节剂、稳定化剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮 料的碳酸化剂等。除此之外，本发明的保健功能食品可包含用于制备天然果汁、果汁饮料及 蔬菜饮料的果肉。这种成分可单独或进行组合来使用。
[0115] 并且，本发明提供治疗癌或抑制癌转移的方法，上述治疗癌或抑制癌转移的方法 包括将P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。
[0116] 本发明的治疗癌或抑制癌转移方法包括以有效治疗量将本发明的P34基因的表 达抑制剂或P34蛋白给药到个体的步骤。优选地，所使用的对特定个体的具体有效治疗量 根据以下事项而不同：所要达到的反应的种类和程度、在根据需要是否使用其他制剂的情 况下的具体组合物、个体的年龄、体重、常规健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及 组合物的分泌率、治疗期间、包括与具体组合物一同使用或同时使用的药物在内的各种因 素和医学领域周知的相似因素。因此，优选地，可考虑上述事项来决定适合本发明目的的组 合物的有效量。
[0117] 在本发明中，个体可以为患癌的任意哺乳动物，上述哺乳动物不仅包括人类及灵 长类，而且还包括牛、猪、氧、马、狗及猫等的家畜。
[0118] 并且，本发明提供用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，上述用于治 疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法包括：步骤1)，向P34蛋白表达细胞株处理被检 查物质；步骤2)，在上述细胞株中测定p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度；以及步 骤3)，选择上述p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度与未处理被检查物质的对照组 相比减少的被检查物质。
[0119] 在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤1)中的细胞株 包括全部癌细胞株，上述细胞株优选为同时表达P34及NEDD4-1的癌细胞株，但不局限于 此。
[0120] 在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤2)中的基因 的表达水平可通过逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)、印迹杂交（Northern blot)、c脱氧核糖核酸微阵列混合反应及原位（in situ) 混合反应等的方法来测定，基因的表达水平可使用全部本发明所属领域的普通技术人员已 知的测定基因量的方法来测定，但并不局限于此。
[0121] 在上述用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法中，步骤2)中的蛋白的 活性程度可通过免疫共沉淀（immunprecipitation)、放射免疫分析（RIA)、酶联免疫吸附 测定（ELISA)、免疫组织化学、蛋白印迹法（Western Blottiing)及流式细胞分析法（FACS) 等方法来测定，蛋白的活性程度可使用全部本发明所属领域的普通技术人员已知的测定蛋 白量的方法来测定，但并不局限于此。
[0122] 并且，本发明提供p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效 果的预测方法，上述P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预 测方法包括：步骤1)，向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂；以及步骤 2)，在上述生物学试料中测定癌细胞是否增殖。
[0123] 在上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方 法中，步骤1)中的生物学试料包括患癌的个体的血液、尿液、唾液及组织等，但并不局限于 此。
[0124] 上述p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法 还包括步骤3)，预测若生物学试料中的癌细胞增殖，则p34的表达抑制剂或活性抑制剂对 癌无治疗效果，若生物学试料中的癌细胞未增殖，则P34的表达抑制剂或活性抑制剂存在 治疗效果。
[0125] 在仅有NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白表达的癌及仅有同源性磷酸酶-张力 蛋白表达的癌中，无法通过P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂处理来得到治 疗效果，在NEDD4-1、同源性磷酸酶-张力蛋白及p34同时表达的癌中，可通过p34基因的表 达抑制剂或P34蛋白的活性抑制剂处理来得到抗癌效果。
[0126] 以下，提出用于理解本发明的优选实施例。但是，以下实施例仅用于更加容易理解 本发明，本发明的内容不限定于以下实施例。
[0127] 实施例1.分析在生物体内及试管内的p34及NEDD4-1之间的相互作用及p34对 NEDD4-1蛋白的稳定性所产生的影响
[0128] 1-1.分析内因性p34及NEDD4-1之间的相互作用
[0129] (1)为了识别与NEDD4-1相互作用的蛋白质，从细胞溶解液中利用对NEDD4-1蛋 白的抗体来执行了免疫共沉淀、串联亲和纯化及质量分析。首先，为了执行免疫共沉淀，向 抗-NEDD4-1抗体分别混合293细胞（HEK293细胞）细胞、作为前列腺癌细胞的DU145细胞、 作为乳腺癌细胞的MCF7细胞的溶解液后，在4°C的温度下培养12小时。接着，在上述培养 物加入20 μ 1的蛋白质A/G Plus-Sepharose beads (美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯 生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA))来混合后，追加培养 2 小时。用溶解缓冲液（nonidet P-401ysis buffer)对所获取的免疫沉淀物进行5次清洗， 接着进行20 μ 1的2xSDS样本缓冲液处理并加热。
[0130] 并且，为了执行蛋白印迹法，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE)分离从各细胞分离的蛋白质后，将其移动到膜结构的聚网膜 (PolyScreenmembranes)(美国马萨诸塞州波士顿新英格兰核（New England Nuclear， Boston，MA，USA))，接着利用各种抗体（anti-PETN(美国加利福尼亚州贝佛利山细胞信号 技术有限公司（Cell Signaling，Beverly，CA，USA) )、anti_p34 (美国马萨诸塞州贝弗利恩 佐生命科学公司（Enzo LifeSciences，Beverly，MA，USA))、anti-NEDD4_l 及 g-tubulin (圣 克鲁斯生物科技，Santa Cruz Biotechnology))，并通过现有公知的方法执行了实验。
[0131] 在图1及图2中示出了实验结果。
[0132] 如图1所示，确认在与NEDD4-1相互作用的各种蛋白质中存在p34(用红色箭头表 示）。如图2所示，确认在3个细胞株中，p34在2个癌细胞株（DU145细胞及MCF7细胞） 中表达。得知p34结合于细胞周期蛋白依赖激酶4 (Q)K4，cyclin-dependent kinase 4)及 X连锁凋亡抑制蛋白。
[0133] (2)为了验证上述结果，本发明人在DU145细胞、MCF7细胞及LS1034细胞中，通过 免疫共沉淀及蛋白印迹法来观察内因性P34和NEDD4-1的相互作用。并在图3及图4中示 出了实验结果。
[0134] 如图3及图4所示，确认在DU145细胞、MCF7细胞及LS1034细胞中存在p34-结 合的 NEDD4-1 及 NEDD4-1-结合的 p34。
[0135] (3)为了在其他癌细胞株中确认上述实验结果，本发明人在各种结肠癌及乳腺癌 细胞株（HT-29、HCT-116、LS174T、DLDl、C〇L〇201、LS1034、BT-20、MDA-MB-231、Hs578T 等） 中分析P34及NEDD4-1的表达。在图5中示出了分析结果。
[0136] 如图5所示，在同时表达p34蛋白及NEDD4-1蛋白的LS1034细胞株和MDA-MB231 细胞株中也观察到P34及NEDD4-1的相互作用。
[0137] 1-2.分析外因性p34及NEDD4-1之间的相互作用
[0138] 为了调查因外因性表达的p34和NEDD4-1之间的相互作用，将未通过内因性表达 p34的293细胞转染到表达绿色荧光蛋白标记的p34和/或myc标记的NEDD4-1的构造物。 之后，通过免疫印迹分析293细胞细胞的溶解物。在图6中示出了实验结果。
[0139] 如图6所示，在上述293细胞细胞的myc标记的NEDD4-1免疫沉淀物中检测到绿 色荧光蛋白标记的P34。因此，可确认外因性表达的p34和NEDD4-1之间也发生相互作用。
[0140] 1-3.分析p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白之间的相互作用
[0141] 为了观察p34和NEDD4-1、同源性磷酸酶-张力蛋白之间的相互作用，执行GST抑 制分析。首先，准备500ng的从E. coli BL-21(DE3)株表达并纯化的GST-p34蛋白或GST 蛋白（对照组）后，在反应缓冲液（20mM Tris-HCl pH 7.5,120mM NaCl)中混合其和缺失 NEDD4-1的变异细胞株后，在30°C温度下培养1小时。接着，加入GST抑制缓冲液（20mM Tris-HCl pH8.0,500mM NaCl，l%Triton X-100,0.02%BSA，5mM 巯基乙醇）来停止反应。 之后，在4°C温度下利用谷胱甘肽-琼脂糖抑制GST及有关蛋白1小时。用GST抑制缓冲液 清洗6次蛋白复合体，并加入2xSDS样本缓冲液。分别通过利用抗-GST、抗-T7抗体的免疫 印迹分析存在于免疫沉淀物内的P34及NEDD4-1。在图7及图8中示出了实验结果。
[0142] 如图7所示，确认检测出在免疫沉淀物内结合p34的NEDD4-1蛋白。
[0143] 并且，如图8所示，培养纯化的重组GST-同源性磷酸酶-张力蛋白和Myc-NEDD4_1 来分析P34和同源性磷酸酶-张力蛋白的结合的结果，未检测出结合同源性磷酸酶-张力 蛋白的P34蛋白，由此，确认与NEDD4-1不同p34不结合于同源性磷酸酶-张力蛋白。
[0144] 从而上述实验结果可知p34直接与NEDD4-1相互作用，但不与同源性磷酸酶-张 力蛋白相互作用。
[0145] 1-4.分析与p34相互作用的NEDD4-1范围
[0146] (1)通过实施例1-3,分析与p34相互作用的NEDD4-1蛋白的范围。为此，从表达 NEDD4-1C脱氧核糖核酸的核外遗传基因，利用T7-tagged矢量，制备缺失T7-tagged野生型 (wild-type)NEDD4-l和NEDD4-1的一部分范围的NEDD4-1变异体。纯化的GST-p34蛋白与 表达 T7-tagged 野生型 NEDD4-1 或 NEDD4-1 变异体（缺失（NI) C2, Wffs 及 HECT (homologous to the E6-AP carboxyl terminus)范围、缺失（N2)Wffs 及 HECT 范围、缺失（N3)C2、WW3、 ￥￥4及册(：1'范围、缺失（财)02、￥￥1、￥￥2及册(：1'范围、缺失（阳)02及￥￥8范围）的293细 胞细胞的溶解液一同进行培养。之后，通过GST抑制数组反洗结合p34的NEDD4-1的范围。 在图9中示出了实验结果。
[0147] 如图9所示，GST-p34在NEDD4-1-野生型及NEDD4-1-N3中被检测，其是指p34与 包括NEDD4-1的Wffl及WW2的范围相互作用。
[0148] 根据上述实验结果，要确认有关直接结合于p34的范围是NEDD4-1的Wffl或WW2 范围中的一个。为此，制备了分别只具有WWl或WW2范围的NEDD4-1的2种变异体构造物 (N6、N7)。将纯化的GST-p34蛋白与表达上述NEDD4-1的变异体的细胞的溶解液一同培养 后，执行GST抑制数组。在图9中示出了实验结果。
[0149] 如图9所示，在NEDD4-1的Wffl范围中明确检测出GST-p34,由此，确认p34直接结 合于NEDD4-1的Wffl范围。
[0150] (2)为了验证上述结果，制作了 GST-tagged，并包括缺失Wffl范围的野生型 NEDD4-1的变异体（GST-delffffl)的核外遗传基因。将上述NEDD4-1的变异体蛋白与从表达 His-p34的细胞分离的细胞溶解液一同培养后，执行GST抑制数组。在图10中示出了实验 结果。
[0151] 如图10所示，p34蛋白与野生型NEDD4-1蛋白相互作用，但是，与缺失Wffl范围的 NEDD4-1蛋白不相互作用。由此，确认p34直接结合于NEDD4-1的Wffl范围。
[0152] 1-5.分析p34对同源性磷酸酶-张力蛋白和NEDD4-1的结合的影响
[0153] 为了调查p34对同源性磷酸酶-张力蛋白和NEDD4-1的结合的影响，将GST-同源 性磷酸酶-张力蛋白融合蛋白与表达Myc-NEDD4-1及His-p34的细胞的溶解液一同培养 后，执行GST抑制数组。利用GST蛋白作为对照组。在图11中示出了实验结果。
[0154] 如图11所示，同源性磷酸酶-张力蛋白在存在/未存在p34的情况下与NEDD4-1 相互作用，但是，存在P34时的相互作用强度大于未存在p34时。其暗示p34对NEDD4-1和 PTE结合亲和性产生影响。
[0155] 从上述结果，p34余NEDD4-1的Wffl范围相互作用，但与同源性磷酸酶-张力蛋白 未进行相互作用，并确认不妨碍NEDD4-1和同源性磷酸酶-张力蛋白的相互作用。并且，从 上述结果，课确认通过P34的NEDD4-1蛋白的得到提高的稳定性对同源性磷酸酶-张力蛋