包含p34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗或转移抑制癌的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含P34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗癌或 抑制癌转移的组合物。
【背景技术】
[0002] 癌是危害人类健康的最大疾病之一，是一种经过一连串的突变过程，细胞以无限 制、无法调整的方式增殖并不死灭而发生的疾病。引发癌的原因可有化学物质、病毒、细 菌、电离福射等的环境或外在原因和先天性基因变异等的内在原因（Klaunig&Kamendulis， Annu Rev Pharmacol Toxicol.，44:239_267,2004)。在早期发现癌的情况下，可采取手术、 放射治疗、化学疗法等治疗方法，但是，存在副作用大的问题，在晚期癌或癌转移的情况下， 没有特殊的治疗方法，只能在已经进入倒计时的人生中渐渐结束生命。
[0003] 近来，查明了各种与癌相关的生化机制，随之也研发出各种治疗剂，但到目前为 止，未能提出可根治癌症的治疗方法。因此，正锐意研究识别与癌相关的多种生物体内分 子，并开发以与癌相关的多种生物体内分子作为靶的药物，还努力尝试通过对这种药物中 的一部分进行组合来提高癌症治疗效果。因此，另外努力研究与癌相关的靶分子可为非常 重要。
[0004] 周知，作为在磷脂酰肌醇 _3 激酶（PI3K，Phosphatidylinositol-3-kinase)信 号传导过程中的重点阴性调控因子，同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN，phosphatase and tensin homolog)肿瘤抑制因子为在人类的癌症中最频繁变异或缺失的基因。根据最新研 究，在调控作为肿瘤抑制因子的同源性磷酸酶-张力蛋白的功能方面，提出关于泛素化的 重要问题，并正在持续研究同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化所需要的调控机制。
[0005] 本发明人在研究与同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化相关的机制的过程中确认 到作为NEDD4-1 (Neuronal precursor cell-expressed developmentalIy down-regulated 4-1)的结合搭档的p34蛋白调控NEDD4-1蛋白的稳定性，并以此调控同源性磷酸酶-张力 蛋白的单泛素化及多聚泛素化（polyubiquitination)的转化。
[0006] 更具体地，在p34的表达增加与作为E3泛素连接酶的NEDD4-1的Wffl域互相作用， 来提高NEDD4-1蛋白的稳定性的结果，导致同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化及同源 性磷酸酶-张力蛋白的分解，相反，抑制（knock-down) p34蛋白将引起同源性磷酸酶-张力 蛋白的单泛素化来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位（nuclear localization)，最终 抑制了与肿瘤的生存、增殖、侵入性乃至转移性相关的蛋白激酶B(Akt)通路。
[0007] 因此，本发明人确认p34通过调控NEDD4-1蛋白的稳定性，来在同源性磷酸酶-张 力蛋白泛素化通路中起到重要调控因子的作用，尤其，在与NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力 蛋白相关的癌的治疗方面，可成为有效的靶，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0008] 技术问题
[0009] 本发明的目的在于，提供用于预防或治疗癌的组合物，上述用于预防或治疗癌的 组合物包含P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
[0010] 并且，本发明目的在于，提供用于抑制癌转移的组合物，上述用于抑制癌转移的组 合物包含P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
[0011] 并且，本发明的目的在于，提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌 转移的方法包括将P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
[0012] 并且，本发明的目的在于，提供利用p34的用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质 的筛选方法。
[0013] 并且，本发明的目的在于，提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对 癌的治疗效果的预测方法，上述P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治 疗效果的预测方法包括向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂的步骤。
[0014] 解决问题的手段
[0015] 为了解决上述问题，本发明提供用于预防或治疗癌的药学组合物，上述用于预防 或治疗癌的药学组合物包含P34基因的表达抑制剂或P34蛋白的活性抑制剂作为有效成 分。
[0016] 并且，本发明提供用于预防或改善癌的食品组合物，上述用于预防或改善癌的食 品组合物包含P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
[0017] 并且，本发明提供用于抑制癌转移的药学组合物，上述用于抑制癌转移的药学组 合物包含P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。
[0018] 并且，本发明提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌转移的方法 包括将P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
[0019] 并且，本发明提供用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，上述用于治 疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法包括：步骤1)，向P34蛋白表达细胞株处理被检 查物质；步骤2)在上述细胞株中测定p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度；以及步 骤3)，选择上述p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度与未处理被检查物质的对照组 相比减少的被检查物质。
[0020] 并且，本发明提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效 果的预测方法，上述P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预 测方法包括：步骤1)，向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂；以及步骤 2)，在上述生物学试料中测定癌细胞是否增殖。
[0021] 发明的效果
[0022] 根据本发明，在抑制p34蛋白方面，在通过引起同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素 化来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位的结果，抑制与肿瘤的生存、增殖、侵入性及转 移性相关的蛋白激酶B通路，从而具有使同时表达同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1的 各种癌细胞的肿瘤发生率及集落形成能力明显减少的效果。因此，本发明的P34基因的表 达抑制剂或P34蛋白的活性抑制剂可有效用作癌的治疗剂或癌转移抑制剂。
【附图说明】
[0023] 图1为示出在293细胞、DU145细胞及MCF-7细胞中利用NEDD-I的免疫沉淀反应 结果的图。
[0024] 图2为示出在293细胞、DU145细胞及MCF-7细胞中通过蛋白印迹法分析p34、 NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
[0025] 图3为示出在DU145细胞及MCF-7细胞的免疫沉淀物中，通过蛋白印迹法分析p34 及NEDD4-1表达水平的结果的图。
[0026] 图4为示出LS1034细胞及MDA-MB231细胞中的NEDD4-1蛋白的免疫沉淀反应结 果的图。
[0027] 图5为示出在各种结肠癌及乳腺癌细胞株中，通过蛋白印迹法分析p34、NEDD4-1 及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
[0028] 图6为示出293细胞中的p34及NEDD4-1的免疫沉淀反应结果的图。
[0029] 图7为示出通过GST-Pull down(谷胱甘肽巯基转移酶拉下）分析及蛋白印迹法 分析P34及NEDD4-1的表达水平的结果的图。
[0030] 图8为示出通过GST-Pull down分析及蛋白印迹法分析p34、同源性磷酸酶-张力 蛋白及NEDD4-1的表达水平的结果的图。
[0031] 图9为示出NEDD4-1变异体的基因敲除类型图，以及示出通过GST-Pull down分 析来进行的P34和NEDD4-1蛋白的相互作用分析结果的图。
[0032] 图10为示出在Wffl域缺失的NEDD4-1蛋白中的GST-Pull down分析结果的图。
[0033] 图11为示出通过GST-Pull down分析来得到的p34、NEDD4-l及同源性磷酸酶-张 力蛋白的相互作用分析结果的图。
[0034] 图12为示出通过免疫沉淀反应来表示基于p34的表达及MG132处理条件的 NEDD4-1的自泛素化的图。
[0035] 图13为示出通过GST-Pull down分析来表示基于p34表达的NEDD4-1的自泛素 化的图。
[0036] 图14为示出通过蛋白印迹法分析p34或NEDD4-1的表达的结果及通过蛋白印迹 法分析基于CHX处理条件的NEDD4-1的表达水平的结果的图。
[0037] 图15为示出通过蛋白印迹法分析基于p34抑制的NEDD4-1及p34蛋白的表达水 平的结果的图。
[0038] 图16为示出通过蛋白印迹法分析基于p34抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白 的表达水平的结果的图。
[0039] 图17为示出通过蛋白印迹法分析基于p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白的 表达水平的结果的图。
[0040] 图18为示出通过蛋白印迹法分析基于P34抑制及CHX处理条件的同源性磷酸 酶-张力蛋白的表达水平的结果的图
[0041] 图19为示出通过蛋白印迹法分析基于p34转染及MG132处理的同源性磷酸酶-张 力蛋白在293细胞中的表达水平的结果的图。
[0042] 图20为示出基于p34转染及MG132处理的同源性磷酸酶-张力蛋白在各个细胞 中的泛素化程度的图。
[0043] 图21为示出基于p34抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白在各个细胞内的多聚泛素 化程度的图。
[0044] 图22为示出基于p34的表达的同源性磷酸酶-张力蛋白在293细胞中的脂质磷 酸分解酶活性的图。
[0045] 图23为示出在转染NEDD4-1小干扰核糖核酸（siRNA) /短发夹核糖核酸（shRNA) 及P34的细胞中，通过蛋白印迹法分析同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平及蛋白激酶B 磷酸化的结果的图。
[0046] 图24为示出通过蛋白印迹法分析基于p34、NEDD4-1小干扰核糖核酸及CHX处理 的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的结果的图。
[0047] 图25为示出基于NEDD4-1小干扰核糖核酸/短发夹核糖核酸、p34的转染及MG132 处理的同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化程度的图。
[0048] 图26为示出基于p34的表达及NEDD4-1抑制的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷 酸分解酶活性的图。
[0049] 图27为示出通过蛋白印迹法分析在抑制X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP)的小鼠胚胎 成纤维细胞（MEF)中的X连锁凋亡抑制蛋白的表达水平的结果的图。
[0050] 图28为示出在抑制X连锁凋亡抑制蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，通过蛋白 印迹法分析基于P34的转染结果的同源性磷酸酶-张力蛋白表达水平的结果的图。
[0051 ] 图29为示出在抑制X连锁凋亡抑制蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，通过免疫 沉淀反应及蛋白印迹法分析基于P34的转染结果的同源性磷酸酶-张力蛋白表达水平的结 果的图。
[0052] 图30为示出在p34抑制MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、DU145细胞及LS1034细胞 中单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
[0053] 图31为示出按细胞核分层/细胞溶质（cytosol)的位置表示在p34抑制小鼠胚 胎成纤维细胞细胞中单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
[0054] 图32为示出基于p34抑制或NEDD4-1抑制的MCF-7细胞中的单泛素化同源性磷 酸酶-张力蛋白的表达水平的图。
[0055] 图33为示出基于NEDD4-1的表达或p34的表达的多聚泛素化同源性磷酸酶-张 力蛋白的表达水平的图。
[0056] 图34为示出基于NEDD4-1的表达或p34的表达的多聚泛素化同源性磷酸酶-张 力蛋白的表达水平的图。
[0057] 图35为示出基于E2酶的存在及p34的表达、NEDD4-1的表达的同源性磷酸酶-张 力蛋白的泛素化程度的图。
[0058] 图36为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞的增殖率的图。
[0059] 图37为示出基于p34抑制的LS1035细胞及MCF7细胞的集落形成能力的图。
[0060] 图38为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞集落的大小的图。
[0061] 图39为示出基于是否抑制p34的LS1035细胞及MCF7细胞中的p34的表达水平、 周期素 E2的表达水平及cdc6基因的表达水平的图。
[0062] 图40为示出通过确认TetR是否表达来确立表达四环素诱导p34-短发夹核糖核 酸矢量的DU145细胞株及MDA-MB-231细胞株的图。
[0063] 图41为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行 四环素处理后，表示P34的表达水平、同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平及磷酸化蛋白激 酶B的表达水平的图。
[0064] 图42为示出在向四环素诱导DU145变异株及四环素诱导MDA-MB-231变异株进行 四环素处理后，表示同源性磷酸酶-张力蛋白磷