4水平，*: P〈0.05。
[0062]图10提供了显示以下的图表：
[0063] A:在采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠中诱导的各IgG亚类的抗体滴度，^tPW.OUB: 来源于采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的脾细胞的T细胞增殖试验。C:来源于采用E3疫苗免疫 的小鼠的脾细胞的ELISPOT试验。D:来源于采用E3疫苗免疫的小鼠的脾细胞的ELISPOT试验 中的色斑数目。
[0064]图11显示了来源于采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的肾、肝和空肠的Masson三色染 色切片的显微图像。
【具体实施方式】
[0065] 1.用于预防或治疗糖尿病的疫苗
[0066]本发明提供了用于预防或治疗糖尿病的疫苗，其包含以下（1)-(3)中的任意物质： [0067] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列；
[0068] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和 [0069] (3)能够表达上述(1)或(2)多肽的表达载体。
[0070]在本说明书中，糖尿病包括糖尿病（1型糖尿病、2型糖尿病）以及涉及糖尿病的疾 病。所述涉及糖尿病的疾病的实例包括糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、糖尿病视网膜病 变、高胰岛素血症、肥胖等。
[0071] 给药本发明疫苗的对象可为任意哺乳动物，其为已发展糖尿病或具有发展糖尿病 风险的哺乳动物。所述哺乳动物的实例包括实验动物如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚 鼠等）、兔等，宠物如狗、猫等，牲畜如牛、猪、山羊、马、绵羊等，灵长类如人、猴、猩猩、黑猩猩 等，且特别优选人。给药对象可正经历或未经历糖尿病治疗。当给药本发明疫苗时，包含于 所述疫苗中的物质优选为来源于给药对象的那些物质（即，当给药至人时，所述疫苗是来源 于人的物质，且当给药至小鼠时，所述疫苗是来源于小鼠的物质）。
[0072] 包含于本发明疫苗中的物质是选自由以下构成的组的物质：
[0073] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列；
[0074] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和 [0075] (3)能够表达上述(1)或(2)多肽的表达载体。
[0076]包含于本发明疫苗中的上述(1)多肽(下文称本发明多肽，其包括上述(2)多肽)是 DPP-4(二肽基肽酶4)氨基酸序列的部分序列。DPP-4是一种已知基因且其核苷酸序列以及 其氨基酸序列也是已知的。例如，包含于上述（1)多肽中的具体氨基酸序列为例如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列。所述部分序列通过例如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列编码。此外，作 为包含于上述（1)多肽中的氨基酸序列，还优选可以提及包含对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列的多肽。对应于SEQ ID N0:2的非人哺乳动物氨基酸序列的获得可简单 通过使用本说明书中SEQ ID N0:2中公开的氨基酸序列的信息以及已知序列数据库，设计 适当引物和探针，并使用常规基因工程方法如RT-PCR、噬斑杂交等。例如，对应于人DPP-4部 分序列SEQ ID N0:2的小鼠 DPP-4氨基酸序列的部分序列为SEQ ID N0:4所示氨基酸序列， 且所述部分序列通过例如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列编码。如本发明所使用的，非人哺乳 动物是指排除人类的上述哺乳动物。
[0077]包含于本发明疫苗中的上述（1)多肽优选为由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对 应于SEQ ID N0:2的非人哺乳动物氨基酸序列组成的多肽。
[0078]包含于本发明疫苗中的上述(2)多肽是在DPP-4氨基酸序列的部分序列中，其中1 个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列。在人类情况 下，此多肽包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被缺 失、取代、插入或添加的氨基酸序列。所述氨基酸序列的实例包括（l)SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列中1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被缺失的氨基酸序列，（2)在SEQ ID NO: 2所 示氨基酸序列中添加1个或数个(优选1-数个（2-5))氨基酸的氨基酸序列，（3)在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中插入1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸的氨基酸序列，（4)在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被其它氨基酸取代的氨基 酸序列，和(5)具有上述突变（1)-(4)组合的氨基酸序列(在此情况下，突变氨基酸总数为1 个或数个(优选1-数个(2-5)))。此外，包含于上述(2)多肽中的氨基酸序列可优选提及在对 应于SEQ ID N0:2的非人哺乳动物氨基酸序列中1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被缺 失、取代、插入或添加的氨基酸序列。在小鼠情况下，此多肽包含SEQ ID N0:4所示氨基酸序 列，其中1个或数个(优选1 -若干(2-5))氨基酸被缺失、取代、插入或添加。所述氨基酸序列 的实例包括（1)在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸被 缺失的氨基酸序列，（2)在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中添加1个或数个(优选1-数个(2-5))氨基酸的氨基酸序列，（3)在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中插入1个或数个(优选1-数 个(2-5))氨基酸的氨基酸序列，（4)在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中1个或数个(优选1-数 个(2-5))氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列，和(5)具有上述突变(1)-(4)组合的氨基 酸序列(在此情况下，突变氨基酸总数为1个或数个(优选1-数个(2-5)))。
[0079] "氨基酸残基取代"的实例包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是指特定氨基酸 被具有与所述氨基酸的侧链相似的那些特性的侧链的氨基酸所取代。特别地，在保守氨基 酸取代中，特定氨基酸被所述氨基酸所属组中的其它氨基酸取代。具有相似特性侧链的氨 基酸组是相关领域中已知的。此类氨基酸组的实例包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨 酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸）、具有中性侧链的氨 基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）。具有中性侧链的氨基酸可进一 步分为具有极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)和具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）。作为其它组，例如具有芳香侧链的氨基酸（例如苯丙氨酸、色氨 酸、酪氨酸）、具有含羟基（醇式羟基、酚式羟基)侧链的氨基酸（例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸)等也可被提及。
[0080] "氨基酸残基缺失"的实例包括选择及缺失SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的任意 氨基酸残基。
[0081 ] "氨基酸残基插入"或"氨基酸残基添加"的实例包括在SEQ ID N0: 2所示氨基酸序 列的内部或N-末端侧或C-末端侧插入或添加氨基酸残基。为增加肽的水溶性，可在所述氨 基酸序列的N-末端侧或C-末端侧添加1或个2个作为碱性氨基酸的精氨酸(Arg)或赖氨酸 (Lys)残基。
[0082]包含于本发明疫苗中的上述(2)多肽优选为由在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或 对应于SEQ ID N0:2的非人哺乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插 入或添加的氨基酸序列组成的多肽。
[0083]本发明多肽可包含附加氨基酸。此氨基酸的添加是可接受的，只要所述多肽诱导 针对DPP-4的特异性免疫反应。虽然所添加氨基酸序列没有特别限制，但可提及例如促进所 述多肽的检测、纯化等的标签(tag)。所述标签的实例包括Flag标签、组氨酸标签、c-Myc标 签、HA标签、AU1标签、GST标签、MBP标签、荧光蛋白标签(例如，GFP，YFP，RFP，CFP，BFP等）、 免疫球蛋白Fc标签等。所述氨基酸序列的添加位置为本发明多肽的N-末端和/或C-末端。 [0084]虽然用于本发明多肽的氨基酸包括L形、D形和DL形，但其通常优选L形。这些多肽 的合成可通过常规多肽合成方法并服从于本发明。在本发明中，生产方法、合成方法、供应 方法等没有特别限制。
[0085]在上述(3)表达载体中，编码上述（1)或（2)多肽的多核苷酸(DNA或RNA，优选DNA) 功能性连接至能够在作为给药对象的哺乳动物的细胞中展现启动子活性的启动子的下游。 即，所述(3)表达载体能在所述启动子的控制下表达(1)或(2)多肽作为转录产物。通过给药 (3)表达载体至哺乳动物，所述(1)或(2)多肽在哺乳动物机体中产生，借此在所述哺乳动物 中诱导针对所述(1)或(2)多肽的特异性免疫反应。
[0086] 将要使用的启动子没有特别限制，只要其能在作为给药对象的哺乳动物的细胞中 发挥作用。作为所述启动子，可使用poll型启动子、polll型启动子、polIII型启动子等。特 别地，使用来源于SV40的初始启动子、病毒启动子如巨细胞病毒LTR等、哺乳动物组成蛋白 基因启动子如β-肌动蛋白基因启动子等。
[0087] 上述(3)表达载体优选在编码上述（1)或(2)多肽的多核苷酸的下游包含转录终止 信号，即，终止子区。此外，其可进一步包含用于选择转化细胞的选择标记基因（赋予对药物 如四环素、氨苄西林、卡那霉素等抗性的基因，补充营养缺陷型突变的基因等）。
[0088] 虽然用作本发明中表达载体的载体种类没有特别限制，但优选给药至诸如人等的 哺乳动物的载体包括病毒载体、质粒载体等。所述病毒载体的实例包括逆转录病毒、腺病 毒、腺相关病毒等。考虑到生产、简单可操作性和经济效益，优选使用质粒载体。
[0089] 本发明疫苗除了上述（1)或（2)多肽或（3)表达载体以外，还可以作为包含任意载 体(例如药学上可接受的载体)的药物组合物提供。
[0090] 药学上可接受的载体的实例包括但不限于，赋性剂如蔗糖、淀粉等，粘合剂如纤维 素、甲基纤维素等，崩解剂如淀粉、羧甲基纤维素等，润滑剂如硬脂酸镁、气凝胶等，芳香剂 如柠檬酸、薄荷醇等，防腐剂如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠等，稳定剂如柠檬酸，柠檬酸钠等，助 悬剂如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，分散剂如表面活性剂等，稀释剂如水、盐水等，底蜡 等。
[0091] 当本发明疫苗是上述(3)表达载体时，为促进将表达载体引入细胞，本发明疫苗可 进一步包含用于引入核酸的试剂。当使用病毒载体作为表达载体时，可使用RetroNect in、 纤连蛋白、聚凝胺等作为转基因试剂。当使用质粒载体作为表达载体时，可使用阳离子脂质 如Lipofectin，lipofectamine，DOGS(Transfectam)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、聚 凝胺或聚（乙烯亚胺）（PEI)等。
[0092] 本发明疫苗优选进一步包含载体蛋白质以增加上述(1)或(2)多肽或由（3)表达载 体所编码多肽的免疫原性。载体蛋白质通常是结合由于小分子量而不具有免疫原性的分子 并赋予其免疫原性的物质，且其是技术领域中已知的。所述载体蛋白质的优选实例包括牛 血清白蛋白（BSA)、兔血清白蛋白（RSA)、卵白蛋白（0VA)、钥孔戚血蓝素(keyhole-limpet hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白（TG)、免疫球蛋白等。特别优选的载体蛋白质是钥孔戚血 蓝素(KLH)。在上述(3)表达载体的情况下，编码载体蛋白质的多核苷酸可连接至编码上述 (1)或(2)多肽的多核苷酸。
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