实验例及制造例为了使本发明的公开完全、使发明的范畴完全被本领域技术人员得 知而提供。
[0055] 实施例1:YIGSR的制浩
[0056] 委托肽制造会社（Anygen，韩国），制造了 YIGSR肽（序列号1)。
[0057] 实施例 2 :palmitoyl-YIGSR 的制造
[0058]使用棕榈酰-酪氨酸（palmitoyl-tyrosine)，用与实施例1的方法相同的方 法制造在上述实施例1的YIGSR肽（序列号1)的N末端附着有棕榈酰基的肽衍生物 (Pal-YIGSR、分子量：846) (Anygen，韩国）。
[0059] 比较例1 :Pal-RCT)的制i告
[0060] 使用棕榈酰-精氨酸（palmitoyl-arginine)，用与上述实施例1相同的方法中制 造在N末端附着有棕榈酰基的RGD肽。RGD为具有整合素结合活性的肽，是作为细胞附着剂 等使用的物质。
[0061]比较例 2 :olevl-YIGSR 的制浩
[0062] 使用油烯基-酪氨酸（oleyl-tyrosine)，用与上述实施例1相同的方法制造在N 末端添加有油基的YIGSR肽来代替棕榈酰基。
[0063] 实施例3 :Hs27细朐的培养
[0064]对作为人皮肤成纤维细胞的Hs27细胞（ATCC)，使用添加有10% FBS(Lonza，USA) 的DMEM培养基（Lonza、USA)，在湿度95%、5% C02、37°C的条件下进行培养。所述Hs27细 胞使用5~20编号之间继代培养的细胞，对肽进行处理之前，在不含有FBS的DMEM培养基 上培养24小时后，进行处理。
[0065] 实验例1 :HGSR肽引起的胶原蛋白I表汰的夺化分析
[0066] 1-1 :利用了蛋白质印迹的YIGSR肽引起的胶原蛋白I表汰的夺化分析
[0067] 为了确认本发明的一个实施例中YIGSR肽引起的对皮肤成纤维细胞的影响，首 先，用不同浓度的上述实施例1的肽对Hs27细胞进行处理后，通过蛋白质印迹分析确认胶 原蛋白（collagen)型I蛋白质的表达水平。
[0068] 将各浓度（0、102、101、1、10、102、10 3、104及105恤）的肽对上述实施例3的此27 皮肤成纤维细胞中处理24小时后，将该进行了处理的细胞在溶解缓冲液[150mM NaCl、l% Triton X-100、10mMTris、lmM EDTA、pH7. 4]中进行超声波粉碎后，进行离心分离，并在分离 上清液之后，用蛋白浓度测定法（Bradford assay)进行定量。将同量的蛋白质与5X试样 缓冲液混合，在95°(：下加热5分钟后，以6~15%浓度梯度505^^6￡(505-聚丙烯酰胺凝 胶电泳（SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis))进行电泳之后，使其吸附于硝基纤 维素（nitrocellulose)膜。使抗-第1型胶原蛋白1次抗体（Rockland，USA)及抗-肌动 蛋白1次抗体（Santa Cruz，USA)在含有5%脱脂乳（skimmed milk)的TBST缓冲液（含 有 0? 05%吐温 20 的 Tris 缓冲液（Tris buffered saline with 0? 05%吐温 20)、pH7. 6) 中稀释并反应16小时后，用TBST 10分钟内清洗6次。其后，对抗-鼠兔过氧化酶-结合2 次抗体（KPL、USA)进行处理，在室温下反应1小时后，再用TBST在10分钟内清洗6次，在 ECL(增强化学发光（enhanced chemiluminescent))溶液（Amersham，USA)中显色进行确 认。另外，将蛋白质印迹分析图像通过浓度分析（densitometric anaylsis)定量地比较， 利用图像 J 程序（Verl. 38, http ://rsbweb. nih. gov/i j/index. html) 〇 [0069] 其结果，如图1所示，本发明的一个实施例的HGSR肽使处理量依赖性地胶原蛋白 I蛋白质的表达显著地增加，在YIGSR肽浓度为103nM下最大地生成胶原蛋白。另外，与未 处理的Hs27细胞的胶原蛋白I的表达水平比较，进行103nM YIGSR肽处理时增加了 6倍以 上胶原蛋白I。
[0070] 接着，本发明人通过蛋白质印迹分析确认基于YIGSR肽处理时间的胶原蛋白生成 水平。将1 yM YIGSR肽对上述实施例1的Hs27皮肤成纤维细胞处理0、0. 5、6、12及24小 时后，将该被处理的细胞与上述的结果同样地进行蛋白质印迹分析。另外，将蛋白质印迹分 析图像使用图像J程序（Verl. 38，http ://rsbweb. nih. gov/ij/index. html)定量地比较表 达量。
[0071] 其结果，如图IB所示，YIGSR肽的处理时间越延长，在Hs27细胞中胶原蛋白I的 表达越增加，处理24小时时，将YIGSR肽与未处理的Hs27细胞相比，胶原蛋白I的表达水 平增加约5倍左右。
[0072] 1-2 :利用了宙量的RT-PCR的YIGSR肽引起的胶原蛋白I表汰的夺化分析
[0073] 接着，本发明人通过mRNA水平确认了 YIGSR肽对胶原蛋白I生成带来的影响。 用各浓度（〇、1〇、1〇2、1〇3、1〇 4及1〇5_的肽对上述实施例3的此27皮肤成纤维细胞处 理24小时后，使用TRIzol试剂（Invitrogen Corp，USA)对该被处理的细胞萃取整体 RNA，将所述被萃取的RNA lyg使用oligo(dT)引物及白血病病毒逆转录酶进行逆转录 (reverse transcription)PCR。其后，对所述 PCR 扩增产物 8 yl、2xSYBR GreemI Premix ExTaq (TAKARA，Japan) 10 y 1、1 y M正方向及逆方向引物混合物2 y 1进行混合，使用 Bio-Rad CFX96 实时 PCR检测系统（Bio-Rad CFX96 实时 PCR detection system)进行实时 qPCR(实时qPCR)。此时，实时qPCR条件为，在95°C下加热1分钟后、在95°C下15秒（变 性）、在60°C下15秒（退火）、在72°C下30秒（扩增），上述操作重复40个循环而进行扩 增。而且，根据由Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad CFX96实时PCR detection system)提供的结果分析变解链曲线（melting curve)。为了确认胶原蛋白I mRNA而使用 的引物如下所述：
[0074] 正方向引物：5 '-GAACGCGTGTCATCCCTTGT-3'（序列号 2);及
[0075] 逆方向引物：5 '-GAACGAGGTAGTCITTCAGCAACA-3'（序列号 3)。
[0076] 其结果，如图1C所示，显示与胶原蛋白I蛋白质的表达水平类似的倾向性，在进行 10 3nM YIGSR肽处理时，胶原蛋白I mRNA水平最高（参照图1C)。上述结果证明本发明的 一个实施例的YIGSR肽在转录水平（transcriptional level)调节胶原蛋白I。
[0077] 实验例2 :YIGSR肽引起的细朐牛存率的夺化分析
[0078] 为了确认本发明的一个实施例的YIGSR肽对细胞生存带来的影响，基于肽处理浓 度及处理时间通过MTT分析确认了细胞生存率。
[0079] 将上述实施例3的Hs27细胞在96孔板上以1 X 104细胞/孔的比率植入后，培养 24小时，其后，在不含有血清的培养基上进一步培养24小时。而且，在实施例1的HGSR 肽为0、10、10 2、103、104及10 5nM的浓度下进行处理，培养24小时。其后，除去培养基，添加 溶于PBS的0? 5mg/ml MIT(Sigma-Aldrichi，USA)，在37°C下在C02细胞培养器中反应3小 时。其后，除去所述MTT溶液，将100 y 1的DMS0溶液添加于各自的孔中，使所述板涡旋振 荡（vortexing) 10分钟，以540nm测定溶液的吸光度。
[0080] 其结果，如图2A所示，将实施例1的YIGSR肽与未处理的对照组比较时，用HGSR 肽进行了处理的细胞生存率没有显示有意义的差异，也没有观察到YIGSR肽处理量依赖的 细胞生存率之差。
[0081] 接着，对本发明的一个实施例中基于YIGSR肽处理时间的细胞生存率进行了分 析。将上述实施例2的Hs27细胞在96孔板上以1 X 104细胞/孔的比率植入后，培养24小 时，然后，在不含有血清的培养基上进一步培养24小时。而且，用10 3nM浓度的实施例1的 YIGSR肽进行了处理，培养0、0. 1、0. 25、0. 5、1、3、6、12及24小时，分析细胞生存率。
[0082] 其结果，如图2B所示，用1 yM的实施例1的YIGSR肽进行了处理时，观察Hs27细 胞的生存率24小时，与未处理时相比没有显示有意义的