， 2mL/孔，27°C孵育。配转染复合物A、B液，A液/孔：250uL无血清Grace培养液加入5uL 脂质体，混勾，静置5min;B液/孔：250uL无血清Grace培养液加入2ug重组杆粒DNA，混 匀。将AB液混匀，静置20min后转染培养。70%以上细胞病变时，收集上清培养液，即Pl代 重组杆状病毒，收集第三代病毒用于重组蛋白的纯化。VLPs和TK-VLPs蛋白纯化根据已有 报道，简要步骤如下，收集第三代病毒感染的Sf9昆虫细胞，在裂解液中重悬，冻融，然后通 过离心移除碎片。上清液中加入0. 5MNaCl和10%PEG-6000(w/v)后13,OOOg在40°C离心 40分钟。沉淀重悬后蔗糖密度梯度离心。梯度分离后用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴 定。结果表明30%-40%的鹿糖层纯度较高，收集30%-40%的鹿糖层并透析过夜。透析 后进一步通过CsCl缓冲液（25mMEDTA, 0? 6g/mLin50mMTris-HC1,pH7. 8, 0? 5%Triton X-100)进行纯化。结果见图4,结果表明，VP2与AVP2被成功表达和纯化。
[0069] 实施例4载药纳米递药系统TK-VLPs-DOX的制备与表征
[0070] 按照质量比1:5:2:10~1:5:2:40的比例将￥1^或11(，1^，順5(1羟基丁二 酰亚胺），EDC(l-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）和阿霉素放入离心管中，4°C反 应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7. 4的磷酸盐缓冲液，4°C透析 48h，其间每隔12h换液一次。阿霉素与VLPs或TK-VLPs交联结果见图5。非变性琼脂糖凝 胶电泳评价阿霉素是否成功连接到VLPs或TK-VLPs纳米载体上，图5结果表明阿霉素被成 功连接到纳米载体上。用动态光散射测定TK-VLPs-DOX纳米递药系统的粒径分布，用透射 电镜观测其形态及大小，结果如图6所示。图6结果表明，TK-VLPs-DOX粒径在30nm左右。
[0071] 实施例5TK-VLPS-D0X靶向性评价
[0072] 将Cao-2及HRT-18细胞按照2X IO5ceIls/孔种植在12孔板上，孵育24h后，弃 去培液。在每孔细胞中各加入相同摩尔数DOX、VLPs-DOX或TK-VLPs-DOX溶液，培养一定 时间后，荧光显微镜观察。结果如图7所示。Cao-2及HRT-18细胞与DOX，VLPs-DOX或 TK-VLPs-DOX作用后，荧光显微镜结果表明，与VLPs-DOX相比，TK-VLPs-DOX与肿瘤细胞有 更强的亲和能力。
[0073] 实施例6TK-VLPS-D0X药效学评价
[0074] 用含10%FBS的DMEM培养液，在二氧化碳培养箱内（37°C、5%CO2、饱和湿度）培 养Cao-2及HRT-18细胞，分别以7. 5X103cells/well接种于96孔板，24h后，将培养液吸 出，加入一系列浓度的D0X//VLPS-D0X或TK-VLPs-DOX，共培养一定时间后吸出药液，PBS洗 涤后加入含10 %FBS的DMEM培养液，继续培养72h后，采用MTT法测定细胞存活率，计算细 胞存活率，并进行显著性差异分析。结果见表2,结果表明，与VLPs-DOX相比，TK-VLPs-DOX 能更好的抑制肿瘤细胞的增长。
[0075]表 2D0X,VLPs-DOX和TK-VLP-DOX在HRT-18 和Caco-2 细胞上的IC50 值
[0076]
[0077] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，其特征在于，是由纳米载体材料和药物 组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制 备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米 载体材料内。2. 根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的TK肽为靶向多肽，其氨 基酸序列为：TWYKIAFQRNRK;所述的PPV病毒样颗粒为PPV的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗 粒；TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比为1:1~20:1。3. 根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的TK肽修饰的PPV病毒 样颗粒通过以下方法制备得到：将TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到Avp2基因， 克隆到杆状病毒转移载体PFastBacHA中，所得的重组杆状病毒转移载体转化大肠杆菌 DHlOBac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，使其表达Avp2蛋白并组 装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。4. 根据权利要求3所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的方法包括以下步骤： (1)以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2基因，将VP2基因 插入PMD18-T载体中，得到重组载体pMD18-T-vp2 ; ⑵以重组载体pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增获得Avp2基因，将Avp2基 因插入杆状病毒转移载体pFastBacHA中，得到pFD-Avp2供体质粒； (3) 将pFD-Avp2供体质粒转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重组， 得到重组杆粒Bacmid-Avp2 ; (4) 将重组杆粒Bacmid-Avp2转染Sf9细胞，待细胞病变达到70 %以上收集上清培 养液，即第一代重组杆状病毒，连续传代后，以第三代重组杆状病毒作为种毒； (5) 将得到的第三代重组杆状病毒接种Sf9细胞，使其表达Avp2蛋白并组装成TK肽 修饰的PPV病毒样颗粒。5. 根据权利要求4所述的纳米递药系统，其特征在于，步骤（1)中所述的引物的核苷酸 序列为SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 2所示；步骤（2)中SOE-PCR扩增Avp2基因的具体步 骤为：第一轮扩增使用引物P1/P2,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P1-P2 ;引物 P3/P4,模板为pMD18-T-vp2,获得的目的片段命名P3-P4 ;引物P5/P6,模板为pMD18-T-vp2， 获得的目的片段命名P5-P6 ;第二轮扩增使用引物P1/P4,模板为P1-P2和P3-P4,获得目的 基因片段P1-P4 ;使用引物P3/P6，模板为P3-P4和P5-P6，获得目的基因片段P3-P6 ;第三轮 扩增使用引物P1/P6,模板为P1-P4和P3-P6,获得目的基因片段P1-P6,即AVP2基因；弓丨 物P1-P6的核苷酸序列为SEQIDN0:3-SEQIDN0:8所示。6. 根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的纳米递药系统的平均粒 径为 10-100nm。7. 根据权利要求1所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的小分子抗肿瘤药物选自 阿霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、紫杉醇或多系紫杉醇中的一种。8. -种制备权利要求1所述的纳米递药系统的方法，其特征在于，采用昆虫杆状病毒 表达系统制备TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，将小分子抗肿瘤药物通过包裹或共价连接的方 式包载在TK肽修饰的PPV病毒样颗粒内。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用昆虫杆状病毒表达系统制备TK肽修 饰的PPV病毒样颗粒，将TK肽修饰的PPV病毒样颗粒、N-羟基丁二酰亚胺，1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亚胺和小分子抗肿瘤药物按照质量比1:5:2:10~1:5:2:40的比例放 入离心管中，4°C反应48h，反应后的样品装入透析膜中进行透析，透析液为pH7.4的磷酸 盐缓冲液，4°C透析48h，期间每隔12h换液一次，即得。10.权利要求1所述的纳米递药系统在制备靶向治疗结肠癌细胞药物中的用途，优选 的，所述的结肠癌细胞为人结直肠腺癌HRT-18细胞或人结肠癌Cao-2细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用。本发明的纳米递药系统由纳米载体材料和药物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体材料内。所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为TWYKIAFQRNRK。TK肽采用基因工程方法与猪细小病毒(PPV)的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒(VLPs)连接在一起构建成纳米载体材料(TK-VLPs)，纳米载体材料包载药物形成主动靶向纳米递药系统，载药TK-VLPs纳米递药系统具有较好的肿瘤靶向性和较强的抗肿瘤生长作用，能更好地介导纳米递药系统靶向肿瘤组织，具有良好的研究和应用前景。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/337, A61K47/48, A61K31/704, A61K47/46, A61K31/4745
【公开号】CN105194681
【申请号】CN201510593848
【发明人】任亚超, 周玉龙, 于辉, 彭海生
【申请人】哈尔滨医科大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月17日