-连接、1，6-连接的半乳糖等，此外还含有少量末端连接的鼠李糖，其中以1，3, 4-连接 的甘露糖，1，4-连接的葡萄糖和1，4-连接的半乳糖为主。
[0057] 实施例3制备多糖衍生物
[0058] (1)硫酸化衍生物的制备：浓硫酸7. 5mL、正丁醇2. 5mL，置于装有冷凝管和搅拌装 置的三颈烧瓶中，再加入15mg的硫酸铵，搅拌，冰水浴冷却至(TC;缓慢加入50mg多糖粉末， 于〇°C条件反应30min。反应液经10% NaOH中和，离心取上清液，蒸馏水透析48h，减压浓 缩至小体积，加入4倍体积95%乙醇，静置过夜，离心，收集沉淀物，冷冻干燥后得到硫酸化 衍生物；
[0059] (2)羟乙基化产物的制备：取多糖粉末50mg，加入0· 5mol/L氢氧化钠溶液lmL，室 温搅拌溶解，多糖浓度为50mg/mL。溶液先用冰浴冷却至0°C，加入3mL的30% NaOH溶液， 再用冰盐浴进一步冷却至-15°C~-KTC，然后加 IOmL的环氧乙烷，继续于同样温度搅拌反 应2h，接着混合物于4°C冰箱中放置过夜。次日，混合物用lmol/L HCl中和，使溶液的pH 值为近中性，蒸馏水透析3天，减压浓缩，冷冻干燥得羟乙基化衍生物；
[0060] (3)羧甲基化产物的制备：取多糖20mg悬浮于ImL异丙醇中，室温搅拌15min分 散均匀后，在5min内缓慢滴加0.1 mL 30% NaOH溶液，剧烈搅拌lh，接着调节混合体系至适 70°C，加入48mg氯乙酸后，于控制的温度下继续搅拌反应3h。反应完毕，加入适量蒸馏水稀 释，用lmol/L冰醋酸调节混合液的PH值至7~8,蒸馏水透析3天，减压浓缩，冷冻干燥得 羧甲基化衍生物；
[0061] (4)红外光谱测定：取多糖衍生物样品各lmg，分别用溴化钾压片进行IR检测。结 果（附图3~5)可见，硫酸化产物的IR光谱与原多糖相比，不仅位于3400cm 1左右的O-H 键的伸缩振动峰变窄缩小，同时在818cm 1和1232cm 1出现了分别归属为C-S-O和S = 0键 的拉伸振动特征吸收，表明多糖中有硫酸基，已被部分硫酸化；羟乙基化产物IR光谱与原 多糖相比，位于3200~3600cm 1区域的O-H键的伸缩振动峰显著增强变宽，同时近2900cm 1 处的C-H伸缩振动峰也大大增强，表明羟乙基已经取代在糖环的部分羟基上；羧甲基化衍 生物IR图谱中显示了一个位于1736cm 1处羧基的特征吸收，表明羧甲基已经部分取代在糖 环上。
[0062] 实施例4经典途径补体抑制试验
[0063] 取健康成年男性志愿者血清，以VBS2+缓冲液（巴比妥缓冲液，pH = 7. 4,含0. 5mM Mg2+和0. 15mM Ca2+)稀释为1:10,作为经典途径的补体来源，将兔抗羊红细胞的抗体以 VBS2+缓冲液稀释为1:1000作为溶血素；保存于Alsever液中的羊红细胞（SRBC)配置成 2 % SRBC ;精密称量多糖或其衍生物约2mg，加入VBS2+缓冲液溶解，稀释成8个浓度，不同浓 度的多糖或其衍生物溶液100 μ L与1:10的补体100 μ L在37°C预孵育IOmin后，依次加入 200 μ LVBS2+缓冲液、100 μ L 溶血素（1:1000)和 100 μ L 2% SRBC，在 37°C水浴 30min 后放 入低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min，分别取每管上清200 μ L于96孔板， 在405nm测定吸光度，实验同时设置多糖或其衍生物对照组（100 μ L相应浓度的多糖或其 衍生物溶液加500 μ L VBS2+缓冲液）、补体对照组（以100 μ L VBS 2+缓冲液代替多糖或其 衍生物溶液）和全溶血组（100 μ L 2% SRBC溶于500 μ L三蒸水中），将各浓度的多糖或其 衍生物组吸光度值扣除相应多糖或其衍生物对照组吸光度值后计算溶血抑制率，以多糖或 其衍生物浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合直线计算50 %抑制溶 血所需供试品的浓度（〇15。值），以肝素作为阳性对照药，结果显示三个均一多糖及其衍生 物对于补体经典途径激活都有显著的抑制活性（如表1所示）。
[0064] 实施例5旁路途径补体抑制试验
[0065] 取健康成年男性志愿者血清，以VBS-Mg-EGTA缓冲液（巴比妥缓冲液，pH = 7. 4， 含5mM Mg2+和8mM EGTA)稀释为1:10,作为旁路途径的补体来源，保存于3. 8%枸橼酸 钠溶液的兔红细胞以VBS-Mg-EGTA缓冲液配置成2%兔红细胞，精密称量多糖或其衍生 物约2mg，加入VBS-Mg-EGTA缓冲液，稀释成8个浓度，不同浓度的多糖或其衍生物溶液 150 yL与1:10的补体150 yL在37Γ预卵季育IOmin后，加人200 yL 2%兔红细胞，在37Γ 水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min。分别取每管上清 200 μ L于96孔板，在405nm测定吸光度，实验同时设置多糖或其衍生物对照组（150 μ L相 应浓度的多糖或其衍生物溶液加350 μ L VBS-Mg-EGTA缓冲液）、补体对照组（以150 μ L VBS-Mg-EGTA缓冲液代替多糖或其衍生物溶液）和全溶血组（200 μ L 2%兔红细胞溶于 300 μ L三蒸水中），将各浓度的多糖或其衍生物组吸光度值扣除相应多糖或其衍生物对照 组吸光度值后计算溶血抑制率，以多糖或其衍生物浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y 轴作图，得到的拟合直线计算50%抑制溶血所需供试品的浓度撕5。值）。以肝素作为阳性 对照药，结果显示多糖及其衍生物可明显抑制补体旁路途径激活所导致的细胞溶血（如表 1所示）。
[0066] 表1三种鱼腥草多糖及其衍生物对补体激活的抑制作用
[0069] CH5。和AP 5。值表达为：平均值土 SD (η = 3)。
【主权项】
1. 鱼腥草多糖在制备补体抑制药物中的用途； 所述的鱼腥草多糖及其结构分别为： 鱼腥草多糖HC-PS1，其结构特征为：主要由七种单糖组成的杂多糖，糖残基摩尔比为 Rha: Ara:Man:Glc :GlcA:Gal :GalA = 1. 0:3. 0:3. 9:2. 5:2. 4:6. 1:3. 0 ;分子量为 274530Da ; 比旋度[〇][125=-30.0 ((：0.3，!120);蛋白含量：1.41%;糖醛酸含量：24.08%;糖含量 94. 60% ;不含硫酸基； 鱼腥草多糖HC-PS2,其结构特征为：主要由五种单糖组成的杂多糖，糖残基摩尔比 为 Man:Glc:GlcA:Gal :GalA = 1. 0:0· 3:1. 7:0. 7:4. 6 ;分子量为 7928Da ;比旋度[a ]D25 = -12. 8 (c 0.3, H20);蛋白含量：1. 89%;糖醛酸含量：65. 64%;糖含量93. 10%;不含硫酸 基； 鱼腥草多糖HC-PS3,其结构特征为：主要由五种单糖组成的杂多糖，糖残基摩尔比为 Man:Glc:GlcA:Gal :GalA = 1. 0:0· 5:0. 4:1. 2:0. 4 ;分子量为 216384Da ;比旋度[a ]D25 =-62. 8 (c 0. 3, H20);蛋白含量：1. 53% ;糖醛酸含量：20. 19% ;糖含量93. 73% ;不含硫酸 基。2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鱼腥草多糖的硫酸化、羟乙基化或羧 甲基化衍生物在制备补体抑制药物中的用途。3. 权利要求1所述的用途，其特征是所述的鱼腥草多糖通过以下步骤制备： 鱼腥草以95 %乙醇冷浸提取，滤过，用热水提取，滤过，浓缩，离心，上清液加入4倍体 积的95%乙醇，静置，离心去上清，沉淀以水复溶，减压回收，除去乙醇；复溶液再以三氯醋 酸去游离蛋白，离心，上清液调至中性，浓缩，透析，冷冻干燥即得粗多糖；粗多糖加蒸馏水 溶解，离心，上清液分次用DEAE-cellulose柱（C1 1型）层析进行初步分离，以蒸馏水、0. 4、 0. 8、1. 2和2. Omol/L的NaCl溶液洗脱，收集各流份，根据糖显色反应和紫外检测的结果合 并相同流分，经浓缩、透析及冷冻干燥后分别进行抗补体活性测定； 取其中体外抗补体活性显著的组分，加蒸馏水或〇. 15mol/L的NaCl溶液溶解，离心，上 清液分次用Sephacryl S-400柱、Sephacryl S-300柱或Superdex-200柱分离，以蒸馏水 或0. 15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集各流份，根据糖显色反应和紫外检测的结果合并相同 流分，并进行抗补体活性追踪，最终获得抗补体活性强的均一多糖。
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及鱼腥草中的均一多糖及其衍生物及其制备方法与药物用途。本发明从清热解毒中药鱼腥草中分离得到均一多糖HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3，并通过化学修饰的方法得到这些均一多糖的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化衍生物；经实验证实，所述的鱼腥草均一多糖及其衍生物对补体激活的经典途径和旁路途径均有显著的抑制作用，可进一步作为活性成分，制备新型抗补体药物。
【IPC分类】A61K31/715, C08B37/00, C07H1/08, A61P37/02, A61K31/737, A61K31/702, C07H3/06
【公开号】CN105708851
【申请号】CN201410734793
【发明人】陈道峰, 张娟娟, 卢燕
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月4日