中SEQ ID N0:1，SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3中任意一条所示的多肽；所述可特异性结合TRB3蛋白的多肽的衍 生物为可特异性结合TRB3蛋白的多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞穿膜肽是如序列表中SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 中任一条所 示的多肽。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID N0:1， SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3中的任意一条所示的多肽序列的N端或C端与细胞穿膜肽连 接所得嵌合肽。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 中任一条所示。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防或治疗肺纤维化的药物中，所述 可特异性结合TRB3蛋白的多肽或其衍生物作为单一活性成分或者与其他具有预防或治疗 肺纤维化活性的化合物联合作为活性成分。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化为原发性肺纤维化或继发性 肺纤维化。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的继发性肺纤维化为博莱霉素引起的 肺纤维化。
8. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗肺纤维化的药物为治疗肺纤维 化引起的肺部炎症、肺功能退化和肺损伤症状中的一种或多种的药物。
【专利摘要】本发明公开了可特异性结合TRB3蛋白的多肽或所述多肽的衍生物在制备预防或治疗肺纤维化的药物中的应用，所述可特异性结合TRB3蛋白的多肽是如序列表中SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任意一条所示的多肽；所述可特异性结合TRB3蛋白的多肽的衍生物为可特异性结合TRB3蛋白的多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。本发明所述多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3蛋白结合，阻断TRB3蛋白与P62蛋白的相互作用，采用所述多肽或其衍生物制备得到的预防或治疗肺纤维化的药物，具有疗效显著，毒副作用小，使用安全的优点。
【IPC分类】A61K38-08, A61P11-00, A61K38-16
【公开号】CN104740604
【申请号】CN201410826820
【发明人】胡卓伟, 吕晓希, 李珂
【申请人】胡卓伟
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年12月25日
【公告号】WO2015096756A1