34的表达对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化及核定位产生影响。
[0204] (2)为了调查NEDD4-1根据p34的表达，是否对同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素 化产生影响，用NEDD4-1-脱氧核糖核酸、p34-脱氧核糖核酸、和/或绿色荧光蛋白tagged p34转染24小时MCF7细胞后，分析同源性磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图32中示出了 实验结果。
[0205] 如图32所示，在p34-抑制细胞中观察单泛素化的同源性磷酸酶-张力蛋白，但未 在用NEDD4-1-脱氧核糖核酸及p34-脱氧核糖核酸共转染的细胞中观察到。
[0206] (3)为了验证其，本发明人在存在El及E2酶的条件下，将纯化的GST-同源性磷酸 酶-张力蛋白蛋白与从表达Flag标记的NEDD4-1的293细胞细胞中分离的蛋白提取物和/ 或His标记的p34 -同进行培养。之后，执行GST-同源性磷酸酶-张力蛋白的Cell-free ubiquitination assay。在图33及图34中不出了实验结果。
[0207] 如图33所示，同源性磷酸酶-张力蛋白在只存在NEDD4-1的情况下，单泛素化，但 是，均存在NEDD4-1及p34的情况下强烈多聚泛素化。
[0208] 并且，如图34所示，同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化因 p34依赖渐渐减少， 其是指通过NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单聚泛素化及多聚泛素化依赖于 P34的表达。
[0209] (4)为了调查p34在NEDD4-1-介质同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化过程中是否执 行E2-类似酶作用。在存在或不存在El及E2的条件下，将GST-同源性磷酸酶-张力蛋白 与p34及NEDD4-1 -同进行培养后，通过Cell-free ubiquitination assay来分析同源性 磷酸酶-张力蛋白的泛素化。在图35中示出了实验结果。
[0210] 如图35所示，纯化的GST-同源性磷酸酶-张力蛋白在表达Flag标记的NEDD4-1 及His标记的p34的293细胞细胞的提取物中，存在E2酶的条件下泛素化，但在无 E2酶的 情况系未泛素化。由此，确认P34不执行E2-类似酶的作用。因此，从上述结果可知，p34调 控由NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单聚泛素化及多聚泛素化。
[0211] 实施例4.分析p34和癌细胞增殖关系
[0212] 通过上述实施例1至实施例3的实验，p34抑制NEDD4-1的自泛素化，从而确认良 性调控NEDD4-1蛋白的稳定性，p34的抑制减少同源性磷酸酶-张力蛋白多聚泛素化，并通 过NEDD4-1介质的同源性磷酸酶-张力蛋白的单泛素化增加同源性磷酸酶-张力蛋白蛋白 水平。
[0213] (1)为了确认p34是否在NEDD4-1/同源性磷酸酶-张力蛋白通路中执行强烈的原 肿瘤基因的作用，记性表达P34-脱氧核糖核酸的MCF7及LS1034细胞的增殖检查，从而执 行集落形成数组（Colony-forming assay)及软琼脂数组。
[0214] 为了执行集落性数组，每一个6孔板，以300个的浓度插入细胞后，测定克隆能力。 克隆后，经过10至14天后，固定细胞并0. 01 %结晶紫溶液染色。
[0215] 由以下方法执行软琼脂数组。利用包含10% FBS的2X DMEM或X RPMI-1640培养 基制备1. 6%琼脂糖后，在6孔板中添加其来准备软琼脂板。其中插入包含0. 7%琼脂糖及 10% FBS的2X DMEM或赋予于2X RPMI-1640培养基的细胞（I X 104)。将其在37°C温度的 培养箱中培养2~3周后，用显微镜计算集落。
[0216] 在图36至图38中示出实验结果。
[0217] 如图36所示，表达p34-脱氧核糖核酸的MCF7及LS1034细胞的生长与表达杂乱 脱氧核糖核酸的细胞显著减少。
[0218] 并且，如图37及图38所示，用p34-脱氧核糖核酸处理的细胞的集落形成频率与 对照组相比显著减少（图37)、集落的大小也减少（图38)。
[0219] (2)通过RT-qPCR分析确认作为同源性磷酸酶-张力蛋白的目标基因的周期素 E2和cdc6基因的表达水平，将细胞转染为p34-脱氧核糖核酸或杂乱脱氧核糖核酸后，利 用TRIzol(Invitrogen)从上述细胞中分离总核糖核酸，利用RT预混（Bioneer，Daejeon， Korea)及益生元dT16-18引物来制备互补脱氧核糖核酸（c脱氧核糖核酸）链，之后，利用 下列表1的引物集，对p34、cdc6、周期素 E2基因执行RT-qPCR。在表39中示出了实验结 果。
[0223] 如图29所示，在p34_抑制细胞中作为同源性磷酸酶-张力蛋白的目标基因的周 期素 E2及cdc6基因的表达水平减少。由此，确认p34的抑制降低周期素 E2及cdc6基因， 从而抑制癌细胞的生长。
[0224] (3)为了调查p34抑制对癌细胞增殖的效果，本发明人确立稳定的表达环周期 素-诱导性p34-sh核糖核酸矢量的DU145细胞及MDA-MB231细胞株的细胞株。首先，将作 为TetR-表达核外遗传基因的pc脱氧核糖核酸6. 0/TR (Invitrogen)转染到DU145细胞及 MDA-MB231细胞后，用杀稻瘟菌素 （blasticidin 10μg/ml)选择3周。表达TetR的克隆细 胞利用抗-TetR抗体通过免疫印迹分析来确认。表达2个TetR的克隆，为了进行第二次选 择，用Hl-p34-sh核糖核酸矢量（5' -CCCTCTTTGACCTCTCAGT-3'）从新转染后，用博莱霉素 (zeocin 300 μg/ml)选择3周来确立四环周期素-诱导性（Tet-on inducible)p34细胞 株。将其露出在四环周期素后，选择表达TetR的DU145细胞或MDA-MB231细胞株的克隆。 在上述细胞株中处理四环周期素后，利用蛋白印迹法分析各蛋白的表达。并且，执行上述细 胞株的同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性及集落行车数组。在图40至图43中 示出了实验结果。
[0225] 如图40所示，在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中确认TetR的表达，如图41所 示，在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中处理四环周期素（Tet;lmg/ml)的情况下，确认抑 制P34的表达，增加同源性磷酸酶-张力蛋白表达。磷酸化蛋白激酶B与同源性磷酸酶-张 力蛋白水平反比。
[0226] 并且，如图42所示，确认在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中，因用四环周期素进 行处理，从而同源性磷酸酶-张力蛋白脂质磷酸分解酶活性增加。
[0227] 并且，如图43所示，确认在DU145细胞或MDA-MB231细胞株中，因用四环周期素处 理，从而显著减少集落形成。
[0228] 追加性地，观察上述DU145细胞或MDA-MB231细胞株的细胞生长及执行BrdU数 组。在图44及图45中示出了实验结果。
[0229] 如图44所示，用四环周期素处理的细胞与未使用周期素处理的细胞相比，生长显 著减少。
[0230] 并且，如图45所示，用四环周期素进行处理的细胞的BrdU的混性显著减少。
[0231] (4)为了制备p34稳定的过表达的细胞，未检测出p34的Hs578T细胞转染为作为 逆转录聚合酶链式反应病毒载体矢量的pBabe-puro (对照组）或pBabe-pur〇-p34,接着，用 噪呤霉素 （puromycin 2ug/ml)选择2周。通过利用抗-p34抗体的蛋白印迹法来确认p34 的表达。为了分析通过上述方法制备的细胞地蛋白，执行蛋白印迹法，并观察集落形成。在 图46中示出了实验结果。
[0232] 如图46所示，与表达对照组矢量的细胞相比稳定表达p34的Hs578T细胞中同源 性磷酸酶-张力蛋白的表达减少，集落形成显著上升。
[0233] 从这种结果确认p34通过同源性磷酸酶-张力蛋白抑制癌细胞增殖。
[0234] 实施仿1| 5. d34的月中瘤自发f生（tumorigenicity)弓黾ih
[0235] (1)为了确认p34的表达是否对NEDD4-1的原肿瘤性产生影响，可通过在上述实施 例4-(3)中确立的四环周期素来诱导，利用稳定的表达p34sh核糖核酸，从而枯耗p34的表 达的DU145细胞细胞株及MDA-MB-231细胞株来执行以下实验。将确立的各细胞皮下注入 于Balb/c裸鼠中，形成异种移植物（xenograft)肿瘤。在2周内，每3天观察一次肿瘤的 大小，当肿瘤的大小达到180mm3时，作为0天，以10mg/kg的浓度注射四环周期素（对照组 用vehicle进行水注射），继续观察肿瘤的大小。所有动物实验牙山医疗中心附属动物管理 及与利用有关的委员会认可的协议记性。在图47至图52中示出了实验结果。
[0236] 如图47及图48所示，注入转染p34_sh核糖核酸的DU145细胞细胞株或转染 p34-sh核糖核酸的MDA-MB-231细胞株，在注射四环周期素的组中同源性磷酸酶-张力蛋白 的表达增加，NEDD4-1的表达减少。
[0237] 并且，如图49及图50所示，通过注入转染p34_sh核糖核酸的DU145细胞细胞株 或转染p34-sh核糖核酸的MDA-MB-231细胞株来诱导的肿瘤的生长与注射四环周期素的对 照组相比显著减少。
[0238] 并且，如图51及图52所示，分析各小鼠肿瘤组织的免疫组织化学的结果，确认同 源性磷酸酶-张力蛋白蛋白在注射四环周期素注射后，表示强的核定位。、
[0239] 由这种结果确认p34强化NEDD4-1的原肿瘤活性
[0240] (2)为了验证p34对NEDD4-1的原肿瘤性或活性产生的影响，本发明人使用未 表达内因性P34的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞（p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞）细胞 (Millipore，Billerica，MA，USA)。NEDD4-1单独不具有原肿瘤性，但增进NEDD4-1的过表 达通过Ras介质的p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞的变形（Wang et al.，2007)。给予 上述研究结果，本发明人最初调查p34的表达对通过Ras介质的p53-null小鼠胚胎成纤维 细胞细胞的变形产生的影响。执行P53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞的蛋白表达及集落形 成分析。在图53及图54中示出了实验结果。
[0241 ] 如图53所示，在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞中分析蛋白表达的结果，p34的 表达引发同源性磷酸酶-张力蛋白表达的减少及NEDD4-1表达的增加。
[0242] 并且，如图54所示，在p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞中执行集落形成分析的 结果，P34的表达与表达Ras的p53-/-/小鼠胚胎成纤维细胞细胞相比，细胞集落数增加。
[0243] (3)在利用基于逆转录聚合酶链式反应酶病毒的sh核糖核酸矢量制备的NEDD4-1 抑制-p53-null (p53-/_)小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，观察p34的原肿瘤性活性。分析 NEDD4-1抑制-p53-null(p53-/_)小鼠胚胎成纤维细胞细胞的蛋白表达、集落形成及泛素 化。在图55及图57中示出了实验结果。
[0244] 如图55所示，在NEDD4-1抑制-p53-/_小鼠胚胎成纤维细胞细胞中p34的表达部 引发同源性磷酸酶-张力蛋白的减少。
[0245] 并且，如图56所示，集落形成数组结果，确认在NEDD4-1抑制-p53-/-小鼠胚胎成 纤维细胞细胞中即使进行P34的表达也不可抑制细胞形成。
[0246] 并且，如图57所示，泛素化数组结果，p34的表达在表达对照组sh核糖核酸的 p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞中诱导同源性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化，但在表 达NEDD4-lsh核糖核酸的NEDD4-1抑制-p53-/_小鼠胚胎成纤维细胞细胞中不引发同源 性磷酸酶-张力蛋白的多聚泛素化。其是指p34依赖的在NEDD4-1中提高通过Ras介质的 p53-null小鼠胚胎成纤维细胞细胞的变形
[0247] (4)为了确认对p34的NEDD4-1的原肿瘤性活性产生影响的效果是否依赖同源性 磷酸酶-张力蛋白，利用表达同源性磷酸酶-张力蛋白sh核糖核酸的p53-null小鼠胚胎 成纤维细胞细胞执行蛋白印迹法及集落形成分析。在图58中示出了实验结果。
[0248] 如图58所示，在上述小鼠胚胎成纤维细胞细胞中，p34的表达无法提高Ras的变 形活性。这是指P34依赖同源性磷酸酶-张力蛋白来提高NEDD4-1的原肿瘤性活性。
[0249] (5)在人类的癌组织中，调差p34、NEDD4-1、和/或同源性磷酸酶-张力蛋白的临 床相关性。作为良性调控通过NEDD4-1的同源性磷酸酶-张力蛋白泛素化，当考虑p34的功 能时，在人类的癌组织中P34的表达有可能对因 NEDD4-1而诱导的同源性磷酸酶-张力蛋 白蛋白水平的减少产生影响。为了验证其，本发明人通过将135个分离的乳腺癌及19个的 结肠癌的石錯加填充剂样本组织微阵列（TMA，Tissue microarrays)来评价p34、NEDD4-1 及同源性磷酸酶-张力蛋白的表达。
[0250] 在135个的乳腺癌样本中，90个（66. 7%)为p34-阳性，45个（33. 3%)为p34-阴 性。并且，在90个p34阳性样本中的85个（94. 45)样本中检测到NEDD4-1的表达，大