CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法

专利名称：CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途 和制备方法。
背景技术：
农药残留已成为突出的环境问题，越来越受到人们的关注，消除环境中残留农药 的研究也越来越受到重视。残留农药的去除方法主要有生物降解、物理降解、化学降 解等，其中生物降解是指通过生物(包括各种微生物、植物和动物)的作用将大分子分 解成小分子化合物的过程。生物降解因不带入二次污染、条件温和，而越来越受到重 视，己成为当前食品安全领域的研究热点。化学农药的生物降解主要是通过微生物、 降解酶、工程菌、植物来进行，其中降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能忍受 异常环境条件，而且酶的降解效果远胜于微生物本身，尤其是在残留农药质量浓度低 的情况下。
氨基甲酸酯类农药的结构基于毒扁豆碱，骨架为氨基甲酸，属于酯类有机化合物， 酯键断裂后即失去毒性作用，常用的是N-甲酰氨基甲酸酯。它们是目前使用仅次于有 机磷农药的一类杀虫剂，常用的品种有呋喃丹、西维因、速灭威等。氨基甲酸酯类杀 虫剂的毒理机制是抑制乙酰胆碱酯酶活性，阻断正常神经传导，多数属中等神经毒， 这与有机磷类类似。但同有机磷类的机制又有所不同1.它不需经代谢活化，可直接 与乙酰胆碱酯酶形成疏松复合体，抑制后者的活性。2.与乙酰胆碱酯酶可逆结合，形
成的复合物可迅速分解，故症状较轻，恢复较快。
现在随着氨基甲酸酯类的广泛使用，其残留问题也凸显了出来。但到目前为止，发 现的能水解氨基甲酸酯类农药的酶，要么分子量过大，不利于工业化的应用，要么活 性不够强。因此，寻找一种酶蛋白和方法，能有效地水解氨基甲酸酯类农药，显得愈 发重要。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是寻找一种能高效降解氨基甲酸酯类杀虫剂的酶蛋白。
为解决上述问题，
一方面，本发明公开了一种CehA突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白
(a) 其氨基酸序列如SEQ ID NO. l所述的蛋白；
(b) 至少与(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有水解的氨基甲酸酯类杀虫剂或 毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID N0.7所述的蛋白。
其中所述CehA突变体蛋白与SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列具有至少75 %的同源 性。更优选地，该CehA突变体蛋白与SEQIDNO. 1所述的氨基酸序列具有至少85 % 的同源性。
在实施方案里，本发明(b)中所述CehA突变体蛋白优选自氨基酸序列如SEQ ID N0.2 6所述的蛋白，其中最优选氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述的蛋白。
本发明的发明思路为通过基因工程技术人为縮短CehA蛋白序列，从中获得较原始 CehA蛋白具有更高水解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素活性的突变体蛋白。在这一思路 下，本发明所保护范围包括但不局限于上述突变体蛋白。
一方面，本发明公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本发明 所述CehA突变体蛋白。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。
在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。
另一方面，本发明公开了一种本发明所述CehA突变体蛋白的制备方法，包括如下 步骤
① CehA突变体蛋白表达载体的构建；
② CehA突变体蛋白转化体的制备；
③ CehA突变体蛋白的表达；
④ CehA突变体蛋白的纯化。
另一方面，本发明公开了一种降解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素的组合物，包括本 发明所述CehA突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。
另一方面，本发明公开了本发明所述CehA突变体蛋白在去除或降低氨基甲酸酯类
杀虫剂或毒素的残留或污染方面的用途。
与现有的CehA蛋白比较，本发明所述的CehA突变体蛋白活性更高，能有效地水 解氨基甲酸酯类农药，并且分子量更小，更稳定，可开发为工业应用低成本和高质量 的酶制剂。这为解决氨基甲酸酯农药残留或污染提供了新的选择。200810043792


图1.纯化后不同CehA突变体蛋白的电泳图。
图2.不同CehA突变体蛋白对西维因的降解效果。
具体实施例方式
下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。
氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素(carbamates)用作农药的杀虫剂、除草剂、杀菌剂等。 这类杀虫剂分为五大类①萘基氨基甲酸酯类，如西维因；②苯基氨基甲酸酯类，如 叶蝉散；③氨基甲酸肟酯类，如涕灭威；④杂环甲基氨基甲酸酯类，如呋喃丹；⑤杂 环二甲基氨基甲酸酯类，如异索烕。
氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素包括克百威、丁硫克百威、丙硫克百威、仲丁威、异 丙威、残杀威、灭多威、硫双灭多威、棉铃威、苯硫威、抗蚜威、双氧威、唑蚜威、 速灭威、杀草丹、禾草特。
CehA突变体蛋白
蛋白的同源性百分比由GAP (Needleman和Wunsh，1 970)分析(GCG程序) 确定，其中参数gap creation penalty = 5， gap extension penalty = 0.3 。被分析的序歹(J长 度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的 区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在 参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序 列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个 氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选 地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列 的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
此处使用的术语"CehA突变体蛋白"是指CehA蛋白的突变体，优选为CehA蛋白 (BAB85626.1 GI:19032285)的突变体。相比于天然存在的CehA蛋白，CehA突变体 蛋白保留了至少一些对氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素的水解活性。优选地，该突变体与 它们起源的天然存在的CehA蛋白相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。 天然存在的CehA蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核 苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替 换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体， 提供最终的蛋白产品。本发明涉及的方面还包括CeM突变体蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行 了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保 护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上 等。这些修饰可以用来增加本发明CehA突变体蛋白的稳定性和/或生物活性。
CehA突变体蛋白的表达
本发明包括编码本发明的CehA突变体蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转 化体。
本发明中，使用的术语"转化体"(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的CehA突变体蛋白的方法。通过本 领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒 载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核 苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。 一般说来，多核苷酸和/或载体 可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、 兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、 NS0和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如 L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用 于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F. Ausubel et al. ， Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)和Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸 的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如， 可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚 体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化 产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除去突出的Y-单链 末端，并用其聚合活性补平3'-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。 然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段 与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA 区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中， 所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切 核酸酶位点的合成接头。多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动 子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬 菌体人PL启动子、大肠杆菌lac、 trP 、 phoA、 tac启动子、SV40早期和晚期启动 子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组 载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。 重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于 被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而 言的二氢叶酸还原酶、G418 、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其 它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括 但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵 母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞； 动物细胞，如CH0 ， COS ， NS0 ， 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿 主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标 签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathiones-transferase, GST)、六聚 组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain) 等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签 蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白 酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得天然的目标蛋白。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知 的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调
节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。 在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造 的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰 (如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白 质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转 导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法 描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)。
编码本发明的CehA突变体蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿
7主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入 质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导 至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体 的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细 胞，使用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3， 208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液 中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的CehA突变体蛋白较 为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸 纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集 素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的CehA突变体 蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的CehA突变体 蛋白，所述层析柱有- Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sephaxose FF柱、DEAE Sepharose FF、 Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。
另外，可使用国际公开号W000/44772 (全文列入本文作为参考)中描述的方法纯 化本发明的CehA突变体蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于 纯化本发明的CehA突变体蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳 动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的CehA突变体蛋白。
组合物
用于本发明或者含有本发明CehA突变体蛋白的组合物，包括赋形剂，此处也指"可 接受的载体"。赋形剂是可以被处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括 土壤或水样品)可进行处理的任何材料。这种赋形剂的例子包括水、盐水、Ringer's溶 液、葡萄糖溶液、Hank's溶液和其它生理平衡盐溶液。非水载体，如固态油、芝麻油、 油酸乙酯或一甘油三酯都可以使用。其它有用的剂型包括含有粘度增强剂的悬浮液， 如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂液可含有微量添加剂，如增强等渗压性 和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲 液，而防腐剂的例子包括硫柳汞或0—甲酚，福尔马林和苯甲醇。赋形剂也可用于增 加组分的半衰期，例如，但不限于，聚合控释载体、生物可降解的植入物、脂质体、 细菌、病毒、其它细胞、油、酯和乙二醇。
此外，CehA突变体蛋白可被固化到一组分中，该组分可增加氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素的降解率和/或降解度，或可增加蛋白的稳定性。所述固化方法如本领域技术 人员所理解的，可参考W00064539公开了昆虫酯酶或其突变体能够固化在海绵或泡 沫中使用的方法，它们的内容在此处完全引入。
本发明的一个实施方案是一种控释剂型，它能将含有CehA突变体蛋白的组分缓慢 释放到动物、植物、动物或植物材料或环境(包括土壤和水样品)中。如此处所用， 控释剂型配方是在一种控释载体中包含CehA突变体蛋白。合适的控释载体包括，但不 限于，生物相容聚合物、其它聚合基质、胶囊、微囊剂、微粒、大丸剂、渗透泵、扩 散装置、脂质体、脂球(liposphere)和透皮输送体系。优选的控释剂型是生物降解的 (即生物可侵蚀的)。
本发明优选的控释剂型能将CehA突变体蛋白释放到用氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素 喷射区域的土壤或水中。该剂型优选释放1至12个月的时间段。本发明优选的控释 剂型能有效处理优选至少约1个月，更优选至少约3个月，甚至更优选至少约6个 月，甚至更优选至少约9个月，甚至更优选至少约12个月。CehA突变体蛋白(或 表达CehA突变体蛋白的转化体)的浓度要必须产生有效降解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒 素的组分，该浓度的选择取决于被净化样品的性质、样品中氨基甲酸酯类杀虫剂或毒 素的浓度和组分的配方。组分中CehA突变体蛋白(或表达CehA突变体蛋白的转化体) 的有效浓度可用本领域技术人员所了解的实验方法容易地确定。
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。无需进一步描述，可以相信本领域技 术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且 实践所要求的方法。因此，下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案，不能 将其看成是对其余内容的限制。
下列实施例中所用试剂均为市售，除非特别说明。
实施例l.CehA (1-729)突变体蛋白转化体的制备
l.CehA (1-729)突变体蛋白(SEQ ID NO. 6)编码基因的制备
CehA野生型的基因(AB069723.1:2645..5029)通过核酸合成仪获得的，在其5，端 加入了编码6XHis标签和EK酶位点的DNA序列(SEQ ID N0.8),并克隆在pET30的 Nde I和Not I位点之间。将CehA (1-729)突变体的正向引物(5， 〉GCCCATATGGAAT TCCACCATCACCATCAC〈3， SEQ ID NO. 9)和反向引物(5， 〉GGCGCGGCCGCTTAGATGGTAA CAAACACTGGATAG〈3' SEQ ID NO. 10)用灭菌重蒸水溶解为终浓度为50 ^M。按以下体 系组织反应U00pl体系)成分_体积(pi)
10xPCR缓冲液 10
正向引物 5
反向引物 5
2.5 mM dNTPs 8
模板DNA(pET30-CehA质粒) 1
Taq酶(2.5u/pl) 1
H20 70
按以下参数进行循环扩增-
94°C预变性10min， 94。C变性30s， 55°C退火30s， 72°C延伸3min。共30个循 环，最后一个循环延伸增加lOmin。
2. CehA (1-729)突变体的克隆
收集实施例1中扩增得到的各个反应体系，向体系中加入1/10体积的预冷乙酸 钠(3M， pH5.2)，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20。C冰箱放置30min， 沉淀DNA。 4°C， 12,000rpm离心15min将沉淀收集到管底。弃去上清，用70%乙醇洗 沉淀。弃去上清，短暂离心后吸弃尽可能多的剩余液体，自然风干DNA。用20pl灭 菌重蒸水重溶DNA。
按以下体系组织酶切反应体系(限制性内切酶购自Takara公司)。
10 x buffer H 5^1
0.1% BSA 5 pi
DNA (PCR产物) 20^1
Nde I (20u) 2 pi
Not I (20u) 2 pi
ddH20 16pl
同样的反应体系酶切消化pET30a (+) ， 37 °C酶切消化4小时。 将酶切后的DNA用0.7。/c)琼脂糖电泳分离，EB染色，紫外灯下切下含有对应大 小片段的胶条。用胶回收试剂盒(MBI)回收DNA。
按以下体系组织连接反应(连接酶购自Progema公司)10x连接酶缓冲液 "I
pET30载体片段
DNA片段 7|al
T4DNA连接酶(5u) 1^1
16。C连接过夜
用CaCl2法制备TOP 10感受态细胞，取5Kd连接产物用热冲击法转化TOP 10 感受态细胞。转化产物涂布含卡那50pg/ml的LB平板，37。C培养箱培养14-18h。挑 选分离良好的菌落接种于含卡那5(Hig/ml的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养过 夜。用碱裂解法小量抽提质粒，按以下体系组织酶切反应。
10 x buffer H2^1
0.1% BSA2pl
DNA10^1
Nde I (20u)lpl
Not I (20u)lpl
ddH204^1
37。C酶切反应4小时，走0.7。/。TAE琼脂糖电泳检测，挑选插入片段大小合适的 克隆，通过自动测序仪进一步测序鉴定，挑选序列正确的克隆。 实施例2-3.其它CehA突变体蛋白转化体的制备 CehA (1-659)突变体蛋白和CehA(l-568)突变体蛋白编码基因的制备中各自特 异性引物如下 突变体 CehA (1-659)突 变体(SEQID NO.4)
CehA(l-568)突 变体(SEQID N0.2)
11
引物序列
正向引物(SEQ ID NO. 9 ): 5' >GCCCATATGGAATTCCACCATCACCATCAC<3'
反向引物(SEQ ID NO. 11):
5' >GGCGCGGCCGCTTAGTTCAATAAATGATACCATGC<3' 正向引物(SEQ ID NO. 9): 5' >GCCCATATGGAATTCCACCATCACCATCAC<3'
反向引物(SEQ ID NO. 12):
5'〉 GGCGCGGCCGCTTAGTTCAATAAATGATACCATGC〈3'其它突变体的PCR扩增反应同上，只是将相应的正向和反向引物换为相应的正 向和反向引物。其它的克隆和筛选操作同实施例1。
实施例4.重组蛋白的诱导表达
用CaCl2法制备BL21 (DE3)感受态细胞。用碱裂解法分别提取实施例1-3中得 到的重组质粒，热冲击法转化BL21 (DE3)感受态细胞。转化产物涂布含卡那50pg/ml 的LB平板，37°C培养箱培养14-18h。挑选分离良好的菌落接种于含卡那50pg/ml的 LB液体培养基中，37。C摇床震荡培养过夜。按l: 100转接于4L含同样抗生素的LB 培养基中，37。C震荡培养至OD600 -0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，转至 30°C诱导表达4-6小时。取部分诱导后的产品电泳鉴定。同样的方法诱导野生型CehA 表达。
实施例5.重组蛋白质的分离纯化
4°C， 6000rpm离心收集菌体，弃去上清液。按每克菌体湿重20ml的比例用A 液(50mM Tris-HCl， pH8.0)重悬菌体，超声波破碎细胞。12,000 rpm离心15min， 收集上清。用A液平衡Ni-Chelating Sepharose FF，将离心后收集的上清上Ni-Chelating Sepharose FF柱，用A液洗平，再用0-100%B (50mM Tris-HCl， 500mM咪唑，pH8.0) 对目的蛋白进行梯度洗脱,收集目的蛋白所在组份。用等体积A液稀释收集到的蛋白溶 液，将稀释液上用A液预平衡的Q-SepharoseFF柱，用A液洗平，再用0-100%C (50 mMTris-HCl， 500mM NaCl， pH 8.0)对目的蛋白进行洗脱。收集目的蛋白所在的组分， 分别获得野生型CehA重组蛋白(SEQIDN0.7) 、 CehA(l-749) (SEQIDN0.6)、 CehA(l-659) (SEQIDN0.4) 、 CehA ( 1-568) (SEQIDN0.2)。电泳分析表明蛋 白质的纯度已达到90%以上，见图l提纯的CehA及其各个突变体，M:分子量标准， 1: 野生型CehA重组蛋白，2: CehA(l-749), 3: CehA(l-659)， 4. CehA (1-568). 分子量标准的大小(kDa)依次是(从上往下)116.0， 66.2, 45.0， 35.0， 25.0， 18.4， 14.4。
另外，纯化步骤中，在Ni-Chelating Sepharose分离后和Q-Sepharose分离前，可 采用EK酶处理除去重组蛋白N端14个氨基酸，而相应获得SEQIDNO.l、 3、 5所 示蛋白CehA(15-568) (SEQIDNO.l) CehA(15-659) (SEQIDN0.3) CehA(15-749) (SEQIDN0.5)。
与CehA(l5-568)(SEQ ID NO. 1)比较，CehA(l-749)(SEQ ID N0.6) 、 CehA(l5-749) (SEQIDN0.5)同源性约为75%; CehA(l-659) (SEQ ID N0.4) 、 CehA(l5-659) (SEQIDN0.3)同源性约为85%、 CehA (1-568) (SEQIDN0.2)同源性约为95%。 实施例6.重组蛋白降解西维因的活性
重组蛋白为实施例5所制备的野生型CehA重组蛋白、CehA(l-749)、 CehA(l-659)、 CehA (1-568)
用Bradford法测定重组蛋白的浓度，用50mMTris-HCl，pH8.0调整浓度为0.1mg/ml 用无水甲醇将西维因纯药溶解为lmg/ml的溶液，按下述体系组织2个反应体系(5ml)。 l.对照体系
西维因
重组蛋白溶液 50mMPB， pH7.0
2.反应体系
西维因 O.lml
重组蛋白溶液 O.lml
50mMPB， pH7.0 4.8ml
37 。C反应30分钟后，按GB/T 20769-2006用LC-MS检测反应体系中的西维因的 浓度。以对照体系的峰面积为100.0%，按以下公式计算各反应体系中农药的降解百分 比，结果见图2: 1: 野生型CehA重组蛋白，2: CehA(l-749), 3: CehA(l-659)， 4. CehA (1-568)。
降解西维因的百分率=(对照峰面积-样品峰面积)/对照峰面积X100。/。
上述结果表明与野生型的CehA重组蛋白比较，CehA突变体蛋白降解西维因能 力更强，活性更高。
实施例7. CehA突变体蛋白对农药降解的动物实验
重组蛋白为实施例5所制备的CehA (1-568)。
用Bradford法测定重组蛋白的浓度，用50mMTris-HCl，pH8.0调整浓度为0.1mg/ml 用无水甲醇将西维因纯药溶解为lmg/ml的溶液，按以下体系组织反应
1.对照体系
西维因 O.lml
CehA (1-568)蛋白溶液 Oml
50mMPB， pH7.0 4.9ml
O.lml
Oml
4.9ml
132.反应体系
西维因 0.1mlCehA (1-568)蛋白溶液 0.1ml50mMPB, pH7.0 4.8ml
37°C反应2h后，取两只2L的烧杯，各加入1L自来水。 一只烧杯里加入0.5ml加有CehA (1-568)的反应产物，另一只加入0.5ml未加CehA (1-568)的反应产物，并混匀。挑选10只大小一致，活性较强的小金鱼，每只烧杯里放入5只，观察金鱼的生存情况。加入未用CehA (1-568)处理样品的烧杯中的金鱼，在1小时内全部死亡，而加入用CehA (1-568)处理样品的烧杯中的金鱼，8h后无一死亡。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。序列表
<110>上海普天欣生物技术有限公司
〈120> CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法 <130>说明书序列表
<160> 12
<170> Patentln version 3.3
<210> 1 〈211〉 554 <212> PRT
<213> artificial sequence 〈400> 1
Met Asp Gin Pro Phe Lys Pro Asp Arg Arg Gin Leu Leu Ala Gly Ala
15 10 15
Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser His Trp Pro Val Phe Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Ala lie Glu Pro Gin Pro Tyr Phe Ala Ser Val Lys Arg Ala Val Glu
35 40 45
Gin Leu Ala Ala Met Gly Gin Pro lie Ala Asp Ala Asp Met Ala Arg
50 55 60
Leu Ala Ser Leu Phe Ser Arg Glu Asp Ala Glu Ala Val lie Ala Ala 65 70 75 80
Glu Ala Leu Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Ala Arg Val Thr Leu Asp Lys
85 90 95
Gly Gly Met Gly Ala Ala Ala Leu Gly Gly Ala Lys Arg His Leu Val
100 105 110
Glu Gin Gly Trp Thr Ala Phe Leu Val Arg Val Ser Asn Pro Ser Ser
115 120 125
Leu Thr Gin Ala Phe Glu lie Tyr Ser Gly Ser Ala Met Pro Ala Arg
130 135 140
Met Phe Pro Gin Ala Ser Lys Phe Ala Ala Glu Gin Lys Ala Tyr Leu 145 150 155 160
Ala Asp Thr Val Arg Lys Glu Ala Leu lie Glu Arg Met Trp Leu Met
165 170 175
Ser Gin lie Glu Ala Ser Pro Val Leu Ser Gly Asn Val Val Glu Tyr
180 185 190
Lys lie Ala Thr lie Tyr Ser Arg Asp Arg Gly Arg Lys Thr Gly Arg
195 200 205
Leu Gly Phe Gly Ala Gly lie Leu Gin Asp Asn Pro Thr Trp Gly Ala 210 215 220
15Val225Gin
Gly
Pro
lie
His305Val
Trp
His
Pro
Glu385Ser
Gin
Arg
Ser
Pro鄉Ala
Ser
Pro
His
Glu545
Ser Arg Ala SerProCysPro
Tyr290lie
Arg
lie
Ala
Glu370Val
Gly
Ala
Glu
Leu450Gly
Lys
Phe
Thr
Gly530Leu
Ser Arg Asp245
Met Ala Ser
260Gin Val Met275
Arg Ala Asp
Met
Val
Asp
Ala355Thr
Leu
Ala
Ala
Ser435Ser
Thr
Trp
Gly
Phe515Ala
Asn
Val
Ser
Pro340Gly
Met
Thr
Ala
Asn420Met
Gly
His
Ala
Met500Asn
Val
Ala
Arg
Ala325Ala
Cys
lie
Trp
lie405Asn
Leu
His
Ala
Lys485lie
Ser
Asp
Trp
Val230lie
Leu
Arg
Gly
Arg310Ser
Lys
Ala
Arg
Ala390Ser
Ala
Arg
Leu
Val470Ala
Val
Val
Phe
Tyr550
Ala
Gin
Met
Leu
Glu295Gly
Asp
Trp
His
His375Gly
Pro
Asp
Tyr
lie455Glu
Gin
Gly
Gly
Leu535His
Asn
Leu
lie
Ala280Thr
Pro
Ala
Gly
Tyr360lie
Gly
Glu
Trp
Asp440Leu
Asp
Gly
Thr
Thr520Ala
Leu
Pro
Gin
His265Pro
Val
Glu
Arg
Trp345Met
Arg
Tyr
Ala
Lys425Leu
Met
Trp
Ala
Asn505Asn
Gly
Leu
Leu
lie250Asp
Asp
Arg
Tyr
lie330Tyr
Leu
Gly
Ser
Arg410Pro
Glu
Arg
Pro
Leu490Ala
Glu
Cys
Asn
Val235Leu
Ala
Leu
Leu
Leu315Ala
Ser
Pro
Glu
Tyr395Leu
Met
lie
Leu
Ser475Val
Leu
Ala
Asn
Thr
Asp
Asn
Ala
Pro300Val
Val
Gly
Thr
Ala380Gin
Glu
Pro
Ser
Lys460Trp
Gly
Pro
lie
Gly540
Asp Phe
Asp Asp
Lys His270Phe Gin285
Asp GlyGin ArgArg LeuAsp
Glu365Leu
Lys
His
Thr
Gly445Glu
Asn
Tyr
Asn
Val525Pro
Thr350Gly
Ser
Gin
Pro
Pro430Phe
Leu
Leu
Thr
Tyr510Gly
Pro
Val
Gly255lie
Pro
Glu
Ala
Lys335His
Val
Val
Phe
Gin415Lys
Pro
Ser
Pro
His495Glu
Val
Ala
Ser240Gly
Tyr
His
Tyr
Thr320Arg
Leu
Ala
Gly
Phe400Leu
Asp
Ser
Tyr
Val480Cys
lie
Thr
Ala〈210> 2〈211〉 568<212> PRT
<213> artificial sequence<400> 2
Met Glu Phe His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Met Asp
15 10 15
Gin Pro Phe Lys Pro Asp Arg Arg Gin Leu Leu Ala Gly Ala Thr Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Ala Ser His Trp Pro Val Phe Ala Ser Thr Asp Ala lie
35 40 45
Glu Pro Gin Pro Tyr Phe Ala Ser Val Lys Arg Ala Val Glu Gin Leu
50 55 60
Ala Ala Met Gly Gin Pro lie Ala Asp Ala Asp Met Ala Arg Leu Ala65 70 75 80
Ser Leu Phe Ser Arg Glu Asp Ala Glu Ala Val lie Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Leu Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Ala Arg Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly
100 105 110
Met Gly Ala Ala Ala Leu Gly Gly Ala Lys Arg His Leu Val Glu Gin
115 120 125
Gly Trp Thr Ala Phe Leu Val Arg Val Ser Asn Pro Ser Ser Leu Thr
130 135 140
Gin Ala Phe Glu lie Tyr Ser Gly Ser Ala Met Pro Ala Arg Met Phe145 150 155 160
Pro Gin Ala Ser Lys Phe Ala Ala Glu Gin Lys Ala Tyr Leu Ala Asp
165 170 175
Thr Val Arg Lys Glu Ala Leu lie Glu Arg Met Trp Leu Met Ser Gin
180 185 190
lie Glu Ala Ser Pro Val Leu Ser Gly Asn Val Val Glu Tyr Lys lie
195 200 205
Ala Thr lie Tyr Ser Arg Asp Arg Gly Arg Lys Thr Gly Arg Leu Gly
210 215 220
Phe Gly Ala Gly lie Leu Gin Asp Asn Pro Thr Trp Gly Ala Val Ser225 230 235 240
Arg Ala Ser Val Ala Asn Pro Leu Val Thr Asp Phe Val Ser Gin Pro
245 250 255
Ser Arg Asp lie Gin Leu Gin lie Leu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Cys
260 265 270
Met Ala Ser Leu Met lie His Asp Ala Asn Lys His lie Tyr Pro Pro
275 280 285
Gin Val Met Arg Leu Ala Pro Asp Leu Ala Phe Gin Pro His lie Tyr290 295 300
17200810043792 Arg Ala 305
Met Val
Val Ser
Asp Pro
Ala Gly 370 Thr Met 385
Leu Thr
Ala Ala
Ala Asn
Ser Met 450 Ser Gly 465
Thr His
Trp Ala
Gly Met
Phe Asn 530 Ala Val 545
Asn Ala
Asp
Arg
Ala
Ala 355 Cys
lie
Trp
lie
Asn 435 Leu
His
Ala
Lys
lie 515 Ser
Asp
Trp
Gly Glu
Arg Gly 325 Ser Asp 340
Lys Trp
Ala His
Arg His
Ala Gly 405 Ser Pro 420
Ala Asp
Arg Tyr
Leu lie
Val Glu 485 Ala Gin 500
Val Gly
Val Gly
Phe Leu
Tyr His 565
Thr 310 Pro
Ala
Gly
Tyr
lie 390 Gly
Glu
Trp
Asp
Leu 470 Asp
Gly
Thr
Thr
Ala 550 Leu
Val
Glu
Arg
Trp
Met 375 Arg
Tyr
Ala
Lys
Leu 455 Met
Trp
Ala
Asn
Asn 535 Gly
Leu
Arg
Tyr
lie
Tyr 360 Leu
Gly
Ser
Arg
Pro 440 Glu
Arg
Pro
Leu
Ala 520 Glu
Cys
Asn
Leu
Leu
Ala 345 Ser
Pro
Glu
Tyr
Leu 425 Met
lie
Leu
Ser
Val 505 Leu
Ala
Asn
Pro
Val 330 Val
Gly
Thr
Ala
Gin 410 Glu
Pro
Ser
Lys
Trp 490 Gly
Pro
lie
Gly
Asp 315 Gin
Arg
Asp
Glu
Leu 395 Lys
His
Thr
Gly
Glu 475 Asn
Tyr
Asn
Val
Pro 555
Gly
Arg
Leu
Thr
Gly 380 Ser
Gin
Pro
Pro
Phe 460 Leu
Leu
Thr
Tyr
Gly 540 Pro
Glu
Ala
Lys
His 365 Val
Val
Phe
Gin
Lys 445 Pro
Ser
Pro
His
Glu 525 Val
Ala
Tyr
Thr
Arg 350 Leu
Ala
Gly
Phe
Leu 430 Asp
Ser
Tyr
Val
Cys 510 lie
Thr
Ala
His
Val 335 Trp
His
Pro
Glu
Ser 415 Gin
Arg
Ser
Pro
Ala 495 Ser
Pro
His
Glu
lie 320 Arg
lie
Ala
Glu
Val 400 Gly
Ala
Glu
Leu
Gly 480 Lys
Phe
Thr
Gly
Leu 560
<210〉 3 <211> 645 <212> PRT
〈213〉 artificial sequence 〈400〉 3
Met Asp Gin Pro Phe Lys Pro Asp Arg Arg Gin Leu Leu Ala Gly Ala
1 5
10
15Thr Leu
Ala lie
Gin Leu
50Leu Ala65
Glu Ala
Gly
Glu
Leu
Met145Ala
Ser
Lys
Leu
Val225Gin
Gly
Pro
lie
His305Val
Trp
His
Gly
Gin
Thr130Phe
Asp
Gin
lie
Gly210Ser
Pro
Cys
Pro
Tyr290lie
Arg
lie
Ala
Leu
Glu
35
Ala
Ser
Leu
Met
Gly115Gin
Pro
Thr
lie
Ala195Phe
Arg
Ser
Met
Gin275Arg
Met
Val
Asp
Ala355
Leu
20
Pro
Ala
Leu
Leu
Gly100Trp
Ala
Gin
Val
Glu180Thr
Gly
Ala
Arg
Ala260Val
Ala
Val
Ser
Pro340Gly
Gly
Gin
Met
Phe
Glu
85
Ala
Thr
Phe
Ala
Arg165Ala
lie
Ala
Ser
Asp245Ser
Met
Asp
Arg
Ala325Ala
Cys
Ala
Pro
Gly
Ser
70
Arg
Ala
Ala
Glu
Ser150Lys
Ser
Tyr
Gly
Val230lie
Leu
Arg
Gly
Arg310Ser
Lys
Ala
Ser
Tyr
Gin
55
Arg
Tyr
Ala
Phe
lie135Lys
Glu
Pro
Ser
lie215Ala
Gin
Met
Leu
Glu295Gly
Asp
Trp
His
His
Phe
40
Pro
Glu
Thr
Leu
Leu120Tyr
Phe
Ala
Val
Arg200Leu
Asn
Leu
lie
Ala280Thr
Pro
Ala
Gly
Tyr360
Trp
25
Ala
lie
Asp
Leu
Gly105Val
Ser
Ala
Leu
Leu185Asp
Gin
Pro
Gin
His265Pro
Val
Glu
Arg
Trp345Met
Pro
Ser
Ala
Ala
Ala
90
Gly
Arg
Gly
Ala
lie170Ser
Arg
Asp
Leu
lie250Asp
Asp
Arg
Tyr
lie330Tyr
Leu
Val
Val
Asp
Glu
75
Arg
Ala
Val
Ser
Glu155Glu
Gly
Gly
Asn
Val235Leu
Ala
Leu
Leu
Leu315Ala
Ser
Pro
Phe
Lys
Ala
60
Ala
Val
Lys
Ser
Ala140Gin
Arg
Asn
Arg
Pro220Thr
Asp
Asn
Ala
Pro300Val
Val
Gly
Thr
Ala
Arg
45
Asp
Val
Thr
Arg
Asn125Met
Lys
Met
Val
Lys205Thr
Asp
Asp
Lys
Phe285Asp
Gin
Arg
Asp
Glu365
Ser
30
Ala
Met
lie
Leu
His110Pro
Pro
Ala
Trp
Val190Thr
Trp
Phe
Asp
His270Gin
Gly
Arg
Leu
Thr Asp
Val Glu
Ala Arg
Ala Ala
80Asp Lys95
Leu Val
Ser Ser
Ala Arg
Tyr Leu160Leu Met175
Glu Tyr
Gly Arg
Gly Ala
Val Ser240Gly Gly255
lie Tyr
Pro His
Glu Tyr
Ala Thr320Lys Arg335
His Leu
Thr350
Gly Val AlaPro
Glu 385 Ser
Gin
Arg
Ser
Pro 465 Ala
Ser
Pro
His
Glu 545 Met
Arg
Asp
Leu
Gly 625 Val
Glu 370 Val
Gly
Ala
Glu
Leu 450 Gly
Lys
Phe
Thr
Gly 530 Leu
Ala
Pro
Asp
Tyr 610 Arg
Arg
Thr Met
Leu Thr
AI3 Ala
Ala Asn 420 Ser Met 435
Ser Gly
Thr His
Trp Ala
Gly Met 500 Phe Asn 515
Ala Val
Asn Ala
Gly Glu
Gly lie 580 Ala Gly 595
Trp Gly Glu Ser Val Ser
lie Arg His lie Arg Gly Glu 375
Trp Ala Gly Gly Tyr Ser Tyr 390 395 lie Ser Pro Glu Ala Arg Leu 405 410 Asn Ala Asp Trp Lys Pro Met 425
Leu Arg Tyr Asp Leu Glu lie 440
Leu Met Arg Leu
His Leu
Ala Val 470
Lys 485 lie
Ser
Asp
Trp
Thr 565 Gly
Tyr
Asp
Gly
Ala 645
Ala
Val
Val
Phe
Tyr 550 Asp
Arg
Ser
Gly
Lys 630
lie 455 Glu
Gin
Gly
Gly
Leu 535 His
Tyr
Thr
Ala
Arg 615 Gin
Asp Trp Pro Ser 475
Gly Ala Leu Val 490
Thr Asn Ala Leu 505
Thr Asn Glu Ala 520
Ala Gly Cys Asn
Leu Leu Asn Cys 555
Pro Cys lie Val 570
Tyr Val Lys Leu 585
Trp Val Asp Gly 600
Thr His Phe Leu
Pro Leu Ala Phe 635
Ala Leu Ser Val Gly 380
Gin Lys Gin Phe Phe 400
Glu His Pro Gin Leu 415
Pro Thr Pro Lys Asp 430
Ser Gly Phe Pro Ser 445
Lys Glu Leu Ser Tyr 柳
Trp Asn Leu Pro Val 480
Gly Tyr Thr His Cys 495
Pro Asn Tyr Glu lie 510
lie Val Gly Val Thr 525
Gly Pro Pro Ala Ala 540
Gly Tyr Thr Leu Met 560
Pro Ser Val Asp Ser 575
Pro Gin Arg Pro Val 590
Leu Glu Asn Gly His 605
His Phe Thr Val Asn 620
Val Arg Ala Ser Asn 640
<210> 4
〈211〉 659
〈212〉 PRT
〈213〉 artificial sequence
<400> 4Met Glu 1
Gin Pro
Phe Phe
Leu Leu Gly 35 Gin
Glu Pro 50 Ala Ala 65
Sei Leu
Leu Leu
Met Gly
Gly Trp 130 Gin Ala 145
Pro Gin
Thr Val
lie Glu
Ala Thr 210 Phe Gly 225
Arg Ala
Ser Arg
Met Ala
Gin Val 290 Arg Ala 305
Met Val
Met
Phe
Glu
Ala 115 Thr
Phe
Ala
Arg
Ala 195 lie
Ala
Ser
Asp
Ser 275 Met
Asp Arg Val Ser Ala
His
Lys
20
Ala
Pro
Gly
Ser
Arg 100 Ala
Ala
Glu
Ser
Lys 180 Ser
Tyr
Gly
Val
lie 260 Leu
Arg
Gly
Arg
Ser 340
His 5
Pro
Ser
Tyr
Gin
Arg
85
Tyr
Ala
Phe
lie
Lys 165 Glu
Pro
Ser
lie
Ala 245 Gin
Met
Leu
Glu
Gly 325 Asp
His
Asp
His
Phe
Pro
70
Glu
Thr
Leu
Leu
Tyr 150 Phe
Ala
Val
Arg
Leu 230 Asn
Leu
lie
Ala
Thr 310 Pro
Ala
His
Arg
Trp
Ala
55
lie
Asp
Leu
Gly
Val 135 Ser
Ala
Leu
Leu
Asp 215 Gin
Pro
Gin
His
Pro 295 Val
Glu
Arg
His
Arg
Pro
40
Ser
Ala
Ala
Ala
Gly 120 Arg
Gly
Ala
lie
Ser 200 Arg
Asp
Leu
lie
Asp 280 Asp
Arg
Tyr
lie
His
Gin
25
Val
Val
Asp
Glu
Arg 105 Ala
Val
Ser
Glu
Glu 185 Gly
Gly
Asn
Val
Leu 265 Ala
Leu
Leu
Leu
Ala 345
Asp Asp 10
Leu Leu
Phe Ala
Lys Arg
Ala Asp 75
Ala Val 90
Val
Lys
Ser
Ala
Gin 170 Arg
Asn
Arg
Pro
Thr 250 Asp
Asn
Ala
Pro
Val 330 Val
Thr
Arg
Asn
Met 155 Lys
Met
Val
Lys
Thr 235 Asp
Asp
Lys
Phe
Asp 315 Gin
Arg
Asp
Ala
Ser
Ala
60
Met
lie
Leu
His
Pro 140 Pro
Ala
Trp
Val
Thr 220 Trp
Phe
Asp
His
Gin 300 Gly
Arg
Leu
Asp Gly
Lys Met Asp 15
Ala Thr Leu 30
Asp Ala lie
Thr 45
Val Glu Gin Leu
Ala
Ala
Asp
Leu 125 Ser
Ala
Tyr
Leu
Glu 205 Gly
Gly
Val
Gly
lie 285 Pro
Glu
Ala
Lys
Arg Leu Ala 80
Ala Glu Ala 95
Gly Gly
Lys 110 Val
Ser
Arg
Leu
Met 190 Tyr
Arg
Ala
Ser
Gly 270 Tyr
His
Tyr
Thr
Arg 350
Glu Gin
Leu Thr
Met Phe 160 Ala Asp 175
Ser Gin
Lys lie
Leu Gly
Val Ser 240 Gin Pro 255
Gly Cys
Pro Pro
lie Tyr
His lie 320 Val Arg 335
Trp lie
21Asp Pro Ala 355 Cys
Ala Gly 370 Thr Met 385
Leu Thr
Ala Ala
Ala Asn
Ser Met 450 Ser Gly 465
Thr His
Trp Ala
Gly Met
Phe Asn 530 Ala Val 545
Asn Ala
Gly Glu
Gly lie
Ala Gly 610 Trp Gly 625
Glu Ser
lie
Trp
lie
Asn 435 Leu
His
Ala
Lys
lie 515 Ser
Asp
Trp
Thr
Gly 595 Tyr
Asp Gly Val Ser Ala
Lys
Ala
Arg
Ala
Ser 420 Ala
Arg
Leu
Val
Ala 500 Val
Val
Phe
Tyr
Asp 580 Arg
Ser
Gly
Lys
Trp
His
His
Gly 405 Pro
Asp
Tyr
lie
Glu 485 Gin
Gly
Gly
Leu
His 565 Tyr
Thr
Ala
Arg
Gin 645
Gly
Tyr
lie 390 Gly
Glu
Trp
Asp
Leu 470 Asp
Gly
Thr
Thr
Ala 550 Leu
Pro
Tyr
Trp
Thr 630 Pro
Trp
Met 375 Arg
Tyr
Ala
Lys
Leu 455 Met
Trp
Ala
Asn
Asn 535 Gly
Leu
Cys
Val
Val 615 His
Leu
Tyr 360 Leu
Gly
Ser
Arg
Pro 440 Glu
Arg
Pro
Leu
Ala 520 Glu
Cys
Asn
lie
Lys 600 Asp
Phe
Ala
Ser
Pro
Glu
Tyr
Leu 425 Met
lie
Leu
Ser
Val 505 Leu
Ala
Asn
Cys
Val 585 Leu
Gly
Leu
Phe
Gly
Thr
Ala
Gin 楊 Glu
Pro
Ser
Lys
Trp 490 Gly
Pro
lie
Gly
Gly 570 Pro
Pro
Leu
His
Val 650
Asp
Glu
Leu 395 Lys
His
Thr
Gly
Glu 475 Asn
Tyr
Asn
Val
Pro 555 Tyr
Ser
Gin
Glu
Phe 635 Arg
Thr
Gly 380 Ser
Gin
Pro
Pro
Phe 460 Leu
Leu
Thr
Tyr
Gly 540 Pro
Thr
Val
Arg
Asn 620 Thr
Ala
His 365 Val
Val
Phe
Gin
Lys 445 Pro
Ser
Pro
His
Glu 525 Val
Ala
Leu
Asp
Pro 605 Gly
Val
Ser
Leu
Ala
Gly
Phe
Leu 430 Asp
Ser
Tyr
Val
Cys 510 lie
Thr
Ala
Met
Ser 590 Val
His
Asn
Asn
His
Pro
Glu
Ser 415 Gin
Arg
Ser
Pro
Ala 495 Ser
Pro
His
Glu
Met 575 Arg
Asp
Leu
Gly
Val 655
Ala
Glu
Val 400 Gly
Ala
Glu
Leu
Gly 480 Lys
Phe
Thr
Gly
Leu 560 Ala
Pro
Asp
Tyr
Arg 640 Arg
<210> 5 〈211> 735 <212> PRT〈213> artificial sequence <400> 5
Met Asp Gin Pro Phe Lys Pro Asp Arg Arg Gin Leu Leu Ala Gly Ala
15 10 15
Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser His Trp Pro Val Phe Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Ala lie Glu Pro Gin Pro Tyr Phe Ala Ser Val Lys Arg Ala Val Glu
35 40 45
Gin Leu Ala Ala Met Gly Gin Pro lie Ala Asp Ala Asp Met Ala Arg
50 55 60
Leu Ala Ser Leu Phe Ser Arg Glu Asp Ala Glu Ala Val lie Ala Ala 65 70 75 80
Glu Ala Leu Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Ala Arg Val Thr Leu Asp Lys
85 90 95
Gly Gly Met Gly Ala Ala Ala Leu Gly Gly Ala Lys Arg His Leu Val
100 105 110
Glu Gin Gly Trp Thr Ala Phe Leu Val Arg Val Ser Asn Pro Ser Ser
115 120 125
Leu Thr Gin Ala Phe Glu lie Tyr Ser Gly Ser Ala Met Pro Ala Arg
130 135 140
Met Phe Pro Gin Ala Ser Lys Phe Ala Ala Glu Gin Lys Ala Tyr Leu 145 150 155 160
Ala Asp Thr Val Arg Lys Glu Ala Leu lie Glu Arg Met Trp Leu Met
165 170 175
Ser Gin lie Glu Ala Ser Pro Val Leu Ser Gly Asn Val Val Glu Tyr
180 185 190
Lys lie Ala Thr lie Tyr Ser Arg Asp Arg Gly Arg Lys Thr Gly Arg
195 200 205
Leu Gly Phe Gly Ala Gly lie Leu Gin Asp Asn Pro Thr Trp Gly Ala
210 215 220
Val Ser Arg Ala Ser Val Ala Asn Pro Leu Val Thr Asp Phe Val Ser 225 230 235 240
Gin Pro Ser Arg Asp lie Gin Leu Gin lie Leu Asp Asp Asp Gly Gly
245 250 255
Gly Cys Met Ala Ser Leu Met lie His Asp Ala Asn Lys His lie Tyr
260 265 270
Pro Pro Gin Val Met Arg Leu Ala Pro Asp Leu Ala Phe Gin Pro His
275 280 285
lie Tyr Arg Ala Asp Gly Glu Thr Val Arg Leu Pro Asp Gly Glu Tyr
290 295 300
His lie Met Val Arg Arg Gly Pro Glu Tyr Leu Val Gin Arg Ala Thr 305 310 315 320Trp
His
Pro
Glu 385 Ser
Gin
Arg
Ser
Pro 465 Ala
Ser
Pro
His
Glu 545 Met
Arg
Asp
Leu
Gly 625 Val
Pro
Arg Val Ser lie Ala
Glu 370 Val
Gly
Ala
Glu
Leu 450 Gly
Lys
Phe
Thr
Gly 530 Leu
Ala
Pro
Asp
Tyr 610 Arg
Arg
Glu
Asp Pro 340 Ala Gly 355
Thr Met Leu Thr Ala Ala Ala
Ser 435 Ser
Thr
Trp
Gly
Phe 515 Ala
Asn
Gly
Gly
Ala 595 Trp
Glu
Val
Thr
Asn 420 Met
Gly
His
Ala
Met 500 Asn
Val
Ala
Glu
lie 580 Gly
Gly
Ser
Ser
Val 660
Ala 325 Ala
Cys
lie
Trp
lie 405 Asn
Leu
His
Ala
Lys 485 lie
Ser
Asp
Trp
Thr 565 Gly
Tyr
Asp
Gly
Ala 645 Gin
Ser
Lys
Ala
Arg
Ala 390 Ser
Ala
Arg
Leu
Val 470 Ala
Val
Val
Phe
Tyr 550 Asp
Arg
Ser
Gly
Lys 630 Thr
Asn
Asp
Trp
His
His 375 Gly
Pro
Asp
Tyr
lie 455 Glu
Gin
Gly
Gly
Leu 535 His
Tyr
Thr
Ala
Arg 615 Gin
lie
Ala
Ala
Gly
Tyr 360 lie
Gly
Glu
Trp
Asp 440 Leu
Asp
Gly
Thr
Thr 520 Ala
Leu
Pro
Tyr
Trp 600 Thr
Pro
Ala
Ser
Arg
Trp 345 Met
Arg
Tyr
Ala
Lys 425 Leu
Met
Trp
Ala
Asn 505 Asn
Gly
Leu
Cys
Val 585 Val
His
Leu
Ala
Glu 665
lie 330 Tyr
Leu
Gly
Ser
Arg 410 Pro
Glu
Arg
Pro
Leu 490 Ala
Glu
Cys
Asn
lie 570 Lys
Asp
Phe
Ala
Met 650 Glu
Ala
Ser
Pro
Glu
Tyr 395 Leu
Met
lie
Leu
Ser 475 Val
Leu
Ala
Asn
Cys 555 Val
Leu
Gly
Leu
Phe 635 Leu
Pro
Val
Gly
Thr
Ala 380 Gin
Glu
Pro
Ser
Lys 460 Trp
Gly
Pro
lie
Gly 540 Gly
Pro
Pro
Leu
His 620 Val
Glu
Trp
Arg
Asp
Glu 365 Leu
Lys
His
Thr
Gly 445 Glu
Asn
Tyr
Asn
Val 525 Pro
Tyr
Ser
Gin
Glu 605 Phe
Arg
Leu
His
Leu
Thr 350 Gly
Ser
Gin
Pro
Pro 430 Phe
Leu
Leu
Thr
Tyr 510 Gly
Pro
Thr
Val
Arg 590 Asn
Thr
Ala
Thr
lie 670
Lys 335 His
Val
Val
Phe
Gin 415 Lys
Pro
Ser
Pro
His 495 Glu
Val
Ala
Leu
Asp 575 Pro
Gly
Val
Ser
Pro 655 Glu
Arg
Leu
Ala
Gly
Phe 400 Leu
Asp
Ser
Tyr
Val 480 Cys
lie
Thr
Ala
Met 560 Ser
Val
His
Asn
Asn 640 Ser
His
24Ala Arg lie Gly 675
Gly Val Ala Val 690
Gin lie Ser Phe 705
Arg Val Leu Gly
Asn Ser Arg Lys Val Ala Val Glu Leu 680 685 Lys Arg Gin Glu Met Leu Ala Asp Gly
695 700 Lys Glu Lys lie Asp Arg Ser Ser Trp
710 715 Ser Gly His Thr Tyr Pro Val Phe Val 725 730
<210〉 6
〈211〉 749
〈212〉 PRT
〈213〉 artificial sequence
<400〉 6 Glu Phe Pro Leu
Met 1
Gin
Phe
Leu
Glu
Ala
65
Ser
Leu
Met
Gly
Gin 145 Pro
Thr
lie
Ala
Pro
50
Ala
Leu
Leu
Gly
Trp 130 Ala
Gin
Val
Glu
Thr 210
Gly 35 Gin
Met
Phe
Glu
Ala 115 Thr
Phe
Ala
Arg
Ala 195 lie
His
Lys
20
Ala
Pro
Gly
Ser
Arg 100 Ala
Ala
Glu
Ser
Lys 180 Ser
Tyr
His 5
Pro
Ser
Tyr
Gin
Arg
85
Tyr
Ala
Phe
lie
Lys 165 Glu
Pro
Ser
His
Asp
His
Phe
Pro
70
Glu
Thr
Leu
Leu
Tyr 150 Phe
Ala
Val
Arg
His
Arg
Trp
Ala
55
lie
Asp
Leu
Gly
Val 135 Ser
Ala
Leu
Leu
Asp 215
His His Asp 10
Arg Gin Leu 25
Pro Val Phe 40
Ser Val Lys
Ala Asp Ala
Ala Glu Ala 90
Ala Arg Val
105 Gly Ala Lys 120
Arg Val Ser
Gly Ser Ala
Ala Glu Gin 170
lie Glu Arg 185
Ser Gly Asn 200
Arg Gly Arg
Asp
Leu
Ala
Arg
Asp
75
Val
Thr
Arg
Asn
Met 155 Lys
Met
Val
Lys
Asp
Ala
Ser
Ala
60
Met
lie
Leu
His
Pro 140 Pro
Ala
Trp
Val
Thr 220
lie Val Asn
Ser Leu Gin
lie Ala Met 720
Thr lie 735
Asp
Gly
Thr
45
Val
Ala
Ala
Asp
Leu 125 Ser
Ala
Tyr
Leu
Glu 205 Gly
Lys
Ala
30
Asp
Glu
Arg
Ala
Lys 110
Val
Ser
Arg
Leu
Met 190 Tyr
Arg
Met
15
Thr
Ala
Gin
Leu
Glu
95
Gly
Glu
Leu
Met
Ala 175 Ser
Lys
Leu
Asp
Leu
lie
Leu
Ala
80
Ala
Gly
Gin
Thr
Phe 160 Asp
Gin
lie
Gly
25Phe Gly 225
Arg Ala
Ser Arg
Met Ala
Gin Val 290 Arg Ala 305
Met Val
Val Ser
Asp Pro
Ala Gly 370 Thr Met 385
Leu Thr
Ala Ala
Ala Asn
Ser Met 450 Ser Gly 465
Thr His
Trp Ala
Gly Met
Phe Asn 530 Ala Val 545
Asn Ala
Ala
Ser
Asp
Ser 275 Met
Asp
Arg
Ala
Ala 355 Cys
lie
Trp
lie
Asn 435 Leu
His
Ala
Lys
lie 515 Ser
Asp
Trp
Gly
Val
lie 260 Leu
Arg
Gly
Arg
Ser 340 Lys
Ala
Arg
Ala
Ser 420 Ala
Arg
Leu
Val
Ala 500 Val
Val
Phe
Tyr
lie
Ala 245 Gin
Met
Leu
Glu
Gly 325 Asp
Trp
His
His
Gly 405 Pro
Asp
Tyr
lie
Glu 485 Gin
Gly
Gly
Leu
His 565
Leu 230 Asn
Leu
lie
Ala
Thr 310 Pro
Ala
Gly
Tyr
lie 390 Gly
Glu
Trp
Asp
Leu 470 Asp
Gly
Thr
Thr
Ala 550 Leu
Gin
Pro
Gin
His
Pro 295 Val
Glu
Arg
Trp
Met 375 Arg
Tyr
Ala
Lys
Leu 455 Met
Trp
Ala
Asn
Asn 535 Gly
Leu
Asp
Leu
lie
Asp 280 Asp
Arg
Tyr
lie
Tyr 360 Leu
Gly
Ser
Arg
Pro 440 Glu
Arg
Pro
Leu
Ala 520 Glu
Cys
Asn
Asn
Val
Leu 265 Ala
Leu
Leu
Leu
Ala 345 Ser
Pro
Glu
Tyr
Leu 425 Met
lie
Leu
Ser
Val 505 Leu
Ala
Asn
Cys
Pro
Thr 250 Asp
Asn
Ala
Pro
Val 330 Val
Gly
Thr
Ala
Gin 410 Glu
Pro
Ser
Lys
Trp 490 Gly
Pro
lie
Gly
Gly 570
Thr 235 Asp
Asp
Lys
Phe
Asp 315 Gin
Arg
Asp
Glu
Leu 395 Lys
His
Thr
Gly
Glu 475 Asn
Tyr
Asn
Val
Pro 555 Tyr
Trp
Phe
Asp
His
Gin 300 Gly
Arg
Leu
Thr
Gly 380 Ser
Gin
Pro
Pro
Phe 柳 Leu
Leu
Thr
Tyr
Gly 540 Pro
Thr
Gly
Val
Gly
lie 285 Pro
Glu
Ala
Lys
His 365 Val
Val
Phe
Gin
Lys 445 Pro
Ser
Pro
His
Glu 525 Val
Ala
Leu
Ala
Ser
Gly 270 Tyr
His
Tyr
Thr
Arg 350 Leu
Ala
Gly
Phe
Leu 430 Asp
Ser
Tyr
Val
Cys 510 lie
Thr
Ala
Met
Val
Gin 255 Gly
Pro
lie
His
Val 335 Trp
His
Pro
Glu
Ser 415 Gin
Arg
Ser
Pro
Ala 495 Ser
Pro
His
Glu
Met 575
Ser 240 Pro
Cys
Pro
Tyr
lie 320 Arg
lie
Ala
Glu
Val 400 Gly
Ala
Glu
Leu
Gly 480 Lys
Phe
Thr
Gly
Leu 560 AlaGly
Gly
Ala
Trp 625 Glu
Val
Thr
lie
Ala 705 Ser
Leu
Glu
lie
Gly 610 Gly
Ser
Ser
Val
Gly 690 Val
Phe
Gly
Thr
Gly 595 Tyr
Asp
Gly
Ala
Gin 675 Asn
Lys
Lys
Ser
Asp 580 Arg
Ser
Gly
Lys
Thr 660 Asn
Ser
Arg
Glu
Gly 740
Tyr
Thr
Ala
Arg
Gin 645 lie
Ala
Arg
Gin
Lys 725 His
Pro
Tyr
Trp
Thr 630 Pro
Ala
Ser
Lys
Glu 710
lie
Thr
Cys
Val
Val 615 His
Leu
Ala
Glu
Val 695 Met
Asp
Tyr
lie Val 585 Lys Leu 600
Asp Gly Phe Leu Ala Phe Met
Glu 680 Ala
Leu
Arg
Pro
Leu 665 Pro
Val
Ala
Ser
Val 745
Pro
Pro
Leu
His
Val 650 Glu
Trp
Glu
Asp
Ser 730 Phe
Ser
Gin
Glu
Phe 635 Arg
Leu
His
Leu
Gly 715 Trp
Val
Val
Arg
Asn 620 Thr
Ala
Thr
lie
lie 700 Ser
lie
Thr
Asp
Pro 605 Gly
Val
Ser
Pro
Glu 685 Val
Leu
Ala lie
Ser 590 Val
His
Asn
Asn
Ser 670 His
Asn
Gin
Met
Arg Pro
Asp Asp
Leu Tyr
Gly Arg 640 Val Arg 655
Pro Glu
Ala Arg
Gly Val
Gin lie 720 Arg Val 735
〈210〉 7
<211> 794
〈212〉 PRT
〈213〉 Rhizobium sp.
〈揚 7
Met Asp Gin Pro Phe Lys Pro Asp Arg Arg Gin Leu Leu Ala Gly Ala
15 10 15
Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser His Trp Pro Val Phe Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Ala lie Glu Pro Gin Pro Tyr Phe Ala Ser Val Lys Arg Ala Val Glu
35 40 45
Gin Leu Ala Ala Met Gly Gin Pro lie Ala Asp Ala Asp Met Ala Arg
50 55 60
Leu Ala Ser Leu Phe Ser Arg Glu Asp Ala Glu Ala Val lie Ala Ala 65 70 75 80
Glu Ala Leu Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Ala Arg Val Thr Leu Asp Lys
85 90 95
Gly Gly Met Gly Ala Ala Ala Leu Gly Gly Ala Lys Arg His Leu Val 100 105 110
27Glu
Leu
Met 145 Ala
Ser
Lys
Leu
Val 225 Gin
Gly
Pro
lie
His 305 Val
Trp
His
Pro
Glu 385 Ser
Gin
Arg
Ser
Gin
Thr 130 Phe
Asp
Gin
lie
Gly 210 Ser
Pro
Cys
Pro
Tyr 290 lie
Arg
lie
Ala
Glu 370 Val
Gly
Ala
Glu
Leu 450
Gly 115 Gin
Pro
Thr
lie
Ala 195 Phe
Arg
Ser
Met
Gin 275 Arg
Met
Val
Asp
Ala 355 Thr
Leu
Ala
Ala
Ser 435 Ser
Trp
Ala
Gin
Val
Glu 180 Thr
Gly
Ala
Arg
Ala 260 Val
Ala
Val
Ser
Pro 340 Gly
Met
Thr
Ala
Asn 420 Met
Gly
Thr
Phe
Ala
Arg 165 Ala
lie
Ala
Ser
Asp 245 Ser
Met
Asp
Arg
Ala 325 Ala
Cys
lie
Trp
lie 405 Asn
Leu
His
Ala
Glu
Ser 150 Lys
Ser
Tyr
Gly
Val 230 lie
Leu
Arg
Gly
Arg 310 Ser
Lys
Ala
Arg
Ala 390 Ser
Ala
Arg
Leu
Phe
lie 135 Lys
Glu
Pro
Ser
lie 215 Ala
Gin
Met
Leu
Glu 295 Gly
Asp
Trp
His
His 375 Gly
Pro
Asp
Tyr
lie 455
Leu 120 Tyr
Phe
Ala
Val
Arg 200 Leu
Asn
Leu
lie
Ala 280 Thr
Pro
Ala
Gly
Tyr 360 lie
Gly
Glu
Trp
Asp 440 Leu
Val
Ser
Ala
Leu
Leu 185 Asp
Gin
Pro
Gin
His 265 Pro
Val
Glu
Arg
Trp 345 Met
Arg
Tyr
Ala
Lys 425 Leu
Met
Arg
Gly
Ala
lie 170 Ser
Arg
Asp
Leu
lie 250 Asp
Asp
Arg
Tyr
lie 330 Tyr
Leu
Gly
Ser
Arg 410 Pro
Glu
Arg
Val
Ser
Glu 155 Glu
Gly
Gly
Asn
Val 235 Leu
Ala
Leu
Leu
Leu 315 Ala
Ser
Pro
Glu
Tyr 395 Leu
Met
lie
Leu
Ser
Ala 140 Gin
Arg
Asn
Arg
Pro 220 Thr
Asp
Asn
Ala
Pro 300 Val
Val
Gly
Thr
Ala 380 Gin
Glu
Pro
Ser
Lys 460
Asn 125 Met
Lys
Met
Val
Lys 205 Thr
Asp
Asp
Lys
Phe 285 Asp
Gin
Arg
Asp
Glu 365 Leu
Lys
His
Thr
Gly 445 Glu
Pro
Pro
Ala
Trp
Val 190 Thr
Trp
Phe
Asp
His 270 Gin
Gly
/Vrg
Leu
Thr 350 Gly
Ser
Gin
Pro
Pro 430 Phe
Leu
Ser
Ala
Tyr
Leu 175 Glu
Gly
Gly
Val
Gly 255 lie
Pro
Glu
Ala
Lys 335 His
Val
Val
Phe
Gin 415 Lys
Pro
Ser
Ser
Arg
Leu 160 Met
Tyr
Arg
Ala
Ser 240 Gly
Tyr
His
Tyr
Thr 320 Arg
Leu
Ma
Gly
Phe 400 Leu
Asp
Ser
Tyr
28Pro Gly 465
Ala Lys
Ser Phe
Pro Thr
His Gly 530 Glu Leu 545
Met Ala Arg Pro Asp Asp
Leu
Gly 625 Val
Pro
Ala
Gly
Gin 705 Arg
Asn
Cys
Glu
Asp 785
Tyr 610 Arg
Arg
Glu
Arg
Val 690 lie
Val
Lys
Val
Leu 770 Arg
Thr
Trp
Gly
Phe 515 Ala
Asn
Gly
Gly
Ala 595 Trp
Glu
Val
Thr
lie 675 Ala
Ser
Leu
Pro
Asp 755 Ala
lie
His
Ala
Met 500 Asn
Val
Ala
Glu
lie 580 Gly
Gly
Ser
Ser
Val 660 Gly
Val
Phe
Gly
lie 740 Ala
Asp
lie
Ala
Lys 485 lie
Ser
Asp
Trp
Thr 565 Gly
Tyr
Asp
Gly
Ala 645 Gin
Asn
Lys
Lys
Ser 725 Arg
Leu
Ala
Ala
Val Glu 470
Ala Gin
Val Gly
Val Gly
Phe Leu 535 Tyr His 550
Asp Tyr Arg Thr Ser Ala
Gly
Lys 630 Thr
Asn
Ser
Arg
Glu 710 Gly
Ala
Trp
Ala
Glu 790
Arg 615 Gin
lie
Ala
Arg
Gin 695 Lys
His
Ser
Asn
Ala 775 Ser
Asp
Gly
Thr
Thr 520 Ala
Leu
Pro
Tyr
Trp 600 Thr
Pro
Ala
Ser
Lys 680 Glu
lie
Thr
Arg
Glu 760 Ala
Asp
Trp
Ala
Asn 505 Asn
Gly
Leu
Cys
Val 585 Val
His
Leu
Ala
Glu 665 Val
Met
Asp
Tyr
Arg 745 Lys
Tyr
Leu
Pro
Leu 490 Ala
Glu
Cys
Asn
lie 570 Lys
Asp
Phe
Ala
Met 650 Glu
Ala
Leu
Arg
Pro 730 Ser
His
Asp
Thr
Ser 475 Val
Leu
Ala
Asn
Cys 555 Val
Leu
Gly
Leu
Phe 635 !>eu
Pro
Val
Ala
Ser 715 Val
Ala
Ser
His
Trp
Gly
Pro
lie
Gly 540 Gly
Pro
Pro
Leu
His 620 Val
Glu
Trp
Glu
Asp 700 Ser
Phe
Glu
Leu
Ala 780
Asn
Tyr
Asn
Val 525 Pro
Tyr
Ser
Gin
Glu 605 Phe
Arg
Leu
His
Leu 685 Gly
Trp
Val
Trp
lie 765 Arg
Leu
Thr
Tyr 510 Gly
Pro
Thr
Val
Arg 590 Asn
Thr
Ala
Thr
lie 670 lie
Ser
lie
Thr
Leu 750 Arg
Gin
Pro Val 480 His Cys 495
Glu lie
Val Thr
Ala Ala
Leu Met 560 Asp Ser 575
Pro V3l
Gly His
Val Asn
Ser Asn 640 Pro Ser 655
Glu His
Val Asn
Leu Gin
Ala Met 720 lie Gly 735
Arg Thr Asp Thr Thr Tyr<210> 8
<211> 2438
<212〉 謹
<213> artificial sequence
<400> 8
catatgg犯ttccaccatcaccatcaccatg3Cg￡Ltg3Cgccagccattc60
犯gcctgatcgtcgtcaattgttagcaggtgccaccttgtt3ttgggtgCatctcactgg120
ccagtgtttgcctccaccgacgcaatcgagcctcagccatatttcgcctctgttaaacgt180
gcagtcgaacaattagccgc朋tgggtC3gcctattgccg3tgC3g3C3tggcccgtttg240
gcatcctta/ttttctcgtgaggatgccg犯gC3gtg3tCgCCgC3g3ggCcttgttagaa300
cgttacaccttggcacgtgttaccttagac卿ggtggtatgggtgccgcagccttgggt360
ggtgc犯aacgtcatttagtcgagc卿gttggaccgccttcttggtgcgtgtttccaac420
ccatcttccttaacccaggc3tttgai冊tttattctggttccgccatgcctgcacgtatg480
ttcccacaagcctctaagtttgcagccgagC3g犯agcatacttggccggitaccgtccgt540
taatcgagcgtstgtggttgatgtccc犯attg犯gcctctcctgtgtta600
tccggt肌tgttgtCg3gt3t肌犯tcgcaaccatttactctcgtgaccgtggtcgt卿660
3CCggtCgtttgggtttcggtgccggtatcttacaggataaccc犯cctggggtgcagtg720
tcccgtgcctctgttgcaaatcctttggtcaccgactttgtgtcccaaccatctcgtgat780
attcagttacaaatcttggacgatgacggtggtggttgcatggcctccttaatgattcac840
aacatatctatcctccacaggtcatgcgtttggcccctgacttagcattc900
C￡L￡LCC3CaC￡Ltttaccgtgccgatggtgaaaccgtgcgtttgcctgacggtgagtatcat960
atcatggttcgtcgtggtccagaatacttagtccagcgtgcaaccgtgcgtgtttctgcc1020
tccgatgcacgtattgccgtccgtttgaagcgttggatcgaccctgcaaaatggggttgg1080
tattctggtgatacccacttacatgccgcaggttgtgcccactacatgttgcc犯ccgag1140
ggtgtggcacctga犯ccatgattcgtcatatccgtggtgaggccttatccgttggtgaa1200
gtcttgacctgggc鄉tggttattcttacca犯agcagtttttctccggtgccgcaatt1260
tctcc卿ggcccgtttaga3C3CCCtC犯ttgC3ggC8gccaataacgcagactggaaa1320
cc犯tgcctaCCCC333gg3tcgtgagtcc3tgtt3Cgtt3tg3Cttgg8朋tctctggt1380
tttccttcctctttatccggtcatttgattttaatgcgttatcttaccca1440
ggtacccacgccgtgga卿ttggccttcctggaatttgcC3gttgC3犯gtgggcceiaa1500
gcac卿gtgccttagtcggttatacccattgctctttcggt3tg3tCgtgggtaccaac1560
gcattgcctaattacgagattccaacctttaactccgttgagccatcgtc1620
ggtgtgacccacggtgcagttgacttcttagccggttgtaacggtcctccagcagccgag1680
ttgeiatgcatggtatcatttattgaactgcggttacaccttaatgatggccggtga犯cc1740
gattatccttgtattgtcccatctgtggactcccgtcctggtatcggtcgtacctacgtt1800
aagttgccacagcgtcctgtcgatgacgcaggttottctgCCtgggtgg￡ltggttt卿g1860
肌tggtcacttgtactggggtgacggtcgtacccattttttacacttcaccgttaacggt1920
cgtg犯tccggt肌acaaccattggcatttgtccgtgcctctaatgtgcgtgtttccgca1980
accattgccgcaatgttagagttgaccccttctccagaaaCCgtCC3gMcgcctccgag2040
gaaccttggcatatcgagcacgcacgtattggtaattctcg恤ggtggcCgttg￡L￡Ltt￡L2100
atcgtcaacggtgtggcagttaaacgtcaag卿tgttggccgatggttccttacagcaa2160
atttctttcacgaccgttcctcttggattgcaatgcgtgtcttgggttcc2220
ggtC3t8CCtatccagtgtttgttaccatcggt朋t幼gcctattcgtgcctctcgtcgt2280
tCCgC3g3gtggttacgtacctgcgtcgatgccttgtggactctttaatc2340
30cgtgacaccg agttggcaga tgccgcagcc gcatacgacc atgcccgtca gacctatgat 2400 cgtattatcg cagaatccga cttaacctaa gcggccgc 2438
<210> 9 〈211> 30 <212> ■
<213> artificial sequence <400> 9
gcccatatgg aattccacca tcaccatcac 30
〈210〉 10 <211〉 36 <212> DNA
<213> artificial sequence <400〉 10
ggcgcggccg cttagatggt aacaaacact ggatag 36
<210> 11 <211> 35 〈212>賺
〈213〉 artificial sequence <400> 11
ggcgcggccg cttagttcaa taaatgatac catgc 35
<210> 12 <211> 35 <212> DNA
<213〉 artificial sequence 〈400> 12
ggcgcggccg cttagttcaa taaatgatac catgc 3权利要求
1.一种CehA突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有水解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所述的蛋白。
2. 如权利要求l所述的CehA突变体蛋白，其特征在于b)中所述蛋白与SEQIDNO. 1 所述氨基酸序列具有具有至少75 %的同源性。
3. 如权利要求1所述的CehA突变体蛋白，其特征在于(b)中所述蛋白优选自氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5、或SEQ ID NO. 6 所述的蛋白中之一。
4. 如权利要求3所述的CehA突变体蛋白，其特征在于(b)中所述蛋白为氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所述的蛋白。
5. —种编码权利要求l-4任一项所述CeM突变体蛋白的多核苷酸分子。
6. —种包含权利要求5所述多核苷酸分子的重组表达载体。
7. —种包含权利要求6所述重组表达载体的转化体。
8. —种降解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素的组合物，包括权利要求l-4任一项所述 CehA突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。
9. 权利要求l-4任一项所述CehA突变体蛋白在去除或降低氨基甲酸酯类杀虫剂或毒 素残留或污染方面的用途。
10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于所述氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素可为萘基 氨基甲酸酯类、苯基氨基甲酸酯类、氨基甲酸躬酯类、杂环甲基氨基甲酸酯类、或杂 环二甲基氨基甲酸酯类杀虫剂中之一。
11. 如权利要求9所述的用途，其特征在于所述氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素可为克百 威、丁硫克百威、丙硫克百威、仲丁威、异丙威、残杀威、灭多威、硫双灭多威、棉 铃威、苯硫威抗蚜威、双氧威、唑蚜威、速灭威、杀草丹、禾草特。
12. —种权利要求1-4任一项所述CehA突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤① 编码权利要求1-4任一项所述CehA突变体蛋白表达载体的构建；② 编码权利要求1-4任一项所述CehA突变体蛋白转化体的制备； ◎ CehA突变体蛋白的表达；④ CehA突变体蛋白的纯化。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法。本发明公开了一种CehA突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白质；(b)至少与(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有水解氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ IDNO.7所述的蛋白。同时还公开了上述CehA突变体蛋白的基因、重组载体及其用途和制备方法。本发明所述的CehA突变体蛋白活性更高，能有效水解的氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素，并且稳定、易复性，可开发为工业应用低成本和高质量的酶制剂。这为解决氨基甲酸酯类杀虫剂或毒素残留或污染提供了新的选择。
文档编号A62D3/00GK101684459SQ20081004379
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者杨柏成 申请人:上海普天欣生物技术有限公司