专利名称：一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
随着消费者对食品卫生和安全性的普遍关注和研究者对霉菌毒素研究的不断深入，原料和饲料中的霉菌毒素污染情况也日益引起动物营养界和饲料界的重视。有调查显示中国饲料和原料霉菌毒素污染超标的比例为60% 70%，其中呕吐毒素的超标比例接近70%。王若军等(中国饲料及饲料原料受霉菌毒素污染的调查报告，饲料工业，2003，24 (7):53 54)对我国28个省市自治区194份饲料及原料玉米、麦麸的调查结果显示，呕吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮的污染率分别为50.0%、18.1%和26%。王金勇等(2012年中国饲料和原料霉菌毒素检测报告，《中国畜牧杂志》，2013年第4期，29 34页)对2012年我国各地841份饲料和原料样品进行检测，发现目前饲料和原料中主要存在的霉菌毒素是呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、烟曲霉毒素及黄曲霉毒素。其中呕吐毒素阳性检出率和平均值最高。呕吐毒素(vomitoxin)广泛存在于大麦、小麦、玉米和燕麦等粮食和饲料原料中。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。不同动物对呕吐毒素的敏感程度不同，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，断奶仔猪尤其敏感。饲料中0.3 0.5mg/kg的微量毒素就会引起猪拒食、生长下降以及对传染病的抵抗力下降，饲料中含lmg/kg以上的呕吐毒素时可引起猪拒食、嗜睡、生长严重受阻、体增重减慢、免疫机能减退、肌肉协调性丧失以及呕吐等症状。此外，呕吐毒素可在人和动物体内蓄积，可诱发急性或慢性疾病，具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。在我国河北省食管癌胃癌高发区居民饮食中污染率和含量均相当高。
呕吐毒素对畜牧业及人类产生如此严重的危害，因此自上个世纪呕吐毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的预防和解毒、去毒方法。迄今为止已知的去除饲料原料中呕吐毒素的方法包括物理、化学和生物学法。物理、化学脱毒方法，在实际应用中对于目前饲料业、养殖业而言均不适用。因其操作困难，且大批量的饲料及原料用此类方法无法进行，而且经化学脱毒处理后往往会降低饲料的营养品质和适口性，目前还没有切实有效的防止饲料霉菌毒素污染的方法。微生物或生物酶因其反应的准确性、有效性和环保性而成为人们关注的热点。目前筛选和分离得到的能降解呕吐毒素的芽孢杆菌数量极少，且未见芽孢杆菌降解饲料中的呕吐毒素和对菌株抗逆性功能的特性研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。为了实现本发明目的，本发明提供一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ANSB471，该菌是从发霉的粮食中筛选出的一株具有高效降解饲料中呕吐毒素的枯草芽孢杆菌，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2013年3月21日，保藏号CGMCC N0.7344。上述枯草芽孢杆菌ANSB471的培养方法:取活菌浓度为109CFU/mL的枯草芽孢杆菌ANSB4710.5-2.5mL (优选lmL)，接种于50_100mL (优选50mL)培养基中进行摇瓶发酵培养，即得枯草芽孢杆菌ANSB471的发酵液。所述发酵培养基由如下组分组成:胰蛋白胨8_12g、酵母浸膏1.5_3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5_4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，加蒸馏水至800-1200mL，pH值7.0-7.4。优选地，所述发酵培养基由如下组分组成:胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、蒸馏水IOOOmL,pH 值 7.2。所述摇瓶发酵条件为:发酵温度30-40°C，发酵时间16-24h，转速180_220r/min，pH值7.0-7.4。优选地，所述发酵条件为:发酵温度37°C，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间 20h。 枯草芽孢杆菌ANSB471的微生物学特性见表I。表1ANSB471的形态和理化特征
权利要求
1.一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ANSB471，其保藏号为CGMCC N0.7344。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌ANSB471的培养方法，其特征在于，取活菌浓度为109CFU/mL的枯草芽孢杆菌ANSB4710.5-2.5mL，接种于50_100mL培养基中进行摇瓶发酵培养，即得枯草芽孢杆菌ANSB471的发酵液； 发酵使用的培养基由如下组分组成:胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5_4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，加蒸馏水至800-1200mL, pH 值 7.0-7.4 ； 所述摇瓶发酵条件为:发酵温度30-40°C，发酵时间16-24h，转速180_220r/min，pH值7.0-7.4。
3.一种降解呕吐毒素的活性蛋白的制备方法，其特征在于，取权利要求2所述枯草芽孢杆菌ANSB471的发酵液，离心，取上清液，加入2-4倍体积的无水乙醇进行沉淀0.5_2h，离心，将得到的沉淀用0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，离心，将得到的沉淀溶于0.01mol/L PBS缓冲液，冻干浓缩得到降解呕吐毒素的活性蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备所述0.0lmol/L PBS缓冲液的方法为:称取8g NaCl.0.2g KC1、1.44gNa2HP04和 0.24g KH2PO4，溶于 800mL蒸馏水中，用 NaOH调节溶液的PH值至7.5，加蒸馏水定容至1000mL。
5.由权利要求3或4所述方法制备得到的降解呕吐毒素的活性蛋白。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌ANSB471或权利要求5所述活性蛋白在降解饲料中呕吐毒素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求2所述枯草芽孢杆菌ANSB471的发酵液与被呕吐毒素污染的饲料混合，将反应体系的PH值调至7.0-7.4，36-38°C，转速180-220r/min,反应 2_72h ;或者， 将权利要求5所述活性蛋白溶于0.01mol/L PBS缓冲液中，然后将活性蛋白溶液与被呕吐毒素污染的饲料混合，36-380C，转速180-220r/min，反应2_72h。
8.一种动物饲料添加剂，其特征在于，其有效成分为枯草芽孢杆菌ANSB471菌剂或权利要求5所述降解呕吐毒素的活性蛋白。
9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌ANSB471在抗模拟胃液和/或模拟胆盐环境中的应用，其特征在于，取权利要求2所述枯草芽孢杆菌ANSB471的发酵液，加入到模拟胃液和/或模拟胆盐的环境中，36-380C，培养24h，活菌纯活率可达79%-82%。
10.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌ANSB471发酵产生的淀粉酶，其特征在于，产酶方法为:取权利要求2制备的枯草芽孢杆菌发酵液0.5-2mL，接种到产酶培养基中进行发酵，发酵温度为36-38°C，pH值7.0-7.4，转速180_220r/min，发酵时间20_30h，发酵液离心除菌体后得上清粗酶液； 其中，所述产酶培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，可溶性淀粉5g/L，KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, CaCl2.2Η200.2g/L,以水配制。
全文摘要
本发明提供一株高效降解饲料中呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ANSB471及其应用。本发明还涉及该菌株的培养方法，及菌株发酵液用于降解饲料中呕吐毒素的方法，反应72小时后，枯草芽孢杆菌ANSB471对饲料中呕吐毒素的降解率可达到95%，且经传代培养后，对呕吐毒素的降解率仍保持在90%左右。该菌株还能够分泌淀粉酶，且酶活力较高，可提高动物对饲料中淀粉的利用率。本发明的枯草芽孢杆菌ANSB471降解呕吐毒素的活性高、特异性强、作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分。
文档编号A62D3/02GK103243047SQ20131016963
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者计成, 马秋刚, 赵丽红, 李笑樱 申请人:中国农业大学