差异（参照图2B)。这种结果证明： 本发明的一个实施例的YIGSR肽没有给细胞生存带来影响，在转录水平上调节胶原蛋白I 的表达。
[0083] 实验例3 :YIGSR肽引起的MMP-1表汰的夺化分析
[0084] MMP-1作为分解胶原蛋白的蛋白质分解酶众所周知。由此，为了确认由本发明的 一个实施例的YIGSR肽所诱导的胶原蛋白I的表达增加是否由MMP-1的表达减少而引起， 通过蛋白质印迹分析基于HGSR肽处理时间确认了 MMP-1表达水平。一边对上述实施例2 的Hs27细胞进行培养，一边在不含有血清的培养基上进一步培养24小时后，用实施例1的 YIGSR肽以103nM的浓度进行处理，培养0、0. 1、0. 25、0. 5、1、3、6、12及24小时。然后，将所 述细胞在与实验例1记载的相同条件下进行蛋白质印迹，此时，利用MMP-1(R & D systems， USA)作为1次抗体。另外，将蛋白质印迹分析图像使用图像J程序（Verl. 38, http :// rsbweb. nih. gov/i j/index. html)定量地比较表达量。
[0085] 其结果，如图3所示，在不同的YIGSR肽的处理时间下在MMP-1蛋白质的表达水平 上没有观察到有意义的差异（参照图3)。
[0086] 其证明：本发明的一个实施例的YIGSR肽处理引起的细胞内胶原蛋白表达的增加 是通过使胶原蛋白I基因表达增加的信号传递过程活化而诱导的，而不是由MMP-1表达减 少引起的。
[0087] 实验例4 :YIGSR肽引起的FAK、Pvk2及ERK的磷酸化水平夺化的分析
[0088] 为了查明调节胶原蛋白I表达的信号传递过程，本发明人将在层粘连蛋白受体的 下位信号传递机制作为焦点。已知YIGSR肽与层粘连蛋白受体结合并传递细胞内信号，例 如，作为这种细胞内信号传递已知有FAK及Pyk2的磷酸化。已知FAK为酪氨酸（tyrosine) 磷酸化酶，参与细胞的附着（adhesion)及扩散（spreading)过程（J.T. Parsons et al.， Oncogene，19 :5606-5613,2000)。已知 FAK 参与细胞间的局部附着（focal adhesion)，在 细胞移动及生存中进行重要的作用（J.L.Guan et al.，Nature，358:690-692，1992)。已 知Pyk2通过过程在进行G蛋白质共辄受体（G-protein-coupled receptor)及MAP磷酸化 酶信号机制的细胞扩散及移动（migration)中发挥重要的作用（H. Tang et al.，J. Biol. Chem.，277 :5441-5447,2002)。由此，本发明人通过蛋白质印迹分析基于YIGSR肽处理 时间观察了 FAK、pyK2、及ERK的磷酸化水平。蛋白质印迹分析与上述实验例1的条件同 样地进行，作为 1 次抗体，利用 FAK(Cell signaling，USA)、phospho_FAK(Tyr397，Cell signaling，USA)、pyk2 (Cell signaling，USA)、phosph〇-pyk2 (Tyr402，Cell signaling， USA)、ERK(Santa Cruz Biotechnology，USA)、及 phospho_ERK(Thr202/Tyr204，Abeam， USA) 〇
[0089] 其结果，如图4A所示，FAK的磷酸化（Tyr397)显示随YIGSR肽处理时间的增加而 显著地增加的倾向，FAK的磷酸化水平在0. 1小时（6分钟）处开始增加，持续进行磷酸化至 24小时。另外，通过浓度分析定量地比较这种蛋白质表达水平时，实施HGSR肽处理与未处 理时相比，增加约2倍左右，这种磷酸化水平被保持直到处理24小时为止（参照图4B)。
[0090] 另外，就Pyk2磷酸化（Tyr402)而言，从比FAK发生磷酸化慢的时刻即YIGSR肽处 理开始6后观察到增加，比较浓度分析的结果，在进行了 12小时处理时，与未处理时相比， 磷酸化增加约1. 5倍左右（参照图4A及图4B)。
[0091] 另外，MAPK/ERK的情况下，进行HGSR肽处理时的磷酸化水平与未处理时相比，急 剧地增加约2. 5倍，这种磷酸化增加持续了 24小时（参照图4A及图4B)。
[0092] 上述结果证明：本发明的一个实施例的HGSR肽通过在Hs27人皮肤成纤维细胞中 含有FAK、Pyk2及ERK的下位信号传递机制而诱导层粘连蛋白受体的磷酸化。
[0093] 实验例5 :由FAK及MEK抑制剂引起的由YIGSR肽所诱导的胶原蛋白I表汰夺化 的分析
[0094] 为了确认由本发明的一个实施例的YIGSR肽所诱导的胶原蛋白I的表达是否由 FAK及MAPK介导，利用了 FAK及MEK抑制剂。
[0095] 一边将上述实施例3的Hs27细胞在24孔板上培养，一边将所述细胞在没有血 清的状态下进行培养24小时。然后，在所述细胞中用作为liiM FAK特异的抑制剂的 PF573228(Tocris Bioscience，United Kingdom)处理 24 小时。此时，为了确认本发明的 一个实施例的YIGSR肽引起的胶原蛋白I的表达诱导是否由FAK介导，用lyM YIGSR肽进 行处理或不进行处理，使用蛋白质印迹分析对胶原蛋白I的表达进行分析。
[0096] 其结果，如图5A所示，在使用作为FAK抑制剂的PF573228进行处理时，由HGSR 肽所诱导的胶原蛋白I的表达显著地被抑制，这种结果证明：由HGSR肽所诱导的胶原蛋白 I的表达基于FAK活性而介导（参照图5A)。
[0097] 另外，为了确认MAPK/ERK信号机制是否与由YIGSR肽所诱导的胶原蛋白I的 表达关联，对Hs27细胞用YIGSR肽和作为MAPK/ERK特异抑制剂的H)98059 (Tocris Bioscience，United Kingdom)进行处理，在与所述FAK抑制剂处理的实验相同的条件下进 行实验。
[0098] 其结果，如图5B所示，在作为MEK抑制剂的TO98059进行处理时，由YIGSR肽所诱 导的胶原蛋白I的表达显著地被抑制（参照图5B)。即，上述结果证明：由YIGSR肽所诱导 的胶原蛋白I的表达基于MAPK/ERK信号机制而被介导（参照图5B)。
[0099]实验例6 :Pal_YIGSR肽引起的胶原蛋白合成及ERK磷酸化分析 [0100] 用上述实施例1及实施例2、及比较例2中制造的肽衍生物对培养中的Hs27皮肤 成纤维细胞中进行处理，然后，用免疫印迹分析法对所述细胞中的第1型胶原蛋白表达量 进行测定。对所述Hs27皮肤成纤维细胞使用添加有10%FBS(Lonza，USA)的DMEM培养基 (Lonza，USA)、在湿度95%、5% C02、37°C的条件下进行培养。用各种浓度（0、2、25、50及 100yM)的肽处理24小时，或用100yM的肽按照各种时间（0、0. 5、6、12及24小时）对所述 Hs27皮肤成纤维细胞进行处理，然后，对该进行了处理的细胞在溶解缓冲液（150mM NaCl、 1% Triton X-100、10mM Tris、lmM EDTA、pH7. 4)中进行超声波粉碎之后，进行离心分离而 分离上清液后，用考马斯亮蓝法进行定量。使等量的蛋白质混合于5X试样缓冲液中，在 95°C下加热5分钟后，以6~15%浓度梯度SDS-PAGE进行电泳之后，使其吸附于硝基纤维 素膜。使抗-第1型胶原蛋白1次抗体（R〇ckland，USA)、抗-磷酸化-ERK 1次抗体（Cell 5181^11即，1^4)、及抗-肌动蛋白1次抗体（5&拉 &〇1^，1^4)在含有5%脱脂乳的1851'缓 冲液（含有 0.05%吐温 20 的 Tris 缓冲液（Tris buffered saline with 0.05%吐温 20)、 pH7. 6)中稀释，使其反应16小时后，用TBST在10分钟内清洗6次。其后，对抗-鼠兔过氧 化酶-结合2次抗体（KPL，USA)进行处理，在室温下反应1小时后，再用TBST在10分钟内 清洗6次，在ECL溶液（Amersham，USA)中进行显色而确认。
[0101] 其结果看到如下状态：在皮肤成纤维细胞中Pal-YIGSR对胶原蛋白的形成带来影 响，浓度越增加，胶原蛋白合成量越增加，暴露时间越增加，胶原蛋白质合成量越增加（图 6)。YIGSR与Pal-YIGSR相比，其程度弱，但使胶原蛋白合成增加。但是，在oleyl-YIGSR的 情况下，在胶原蛋白合成程度上，与对照组没有大的差异（图7)。
[0102] 不仅如此，也可以观察到Pal-YIGSR在皮肤成纤维细胞中引起ERK磷酸化诱导 (图8)。但是，YIGSR及oleyl-YIGSR的情况下，对ERK磷酸化带来的影响微小。
[0103] 实验例7 :棕榈酰基的影响分析
[0104] 本发明人等为了确认Pal-YIGSR引起的胶原蛋白合成增加是