白的多聚泛素化产生影响。
[0156] 1-6.分析p34对NEDD4-1的细胞内自泛素化的影响
[0157] (1)由于以前也报告NEDD4-1在细胞内自泛素化（auto-ubiquitination)，分析 p34对NEDD4-1的自泛素化的影响。将293细胞细胞转染为NEDD4-1和/或p34后，上述 细胞中处理MG132 (25mM)并培养6小时。获取细胞培养物，并分析了其的抗-Myc免疫沉淀 物。在表12中不出了实验结果。
[0158] 如图12所示，用MG132处理的细胞中，NEDD4-1的自泛素化根据p34的存在显著 减少。
[0159] (2)为了验证上述结果，在利用纯化的蛋白的细胞-消象差系统中分析了 NEDD4-1 的泛素化。首先，使用His-tagged矢量，从表达p34c脱氧核糖核酸的核外遗传基因制备 His标记的p34。将纯化的GST-NEDD4-1蛋白与表达EU UbcH5c及上述His标记的p34的 293细胞细胞提取物一同培养后，测定自泛素化。在图13中示出了实验结果。
[0160] 如图3所示，GST-NEDD4-1泛素化随p34的表达逐渐减少。由此，确认p34在完整 的细胞及细胞-消象差系统中，均抑制NEDD4-1的自泛素化。
[0161] (3)分别利用表达p34的核外遗传基因转染24小时293细胞及MCF7细胞，用p34 的脱氧核糖核酸转染48小时。按时间在上述细胞中处理CHX (cycloheximide，50mg/ml)，为 了确认NEDD4-1蛋白，执行蛋白印迹法。在图14及图15中示出了实验结果。
[0162] 如图14所示，在同时转染为绿色荧光蛋白标记的p34和myc标记的NEDD4-1的细 胞中的NEDD4-1蛋白水平，比只用myc标记的NEDD4-1处理的细胞中维持高的状态。
[0163] 并且，图15所示，使用对于p34的脱氧核糖核酸来抑制p34抑制的细胞中的 NEDD4-1蛋白水平与由混合脱氧核糖核酸处理的细胞，相当减少，由此，确认p34稳定化 NEDD4-1 蛋白。
[0164] 这种结果暗示p34通过NEDD4-1的自泛素化来稳定化NEDD4-1蛋白。
[0165] 实施例2.分析p34对调控通过NEDD4-1而介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的多 聚泛素化产生的影响
[0166] (1)使用p34的脱氧核糖核酸来分析因抑制表达p34的沉默效果（p34-脱氧 核糖核酸:5' -GCAAGG ⑶CUGAAGCGGAA-3, II :5' -GGAAACGGGAGGAGGAGGA-3'，III : 5'-CCGAAUUGGACUACCUCAU-3'）。MDA-MB-231 及 MCF7 细胞转染为 p34-脱氧核糖核酸后，通 过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图16中示出了实验结果。
[0167] 如图16所示，确认p34-脱氧核糖核酸以浓度依赖的诱导同源性磷酸酶-张力蛋 白的表达增加及P-蛋白激酶B的表达减少。
[0168] 并且，将293细胞及小鼠胚胎成纤维细胞细胞转染为绿色荧光蛋白标记的p34后， 通过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图17中示出了实验结果。
[0169] 如图17所示，绿色荧光蛋白标记的p34的表达在未表达内因性p34的293细胞或 小鼠胚胎成纤维细胞细胞中减少同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平。并且，蛋白激酶B 的磷酸化水平随P34表达水平增加，与同源性磷酸酶-张力蛋白的表达水平反比。
[0170] 由此，确认通过p34与NEDD4-1结合，对同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平产生影 响。
[0171] (2)根据上述实验结果，本发明人将MCF7细胞转染为p34_siRN后，用蛋白合成抑 制剂亚胺环己酮进行处理，并根据时间测定以内因性表达的P34蛋白水平的变化，从而调 控同源性磷酸酶-张力蛋白的展业员补充率，来调查P34的作用。在图18中示出了实验结 果。
[0172] 如图18所示，利用P34-脱氧核糖核酸抑制以内因性表达P34的MCF7细胞的P34 的情况下，实际同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平没有变化，但是，在用对照组脱氧核糖 核酸（混合脱氧核糖核酸）转染的细胞的情况下，同源性磷酸酶-张力蛋白的表达减少。这 种结果是指P34减少同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白稳定性，良性调控PI3K信号通路。
[0173] (3)为了确认p34是否通过蛋白分解通路来调控同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的 稳定性，将未以内因性表达P34的293细胞细胞转染为绿色荧光蛋白标记的p34,接着，处理 蛋白酶体抑制剂的MG132。通过蛋白印迹法分析各蛋白的表达水平。在图19中示出了实验 结果。
[0174] 如图19所示，用外因性表达p34,并用MG132进行处理的细胞的同源性磷酸酶-张 力蛋白蛋白水平，与用对照组矢量转染的细胞相比，相当减少了。
[0175] (4)为了确认p34是否对同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化产生影响，执行泛 素化分析（intracellular ubiquitination assay) 〇
[0176] 首先，在293细胞或小鼠胚胎成纤维细胞细胞中转染绿色荧光蛋白_p34后，与 MG132-同进行培养，并分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图20中示出了实验结 果。
[0177] 如图20所示，离巢性表达p34后，在处理MG132的293细胞细胞或小鼠胚胎成纤 维细胞细胞中检测出多聚泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白。
[0178] 并且，在MCF7、MDA-MB-231及DU145细胞细胞中转染p34-脱氧核糖核酸24小时 后，与MG132-同进行培养，并分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图21中示出了 实验结果。
[0179] 如图21所示，在抑制p34的MCF7、MDA-MB231及DU145细胞细胞中逐渐减少同源 性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。
[0180] 并且，用野生型同源性磷酸酶-张力蛋白和/或p34转染293细胞细胞24 小时后，测定同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。更具体地，用包含50mM HEPES (ρΗ7· 5)、150mM NaClUmM EDTAUO % glycerol 及蛋白酶抑制剂的 1 % Triton X-IOO缓冲液溶解上述细胞后，利用抗-同源性磷酸酶-张力蛋白抗体免疫沉淀同源性 磷酸酶-张力蛋白。清洗上述免疫沉淀物后，与IOOmM Tris-HCl (ρΗ8·0)的水溶性的 diC8_phosphatidylinositol3,4, 5-trisphosphate 及 IOmM DTT - 同在 37°C温度下进行 40 分钟培养。之后，回收上层液，在常温下与Biomol Green Reagent(Enzo Life Sciences) 一同培养30分钟。同源性磷酸酶-张力蛋白的活性由通过测定650nm的OD值的方法来计 算磷酸盐的排放。作为阴性对照组使用第123个氨基酸的半胱氨酸（Cystein)变异为丝氨 酸（Serine)的脂质磷酸分解酶-缺乏同源性磷酸酶-张力蛋白C124S细胞株。在图22中 示出了实验结果。
[0181] 如图22所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的脂质磷酸分解酶活性在与对照组相比， 离巢性表达P34的细胞中，明显减少。
[0182] 这种结果意味着p34是指同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化及蛋白体性分解 介质。
[0183] (5)最近，同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化及蛋白体性分解通过NEDD4-1调控一 部分，并NEDD4-1作用为E3泛素连接酶（Wang et al.，2007)。在上述实施例1中，本发明 人发现P34直接与NEDD4-1相互作用，从而调查NEDD4-1对同源性磷酸酶-张力蛋白的泛 素化及蛋白体性分解产生的影响是否依存P34表达水平。
[0184] 首先，表达内因性NEDD4-1，且p34将未表达的293细胞细胞或小鼠胚胎成纤维 细胞细胞与绿色荧光蛋白标记的P34核外遗传基因（或绿色荧光蛋白对照组矢量）及 NEDD4-1-脱氧核糖核酸/sh核糖核酸（或混合脱氧核糖核酸）共转染（NEDD4-1-脱氧核 糖核酸：5 ' -TGGCGATTTGTAAACCGAA-3 '）。通过蛋白印迹法来分析各蛋白的表达水平。在图 23中不出了实验结果。
[0185] 如图23所示，在共转染NEDD4-1-脱氧核糖核酸/sh核糖核酸及绿色荧光蛋白标 记的P34的细胞中，实际同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平基本没改变，但是，在只转染 绿色荧光蛋白标记的P34的细胞中同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白的水平明显减少。一贯， 蛋白激酶B的磷酸化与同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平反比。
[0186] (6)在依存作为蛋白合成抑制剂的亚胺环己酮下，调查同源性磷酸酶-张力蛋白 的展业员补充率是否受P34的离巢性表达及NEDD4-1抑制的影响。为此，将293细胞细胞 转染为P34表达核外遗传基因及NEDD4-1脱氧核糖核酸后，分析同源性磷酸酶-张力蛋白 蛋白的半衰减期。在图24中示出了实验结果。
[0187] 如图24所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的水平在NEDD4-1-抑制293细胞细胞中 因外因性P34的表达而减少，处理CHX后，逐渐增加，由此，确认p34以NEDD4-1依赖的介质 同源性磷酸酶-张力蛋白的蛋白体性分解。
[0188] (7)为了确认p34是否在NEDD4-1中依赖的介质同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚 泛素化，用P34表达核外遗传基因转染野生型（293细胞细胞或小鼠胚胎成纤维细胞）及 NEDD4-1 抑制细胞后，处理 MG132,并执行 Intact-cell ubiquitination assay，在图 25 中 示出了实验结果。
[0189] 如图25所示，多聚泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白明显在用p34表达核外遗传 基因转染的野生型细胞中检测，但未在用P34表达核外遗传基因转染的NEDD4-1抑制细胞 中检测。
[0190] 并且，分析上述293细胞细胞的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性。在 图26中示出了实验结果。
[0191] 如图26所示，当抑制将p34表达为离巢性额293细胞细胞的NEDD4-1时，维持同 源性磷酸酶-张力蛋白的脂质磷酸分解酶活性，在用杂乱脱氧核糖核酸处理上述细胞的情 况下，没有这种活性。
[0192] 这种结果表示NEDD4-1在p34中依赖的诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素 化。
[0193] (8)最近，报告X连锁凋亡抑制蛋白诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化 (Van Themsche et al.，2009)。为了评价p34是否对通过X连锁凋亡抑制蛋白诱导的同 源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化产生影响，在X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤 维细胞细胞中执行多聚泛素化实验。从Dr. Duckett (University of Michigan Medical School)提供X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞。在图27至图29中示 出了实验结果。
[0194] 如图27所示，通过蛋白印迹法确认，在X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤 维细胞细胞中无 X连锁凋亡抑制蛋白的表达。
[0195] 并且，如图28所示，确认在将X连锁凋亡抑制蛋白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细 胞转染为绿色荧光蛋白标记的P34的情况下，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白水平明显下降。
[0196] 并且，如图29所示，确认用绿色荧光蛋白标记的p34转染的X连锁凋亡抑制蛋 白-抑制小鼠胚胎成纤维细胞细胞中同源性磷酸酶-张力蛋白强烈多聚泛素化。
[0197] 从上述结果确认，p34在X连锁凋亡抑制蛋白中独立的通过NEDD4-1调控同源性 磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。
[0198] 实施例3.分析通过p34的调控NEDD4-1的同源性磷酸酶-张力蛋白的单多聚泛 素化及多聚泛素化
[0199] (1)最近，NEDD4-1不仅介质同源性磷酸酶-张力蛋白的试管内及细胞内的多聚泛 素化，而且介质单泛素化，同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化介质通过同源性磷酸酶-张 力蛋白的核膜孔的核移动（nuclear import) (Wang et al.，2007)，如上述实施例2表示，确 认P34通过NEDD4-1调控同源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化。根据上述结果，本发明人 分析P34对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化产生的影响。
[0200] 首先，通过内因性将表达p34及NEDD4-1的4个癌细胞株（MCF7，MDA-MB231，DU145 细胞及LS 1034)转染为p34_脱氧核糖核酸，通过Intact-cell ubiquitination assay来 调控同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化状态。在图30中示出了实验结果。
[0201] 如图30所示，p34的抑制在所有癌细胞株中增加同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛 素化。
[0202] 并且，用p34-脱氧核糖核酸转染24小时MCF7细胞后，区划核和胞液。利用蛋白 印迹法分析同源性磷酸酶-张力蛋白的表达。在图31中示出了实验结果。
[0203] 如图31所示，同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白在p34-抑制MCF7细胞的核分解物中 强烈检测，但是在用杂乱脱氧核糖核酸处理的细胞中，基本不出现同源性磷酸酶-张力蛋 白的核定位。而且，单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白只在P34-抑制MCF7细胞的核分解 物中检测。其是指P