专利名称：用于无掩蔽制备生物聚合物的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于无掩蔽制备生物聚合物的方法和装置，其中所述生物聚合物通过曝光序列在例如载片上合成。
至今，用于每一单个芯片的成套掩蔽体一直是光控DNA芯片合成所必需的。US5,412,087公开了在表面上按可区域寻址方式对寡核苷酸和其它化学聚合物进行的固定。根据此方法提出，可以使用表面含有具巯基基团和通过光活化可去除的保护性基团的成分的基质，制备具有固定化的抗配体物(例如寡核苷酸或其它生物聚合物)的域(field)。这些域可以用于检测液体样品中是否存在互补核酸。对表面上预先确定的区域进行的可区域寻址照射允许在活化的表面区域中固定寡核苷酸和其它生物聚合物。在该表面的不同表面区域上进行的照射循环和对各种抗配体物进行的固定使得可以在表面的某些位置上形成抗配体物的固定化基片。该抗配体物的固定化基片使得可以同时彻底地寻找液体样品中对该基片中的某些抗配体物具有极高亲和力的配体。
在此处提及的方法中，使用发射波长在280-420nm范围内的光源通过掩蔽体照射该基体的表面，在此处可以使用各不同的掩蔽体以便仅选择某个预先选择的区域进行照射。
US5,744,305涉及用于域形式的支持物的材料。这些材料被用于制备化学发散基质的合成策略中。为了实现按区域平行前进的光控化学合成过程，可以使用具有光活化保护作用的分子基团。在工作例的上下文中使用了二元掩蔽技术。在公开的此方法中，使用经过屏蔽的照射源或借助活化剂平行地合成各种化学成分。曝光的方式确定了预备进行化学反应的载片区域。这时，为了在所有情况下都可以选择载片上的不同区域进行曝光，也可以使用掩蔽技术。
US5,143,854涉及光刻合成多肽的方法并涉及寻找方法。在此方法中，在基质上合成多肽域，其中在该基质表面上施用了光活化基团，为了活化基质的某些区域，可以将这些区域暴露于光线。向按此方式活化的区域施用具有光活化基团的氨基酸单体，重复活化和添加步骤直到合成期望长度和序列的多肽为止。所获域可以用于选择那些能够与受体结合的肽。
在US5,143,854中，除了已讨论过的掩蔽法外，还提出了将二极管光源用于曝光并提出根据待曝光的部分对待曝光的基质进行曝光。在此过程中，为了尽可能精确地定位该基质以便使待曝光的区域与发光二极管相对应，复杂的机械控制机制是必需的。必须每次都对待曝光的每个新域重新进行该机械定位。
上述用于获得设定位置的控制机制对制造的精确性提出了极高的要求。
除了对载片上待曝光的生物聚合物区域进行掩蔽外，WO99/42813中还公开了在所有情况下借助具有可控微镜(micromirror)的排列对DNA序列或多肽等进行曝光，在此这些微镜形成一个由可电子寻址的单个微镜组成的相干域。普通光源被用于此。位于载片上的生物聚合物以某种方式被活化，由此在所有情况下相继提供的单体单元将与这些受控区域偶联。继续该过程直到所有情况下基质上的二维域的所有单元均与所期望的单体反应为止。可以例如联合DNA合成仪一起，对该微镜域进行控制，以便通过该微镜域的调整使成像序列与施用于该载片上的液体样品相配合。
在所述掩蔽方法中，为了使定点合成成为可能，使用光活化单体单元或光活化表面。光的作用是用于除去单体单元或表面的光活化基团以便随后的合成或固定步骤能够在光作用位置处发生。为了使光仅照射在相应合成或固定步骤所需要的位点上，可以使用掩蔽体或可以控制微镜域。
例如，对于光控寡核苷酸合成，如果从全套4种不同碱基将n个核苷酸连接起来形成具有n个碱基的序列，则需要4×n个掩蔽体。如果光控合成具有整套20种氨基酸的序列长n的肽，则需要20×n个掩蔽体。对于成套的此类掩蔽体，既要提前提供，又必须在曝光过程中对其进行精确的调节。这需要相当大量的技术支出，以致由于每次新的合成都必须提供新的成套掩蔽体，所以对于小的系列而言不值得使用该掩蔽法。
US5,143,854公开了可调制光源，该光源使得可以以相应的机械支出平动调节载片。缺点也是以下事实，即仅能够相继地而不能平行地进行曝光。
本发明的基本目的是一种可行的合成生物聚合物的方法，该方法简单而且使得可以进行无掩蔽曝光和活化接受生物聚合物的载片的各个区域。
根据本发明，该目的通过权利要求1和15的特征得到实现。
根据本发明提出的实施方案的优点在于具有不同的性质。使用极为简单的手段，可以合成生物聚合物阵列，例如寡核苷酸和肽阵列。而且，可以以光控方式固定生物聚合物；无需掩蔽，而且完全不需要用于预备和设置掩蔽体的工作步骤。由于取消了掩蔽体，与掩蔽体连接的调节序列也是完全不需要的。用于控制单个合成位点的复杂昂贵机械置换表和复杂的定位设备均是不需要的。所有曝光步骤均可以平行地进行；而且，由于无需掩蔽体，可以利用根据本发明提出的方法非常经济地进行单个或小系列的合成。
在根据本发明的方法的有利实施方案中，可以在表面上合成核苷酸和肽。此外，在所有的情况下均可以将生物聚合物固定在表面上。生物聚合物应理解为是指例如核酸、其类似物(如PNA、LNA)、氨基酸、肽、蛋白质、糖、以及这些的组合。优选利用运算单元自动地控制具有9、16、25或达到100或更多个发光二极管的发光二极管阵列中发光二极管的开关。该运算单元含有在所有情况下期望的储存形式的照射排列。
借助运算单元，还可以输入曝光时间，即单个发光二极管照射载片选定区域的期间。优选地，使用那些能发射UV范围内高能射线的发光二极管。为了通过降低活化或固定的时间来缩短合成过程，可以利用含有大量发光二极管的发光二极管阵列同时进行曝光处理。此外还可以设置曝光处理的先后顺序。
例如，可以通过借助计算机的并行接口控制发光二极管，以实现对该发光二极管阵列中大量发光二极管的同时控制。在考虑储存在运算单元中的各曝光时间的次序时平行进行的曝光循环将相当大地缩短生物聚合物的合成时间。用于在其上合成生物聚合物的基质在给料装置(feedarrangement)中位于光发送区域之下。例如，可以将该给料装置装配成流通池形式，在该流通池中可以相继地提供进行合成所需要的化学药品。可以首先将阵列各域的各自待合成序列输入控制计算机中。使用适当的程序，根据这些规定，计算机按相继和循环供应各单体的相关方式控制该发光二极管阵列中的各发光二极管。
优选地，曝光和化学合成在空间上是分开的，以便排除曝光过程中任何外在的干扰影响。
除了待单独合成的生物聚合物的前序列外，还可以在运算单元中储存可自由选择的生物聚合物的固定位置的先后顺序。
借助于根据本发明提出的装置，可以通过计算机支持的对各个发光二极管的平行控制，无需掩蔽，平行地光控合成或固定生物聚合物。优选地，将这些发光二极管设计为能发射UV波长范围内光的发光二极管。对于按几何比例确定生物聚合物阵列的大小，可以例如以期望的比例对发光二极管阵列进行光学摄像。为此，相应地使用适当的光学装置。
以下借助附图对本发明作更为详细的说明
图1显示了具有例如4×4可单独控制的发光二极管以及电控制线路的域，图2显示了使用4×4发光二极管阵列合成的寡核苷酸阵列在杂交后的荧光图像，图3显示了为了确定足够长的曝光时间，使用3×3发光二极管阵列以4个不同的灵敏度得到的4个表面荧光图像，图4显示借助2×2发光二极管阵列在芯片表面进行的序列合成。
在图1中，以举例的方式显示了具有例如4×4个可单独控制的发光二极管和相关的控制电路的域的顶视图。
图1示意性地显示了位于载片12或位于芯片表面19下方的发光二极管阵列1。图1所绘排列是含有16个可独立电控制的发光二极管2的发光二极管排列1；在所示发光二极管2中，更为详细地显示了可以被控制用于例如16个DNA序列之一的发光二极管A1、B3和D4。
通过不同的控制线路4，可以对发光二极管阵列1的发光二极管2进行任何控制，其中各个发光二极管2与供电部分8连接。而且，在所有的情况下，发光二极管阵列1的各个发光二极管2均与电阻器5相连，线路从电阻器处进一步延伸至存储单元6和7。存储单元6和7本身可以通过运算单元22上提供的并行接口10来控制。
此处仅示意性显示了计算机22和其并行接口10，在此计算机中可以储存各种数据文件，例如DNA序列20以及除去对光不稳定的保护基团所必需的曝光时间或者固定位置的先后顺序。而且，合成生物聚合物如寡核苷酸或肽所必需的那些化学品也可以由运算单元22提供，在此在除去不稳定的光保护基团后，根据待处理的序列，这些化学品在精确指明的曝光位置发生反应。通过将化学品的供应和相关曝光位置与测序联系起来，可以通过使用运算单元22的并行端口10同时对大量的曝光位点进行曝光。
例如，可以使光控合成在可以设计为例如流通池的给料装置中发生。流过流通池的、合成所需的化学品物流由例如运算单元22的DNA合成仪控制。在此，DNA序列20以例如储存的数字形式存在于数据文件中。
在流通池内发生的合成循环中，为了规定在哪个位置缩合4种核苷酸单位(脱氧腺苷酸、胸腺嘧啶、脱氧鸟苷酸和脱氧胞嘧啶)中的哪一种，必须在指定时间除去基质支持物上的光不稳定保护基团。光不稳定保护基团的去除是必须的，因为只有在除去它们之后才能合成和构建DNA寡聚物。在待除去的光不稳定保护基团的位置上，由根据图1的发光二极管排列1对基质支持物进行曝光。优选将发光二极管排列1的各发光二极管2设计为可独立电控制的发光二极管2。这些发光二极管发出极高能量的射线，优选在紫外线范围内，具有360nm波长。然而，也可以使用其中所包含的各发光二极管2发射其它波长(即不同于UV范围的波长)射线的发光二极管排列1。发光二极管2的最佳波长应与所用的光化学配合。
通过控制发光二极管排列1的各发光二极管2，可以确定在基质支持物的哪个位置除去光保护基团以便可以添加待偶联的核苷酸单位。对于此，图1通过举例的方式，挑选出命名为A1、B3和D4的三个发光二极管2。命名为A1、B3和D4的发光二极管2所发出的高能射线优选到达给料装置的基质支持物位置，并在由此精确规定的位点去除不稳定的光保护基团。根据用于支持物的基质、并根据待产生的序列，曝光时间可以是不同的。由发光二极管的打开时间确定的不同曝光时间同样也可以被储存在运算单元22的数据文件中并以此方式并入所述曝光程序中。
通过控制相应于位置A1、B3和D4的发光二极管2，可以去除基质支持物这些位置上的保护性基团，以致在合成步骤中也只有在这些明确位置处基质支持物上能发生链伸长。例如，在随后的合成步骤中，可以除去例如位置A4、B2和D1处基质上的光不稳定保护基团，以便在除去保护性基团所必须的曝光时间期满后，通过流通池供给单体单元和链伸长只能够在这些位点处进行。
利用此处所列方法，将发光二极管排列1用作具有多个独立光源的域，而无需针对每个基质支持物或每个芯片表面19的各成套掩蔽体。利用计算机支持的对各发光二极管在曝光作用时间和曝光位点的预先选择方面的独立控制，根据计算机22中储存的序列数据文件，还可以有利地合成小的系列。
由运算单元22控制的发光二极管排列1具有曝光功能和掩蔽待曝光区域的功能，因此完全不需要重新配置掩蔽体。过去，在掩蔽步骤后，合成期间掩蔽体的重新定位不精确导致了以此方式合成的生物聚合物单位中有相当多的质量缺陷。
图2显示了合成的寡核苷酸阵列，该阵列是使用4×4可单独电控制的发光二极管2合成的。除了此处所示的发光二极管阵列1构型外，该阵列还可以任意地含有许多例如25、400或高达几千个发光二极管形式的独立发光源，在此处无论这些发光源被安排为正方形、长方形、环或圆，其均可以是开放的。图2所示阵列是通过使用荧光标记的互补链探针进行杂交而获得的荧光图像。
图3显示了4个表面荧光图像的全貌图，在每个情况下这些图像是使用4个不同灵敏度拍摄的。为了确定充足的曝光时间，使用了3×3发光二极管阵列1。这4个图像显示了以检测性扫描仪的4个不同灵敏度拍摄的相同阵列。
尽管在使用15、16的低灵敏度拍摄的表面荧光图像14、3.1和3.2中没有包含信号，但使用17或18的较高灵敏度可以清晰地分辨显示在图3.3和3.4中的表面荧光图像。信号的强度与在指定的照射期间基质支持物12上各个位置的不稳定光保护基团的切割效率成比例。照射进行1、3、5、7、10、13、15、20和30分钟。照射后通过共价键合Cy5亚磷酰胺可以观察到由于照射引起的光保护基团的成功去除。
图4.1和4.2显示了使用含有4个独立的发光二极管2的发光二极管排列1在表面19上进行的序列构建。
在19的显示为较亮部分的4个位置中，利用光控制DNA芯片合成法构建了序列d(CGCTGGAC)，见表面荧光图像14，这些荧光图像是使用16、18的不同灵敏度拍摄的。对此，我们使用了含有4个独立的发光二极管2的发光二极管阵列1，这些二极管发出紫外线波长范围内的射线。图4.1和4.2所示图像是使用不同敏感度的扫描仪拍摄的。序列CGCTGGAC的DNA芯片合成是使用2×2UV发光二极管排列1进行的，该序列与荧光标记的GTCCAGCG杂交，曝光10分钟。
所示图4.1和4.2是在与互补5’-Cy-5-标记的探针杂交后在荧光成像装置中扫描后获得的。
参考符号列表1.发光二极管阵列2.单个发光二极管3.域边界4.控制电路5.电阻器6.存储单元7.存储单元8.供应电压部分9.接地10.并行接口PC11.接口线1至2512.载片13.侧边14.表面荧光图像15.灵敏度低16.灵敏度较高17.灵敏度高18.灵敏度极高19.芯片表面20.序列d(CGCTGGAC)21.序列位置22.运算单元A1发光二极管位置B3发光二极管位置D4发光二极管位置
权利要求
1.一种在表面上光控合成生物聚合物的方法，其包含通过可电控制的发光二极管(2)的排列(1)的成像，选择并活化固体支持物上的区域。
2.根据权利要求1的方法，其中生物聚合物被固定在载片(12，19)上。
3.根据权利要求1的方法，其中根据储存在计算机(22)中的序列数据文件(20)单个地控制这些发光二极管。
4.根据权利要求1的方法，其中各发光二极管(2)发出UV范围内的高能射线。
5.根据权利要求1的方法，其中借助发光二极管(2)同时对许多区域进行曝光。
6.根据权利要求1的方法，其中该曝光是相继进行的。
7.根据权利要求1的方法，其中利用运算单元(22)的并行接口(10，11)控制发光二极管阵列(1)中的发光二极管(2)。
8.根据权利要求1的方法，其中待在其上合成生物聚合物的基质在给料装置中位于透光区下。
9.根据权利要求8的方法，其中相继地供应合成所需的化学品并在给料装置中进行曝光。
10.根据权利要求1的方法，其中曝光在空间上与化学品的合成分开发生。
11.根据权利要求2的方法，其中固定位置的先后顺序被储存在计算机(22)的数据文件中。
12.根据权利要求1的方法，其中使用适当的光学成像方法，按几何比例将生物聚合物阵列放大到发光二极管阵列(1)上。
13.一种具有曝光源的、用于在载片(12，19)上光控合成生物聚合物的装置，其中给载片(12，19)指定了由可电控的发光二极管(2)组成的曝光排列(1)。
全文摘要
本发明涉及在表面上光控合成生物聚合物的方法和装置。在此方法中，通过可单个电控的发光二极管的排列(1)进行成像在表面上形成单个序列(20)的分布图案。
文档编号C07K1/04GK1413126SQ00817494
公开日2003年4月23日 申请日期2000年12月27日 优先权日1999年12月23日
发明者H·艾佩尔, M·拜尔 申请人:巴斯福股份公司, 德国癌症研究中心