与VLPs-DOX纳米递药系统相比，TK-VLPs-DOX纳米递药系统具有更好的肿 瘤靶向性和更强的抗肿瘤生长作用；所述的TK-VLPs-DOX纳米递药系统，能更好地介导纳 米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的应用前景。
[0037] 本发明取得的有益效果：
[0038] 本发明中，TK肽采用基因工程方法与猪细小病毒（PPV)的衣壳蛋白VP2形成的病 毒样颗粒（VLPs)连接在一起构建成纳米载体材料（TK-VLPs)，纳米载体材料包载药物形成 主动靶向纳米递药系统，载药TK-VLPs纳米递药系统具有较好的肿瘤靶向性和较强的抗肿 瘤生长作用，能更好地介导纳米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0039]图 1 为TK及FITC-TK的HPLC及MS图谱；
[0040] 图2为TK肽与受体蛋白结合的等离子共振分析图谱；
[0041] 图3为TK肽对细胞的摄取图，其中，A图：FITC和TK-FITC与Ca〇-2、HRT-18、HUVEC 及L929细胞作用后的激光共聚焦照片；B图：流式细胞仪检测Ca〇-2、HRT-18、HUVEC及L929 细胞对FITC和TK-FITC的摄取情况；
[0042] 图4为TK-VLPs表达及纯化图，其中，A图：直接免疫荧光结果，评价VP2与AVP2 在昆虫细胞Sf9中的表达情况，绿色细胞为成功表达VP2 (a)或AVP2 (b)蛋白的细胞；B图： VP2与AVP2的SDS-PAGE分析，M(Maker)、纯化的VP2 (1)、纯化的AVP2 (2)、空载体（3和 4)、未纯化的VP2(5)、未纯化的AVP2(6) ;C图：VP2与AVP2的Westernblot分析，纯化的 VP2与AVP2 (2和3)，未纯化的VP2与AVP2 (1和4)，空载体（5);
[0043]图5为载药TK-VLPs的制备图，其中，左图：VLPs-D0X(l)，TK-VLPs-D0X(2);右图： 与左图相同，只是琼脂糖凝胶用考马斯亮蓝进一步染色；
[0044] 图6为载药TK-VLPs的表征结果图，其中，A图：TK-VLPs-DOX粒径分布图；B图： TK-VLPs-DOX电镜图；
[0045] 图7为Cao-2及HRT-18细胞对纳米递药系统的摄取图。
【具体实施方式】
[0046] 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例 仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0047] 实施例ITK肽及TK-FITC肽的合成、纯化和表征
[0048] 采用固相合成的方法合成TK肽，具体步骤如下：将PAM-氨基酸-Boc树脂用三氟 乙酸（TFA)脱保护1分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0. 5M的HBTU(溶剂为DMF)中， 室温反应15min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应，反应完成后，用 20 %的哌啶DMF溶液脱除CHO(含有W的氨基酸序列）保护基15分钟，两次。三氟乙酸脱 Boc保护后，用氢氟酸将多肽从树脂上切割下来。TK肽的氨基酸序列为TWYKIAFQRNRK。进 一步通过合成反应获得荧光素标记的TK肽（TK-FITC)。分别用HPLC和ESI-MS表征多肽纯 度和分子量。HPLC和ESI-MS图谱如图1所示，两种多肽质谱计算所得分子量均与理论分子 量相符。
[0049] 实施例2TK肽亲和性评价
[0050] 2.ISPR实验
[0051] 使用Biacore技术进行SPR实验，采用表面等离子共振方法（SPR)测定TK肽与受 体蛋白的结合常数Kd值。首先使用EDC/NHS溶液活化芯片表面的羧基，将整合素蛋白的醋 酸钠溶液进样与CM5芯片偶联，然后将TK肽配制成一系列溶液，从低浓度到高浓度依次进 样，流动相流速为30yL/min，获得的数据用Biacore软件计算TK肽与受体蛋白的结合常 数Kd值。结果见附图2。使用Biacore技术分析TK肽与受体蛋白的结合能力，各曲线代表 该浓度的多肽随时间与受体蛋白结合的动态曲线，使用Biacore分析软件计算多肽与蛋白 结合的Kd值，TK肽与Integrinai及IntegrinaJ3结合的Kd值分别是2. 79X105M 和 2. 69XIO5M,对照肽（TISWPPR肽）与IntegrinaJ1及IntegrinaJ3结合的Kd值 分别为9. 49X10 2M和L01X102M;结果表明，与对照肽相比，TK肽与Integrina6 0i及 Integrinav 0 3结合能力更强。
[0052] 2. 2TK肽与靶向细胞的亲和性评价
[0053] 将Cao-2、HRT-18、HUVEC及L929细胞按照2XIO5ceIls/孔种植在6孔板上或共 聚焦皿上，孵育24h后，弃去培液。在每孔细胞中各加入相同摩尔数FITC或TK-FITC溶液， 培养一定时间，共聚焦显微镜观察或流式细胞记数。结果如图3所示，定性与定量结果均表 明，与FITC相比，TK-FITC与肿瘤细胞具有更强的亲和能力。
[0054] 实施例3VP2与AVP2在昆虫细胞Sf9中的表达
[0055] 3. 1病毒基因组的提取
[0056] 将猪细小病毒同步接种至PK细胞中，37°CCO2培养箱中培养3-5天，细胞培养物 出现明显的细胞病变后，反复冻融3次收毒。对收获的病毒液进行DNA的提取，步骤见DNA 提取试剂盒说明书。
[0057] 3. 2猪细小病毒（PPV)VP2和AVP2制备和序列的测定
[0058] 参考GenBank(登录号：AY583318)中公布的PPV的VP2序列，根据序列两端保守 区设计扩增引物见表1。靶向肽被插入VP2序列构建A VP2基因，设计6条引物用于A VP2 制备，引物见表1。以提取的PPV DNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2。将VP2 连入PMD18-T载体中，得到质粒pMD18-T-vp2。经BamHI和SalI双酶切鉴定正确的质粒 进一步测序鉴定。以鉴定正确的pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增A VP2基因，同样 连入PMD18-T载体中得到质粒pMD18-T- A VP2,经双酶切和测序鉴定。
[0059] SOE-PCR扩增AVP2基因的具体方法如下：本实验使用KOD-Plus高保真DNA聚 合酶（T0Y0B0)试剂盒进行SOE-PCR扩增。使用 50yL体系：K0D-Plus-(LOU/yL)IyL， IOXBufTerforK0D-Plus-5yl;2mMdNTPs5yl;25mMMgS042yl;10pmol/yl上游和下 游引物各I. 5yI;DNA模板 25ng。PCR循环条件：9°C5min，94°C50s;56°CImin;72°C2min; 30个循环，72°ClOmin。第一轮扩增使用引物Pl和P2,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片 段命名P1-P2 ;引物P3和P4,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P3-P4 ;引物P5和 P6,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P5-P6 ;将上述目的基因分别进行胶回收纯 化。第二轮扩增使用引物Pl和P4,模板为P1-P2和P3-P4,获得目的基因片段P1-P4 ;使用引 物P3和P6,模板为P3-P4和P5-P6,获得目的基因片段P3-P6 ;将上述目的基因分别进行胶 回收纯化。第三轮扩增使用引物Pl和P6,模板为P1-P4和P3-P6,获得目的基因片段P1-P6， 即AVP2。将AVP2进行胶回收纯化后连接pMD18-T载体中得到质粒pMD18-T-Avp2,经双 酶切和测序鉴定。
[0060] 表1质粒构建中的引物序列
[0061]
[0062] 注：加粗为BamHI位点，下划线为SalI位点.，斜体为插入的TK序列。
[0063] 3. 3供体质粒的构建
[0064] 将高纯的pMD18-T-AVP2质粒经BamH I和Sal I双酶得到AVP2基因，将其插入 pFastBac HA中，得到pFD_Avp2供体质粒。
[0065] 3. 4重组杆状病毒Bacmid质粒的构建
[0066] 将供体质粒pFD-AVP2转化DHlOBac感受态，加入ImL无抗性LB培养基， 37°C180rpm复苏4h，将复苏后的菌液进行10 \ 10 2和10 3倍稀释，份别取IOOuL至LB筛 选平板中，37 °C培养36-48h，待蓝白斑区分较为明显时，挑选大的白色单菌落，加入LB培养 基（含有终浓度为50ug/mL卡那霉素、7ug/mL庆大霉素、lOug/mL四环霉素）中37°C180rpm 摇12h，进行重组杆粒的提取，按照说明书进行。用M13引物进行PCR鉴定，鉴定正确的重组 杆粒命名为Bacmid-Avp2。
[0067] 3. 5PPV病毒样颗粒的制备
[0068] 将Bacmid-AVP2和和pFastBacHTA空载体分别转染Sf9细胞。按照转染试剂操 作说明，在转染的前1天在六孔细胞培养板中铺Sf9单一层细胞，细胞密度达到70% -90% 时，弃去孔中原有培养液，用无血洁的Grace培养液洗3遍，加入无血洁的Grace培养液