多 数（58/85 ;68· 2% )的NEDD4-l/p34阳性样本表达同源性磷酸酶-张力蛋白。NEDD4-1在 P34阴性样本（45/45 ; 100% )中也表现出高表达。但是，在p34阳性样本中，只在一小部分 (21/45 ;46· 67% )表达同源性磷酸酶-张力蛋白。
[0251] 并且，在191个的结肠癌组织中，177个（61.3%)的样本中p34个检测为阳性，在 74个（38. 7% )的样本中，p34表现出阴性。并且，同源性磷酸酶-张力蛋白的表达在127 个的NEDD4_l/p34两种阳性（double-positive)样本中，只在少数部分（11. 8% )中被检测 到。相反，在未表达P34的149个的NEDD4-1阳性样本中，只在8个的样本中表达同源性磷 酸酶-张力蛋白。
[0252] 如图59及图60所示，在乳腺癌及结肠癌样本中，p34、NEDD4-1及同源性磷酸 酶-张力蛋白的表达水平之间明显存在反比例关心，但是，在结肠癌样本中，P34阴性、 NEDD4-1阳性对同源性磷酸酶-张力蛋白水平未产生影响。
[0253] 因此，从上所述结果可推论人类的乳腺癌及结肠癌中的p34的表达，对NEDD4-1的 原肿瘤性活性依赖于同源性磷酸酶-张力蛋白。
[0254] 图61以图样化的方式示出p34、NEDD4-1及同源性磷酸酶-张力蛋白之间的综合 的相互作用。
[0255] 实施例6. p34活性抑制剂的抗癌活性验证
[0256] 如通过上述实施例1至实施例5确认，执行用于验证p34活性抑制剂是否实具有 实际抗癌活性的实验。首先，筛选上市销售的化合物数据库结合于P34蛋白，并识别抑制 p34的活性的化合物。如以下化学式1表示所识别的化合物，命名为化合物27 (Compound 27)。
[0258] 6-1.验证p34活性抑制剂对同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化产生的影响
[0259] 在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231和大肠癌细胞株的LS 1034中以IuM的浓度 处理24小时p34活性抑制剂的化合物27后，利用同源性磷酸酶-张力蛋白抗体执行了免 疫共沉淀。之后，用泛激素抗体执行蛋白印迹法。在图62中示出实验结果。
[0260] 如图62所示，确认在人类乳腺癌及大肠癌细胞中作为p34活性抑制剂的化合物27 抑制同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化活性。
[0261] 6-2.验证p34活性抑制剂对p34和NEDD4-1蛋白的结合产生的影响
[0262] 以ImM或3mM的浓度对纯化的NEDD4-1蛋白、p34蛋白进行反应缓冲液（20mM Tirs-HCl pH7. 5,120mM NaCl)处理及作为p34活性抑制剂的化合物27处理，并在30°C的 温度下进行1小时反应。之后，使用GST-pull down缓冲液（20mM Tirs-HCl pH8.0,500mM 恥(：1，1%1^行〇1^-100,0.02%834,51111巯基乙醇）停止反应后，在4°(：的温度下用谷胱甘 肽-琼脂糖进行下拉，利用抗-His、抗-GST抗体来执行蛋白印迹法。在图63中示出实验结 果。
[0263] 如图63所示，确认通过进行作为p34活性抑制剂的化合物27的处理，以依赖浓度 的方式抑制P34蛋白和NEDD4-1蛋白的结合。
[0264] 6-3.验证基于诱导作为p34活性抑制剂的同源性磷酸酶-张力蛋白重新活性化的 抗癌效果
[0265] 并且，在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231中按浓度处理作为p34活性抑制剂的化 合物27,48小时后，执行台盼蓝染色及蛋白印迹法，在图64中示出实验结果。
[0266] 如图64所示，确认在乳腺癌细胞中作为p34活性抑制剂的化合物27以依赖浓度 的方式诱导细胞死亡，同源性磷酸酶-张力蛋白重新被活性化，由此，出现蛋白激酶B的脱 磷酸化，caspase3被活性化。由此，通过p34活性抑制剂的处理，抑制了 p34-NEDD4_l的蛋 白质结合，从而使同源性磷酸酶-张力蛋白重新活性化，进而诱导细胞死亡。
[0267] 并且，在人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-231中按浓度进行48小时的作为p34活性 抑制剂的化合物27处理后，回收细胞液来用同源性磷酸酶-张力蛋白抗体实施免疫沉淀。 之后，与包含 water-soluble diC8_phosphatidylinositol3,4, 5tri_phosphate 的反应缓 冲液（IOOmM Tris-HClpH8. 0，10mM DTT)在37°C的温度下反应40分钟后，只回收上层液，并 在常温下与Biomol Green溶液一同进行30分钟的反应，并在OD 650nm中测定同源性磷酸 酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。在图65中示出实验结果。
[0268] 如图65所示，确认在乳腺癌细胞中，通过作为p34活性抑制剂的化合物27的处 理，使同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶的活性增加。
[0269] 利用人类大肠癌细胞株的LS1034执行与上述的实验相同的实验。在表66及67 中示出实验结果。
[0270] 如图66所示，确认在大肠癌细胞中作为依赖p34活性抑制剂的化合物27的浓度 诱导细胞死忙，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白再活性，由此，出现蛋白激酶B的脱磷酸化， caspase3被活性化。
[0271] 并且，如图67所示，确认在大肠癌细胞中通过作为p34活性抑制剂的化合物27的 处理，同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性增加。
[0272] 以下，说明本发明的药学组合物及食品组合的制剂例，但这并不不限制本发明，仅 用于于具体说明本发明。
[0273] 制剂例1.药学制剂的制备
[0274] 1.散剂的制备
[0275] p34表达或活性抑制剂2g
[0276] 乳糖 Ig
[0277] 混合上述成分，填充到气密布来制备散剂。
[0278] 1-2.片剂的制备
[0279] p34的表达或活性抑制剂IOOmg
[0280] 玉米淀粉IOOmg
[0281] 乳糖 IOOmg
[0282] 硬脂酸镁2mg
[0283] 混合上述成分后，根据通常的片剂的制备方法，打锭而制备片剂。
[0284] 1-3.胶囊剂的制备
[0285] p34表达或活性抑制剂IOOmg
[0286] 玉米淀粉IOOmg
[0287] 乳糖 IOOmg
[0288] 硬脂酸镁2mg
[0289] 混合上述成分后，根据通常的胶囊剂的制备方法，填充明胶胶囊来制备胶囊剂。
[0290] 制剂例2.食品制剂的制备
[0291] 2-1.保健食品的制备
[0292] p34表达或活性抑制剂IOOmg
[0293] 适量的维生素混合物
[0294] 维生素 A醋酸纤维70g
[0295] 维生素 E LOmg
[0296] 维生素 BI 0· 13mg
[0297] 维生素 B2 0· 15mg
[0298] 维生素 B6 0· 5mg
[0299] 维生素 B12 0· 2g
[0300] 维生素 ClOmg
[0301] 生物素 IOg
[0302] 尼克酰胺L7mg
[0303] 叶酸 50g
[0304] 泛酸f丐 0· 5mg
[0305] 适量的无机质混合物
[0306] 硫酸亚铁I. 75mg
[0307] 氧化锌 0.82mg
[0308] 碳酸镁 25. 3mg
[0309] 磷酸二氢钾15mg
[0310] 磷酸钙 55mg
[0311] 柠檬酸钾90mg
[0312] 碳酸钙 IOOmg
[0313] 氯化镁 24. 8mg
[0314] 上述的维生素及矿物质混合物的组成比由以优选地实施例混合组成比较适合保 健食品的成分，但变形其混合比也无妨，根据通常的保健食品制备方法混合上述成分后，制 备颗粒并根据通的方法可适用于保健食品组合物的制备。
【主权项】
1. 一种用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于，包含P34基因的表达抑制剂或 P34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。2. 根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于，上述表达抑 制剂为选自由互补结合于P34基因的信使核糖核酸的反义核苷酸、短发夹核糖核酸、小干 扰核糖核酸及核酶组成的组中的一种以上。3. 根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于，上述活性抑 制剂为选自由特异结合于P34蛋白的化合物、肽、肽模拟物、底物类似物、核酸适体及抗体 组成的组中的一种以上。4. 根据权利要求3所述的用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于，上述特异结 合于P34蛋白的化合物为由以下化学式1表示的化合物或其的药学上能够允许的盐，5. 根据权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于， 上述癌为选自由口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、 颈癌、子宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、 外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、 肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴 瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、一次中枢神经系统淋巴瘤、脊髓 肿瘤、脑干胶质瘤及脑垂体腺瘤中的一种以上。6. 根据权利要求1至4中任一项所述的用于预防或治疗癌的药学组合物，其特征在于， 上述癌为同时表达p34及NEDD4-1的癌。7. -种用于预防或改善癌的食品组合物，其特征在于，包含p34基因的表达抑制剂或 P34蛋白的活性抑制剂作为有效成分。8. -种用于抑制癌转移的药学组合物，其特征在于，包含p34基因的表达抑制剂或p34 蛋白的活性抑制剂作为有效成分。9. 一种治疗癌或抑制癌转移的方法，其特征在于，包括：将p34基因的表达抑制剂或 P34蛋白的活性抑制剂给药到个体的步骤。10. -种用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，其特征在于， 包括： 步骤1)，向P34蛋白表达细胞株处理被检查物质； 步骤2)，在上述细胞株中测定p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度；以及 步骤3)，选择上述p34基因的表达水平或p34蛋白的活性程度与未处理被检查物质的 对照组相比减少的被检查物质。11. 根据权利要求10所述的用于治疗癌或抑制癌转移的候选物质的筛选方法，其特征 在于，在上述步骤2)中，基因的表达水平通过选自由逆转录聚合酶链式反应、印迹杂交、c 脱氧核糖核酸微阵列混合反应及原位混合反应组成的组中的一种以上的方法来测定。12. 根据权利要求10所述的用于治疗癌或转移抑制的候选物质的筛选方法，其特征在 于，在上述步骤2)中，蛋白的活性程度通过选自由免疫共沉淀、放射免疫分析、酶联免疫吸 附测定、免疫组织化学、蛋白印迹法及流式细胞分析组成的组中的一种以上的方法来测定。13. -种p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治疗效果的预测方法， 其特征在于， 包括： 步骤1)，向生物学试料处理NEDD4-1的表达抑制剂或活性抑制剂；以及 步骤2)，在上述生物学试料中测定癌细胞是否增殖。14. 根据权利要求13所述的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的 治疗效果的预测方法，其特征在于，上述步骤1)中的生物学试料为选自由患癌的个体的血 液、尿液、唾液及组织组成的组中的一种以上。15. 根据权利要求13所述的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌的治 疗效果的预测方法，其特征在于，上述P34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂对癌 的治疗效果的预测方法包括步骤3)，预测若生物学试料中的癌细胞增殖，则p34的表达抑 制剂或活性抑制剂对癌无治疗效果，若生物学试料中的癌细胞未增殖，则P34的表达抑制 剂或活性抑制剂存在治疗效果。
【专利摘要】本发明涉及包含p34的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于治疗癌或抑制癌转移的组合物。根据本发明，在抑制(knock-down)p34蛋白方面，在通过引起同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的单泛素化来促进同源性磷酸酶-张力蛋白的核定位(nuclear？localization)的结果，抑制与肿瘤的生存、增殖、侵入性及转移性相关的蛋白激酶B(Akt)通路，从而具有使同时表达同源性磷酸酶-张力蛋白及NEDD4-1的各种癌细胞的肿瘤发生率及集落形成能力明显减少的效果。因此，本发明的p34基因的表达抑制剂或p34蛋白的活性抑制剂可有效用作癌的治疗剂或癌转移抑制剂。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00, C12N15/113
【公开号】CN105283206
【申请号】CN201480029088
【发明人】金太源, 陈东勳, 弘承祐, 文哉喜, 申在植, 金珍善, 郑景娥, 李政慎, 崔恩卿, 李在链, 洪镕祥, 金圭杓, 南基烨, 金峰徹
【申请人】财团法人峨山社会福祉财团, 蔚山大学校产学协力团
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年3月27日
【公告号】EP2979708A1, US20160040168, WO2014157965A1