专利名称：周期性抗微生物肽的制作方法
技术领域：
本发明包括一种合成周期肽(periodic peptide)的新方法，以及这种肽本身，和这些肽在如抗微生物剂、杀菌剂、抗病毒或抗肿瘤药剂等多种治疗用途，以及其它治疗、消毒、防腐之类中的应用。
背景技术：
在包括哺乳动物、鸟类、爬虫类、昆虫、植物和许多微生物的多种类型的生物体的天然防御机制中，抗微生物肽是常见的成分。天然生成的抗微生物肽是长度为大约10到50个氨基酸的单一序列。这些肽一般富含碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，因此通常为阳离子化的(cationic)。它们实际上也常常是两亲性的(即分子的一部分是亲水性的，而另一部分是疏水性的)。
尽管经过了广泛的研究，抗微生物肽的作用方式仍然是科学界争论的主题。在许多情况下，数据表明这些两亲性肽在膜上组织起来形成孔或通道(Durell(1992))。在其他试验中，抗微生物肽表现为通过与膜缔合形成“地毯状物”而使膜破裂(Gazit(1995))。任意一种机理都通过令细胞膜去极化和基本细胞成分流失的方法使细胞破裂并杀死细胞。
微生物选择性源于哺乳动物和微生物的细胞之间关于膜的脂类组成的差别。哺乳动物细胞膜的外层几乎完全由主要为卵磷脂、鞘磷脂和胆固醇的电中性的两性离子磷脂组成。相反，细菌膜主要由诸如磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油带负电荷的磷脂组成。因此，细菌细胞对带阳离子的抗微生物肽敏感，而哺乳动物细胞却无此现象。也有一些迹象表明，癌细胞的膜成分与普通的哺乳动物细胞不同，这令肿瘤细胞对抗微生物肽敏感。
人们还认为，抗微生物肽具有抗HIV、单纯疱疹和细胞肥大病毒之类病毒的功效。但是，其机制略有不同。由于最外层的蛋白外壳，病毒通常对膜破坏机制免疫，但是多种抗微生物肽显示出通过阻碍病毒与宿主细胞壁融合(从而阻止病毒的遗传物质传递到宿主细胞内)，或者一旦宿主细胞壁被破坏时抑制病毒复制的机制而抗病毒的活性。
考虑到病原体具有抗药性的普遍现象，如果能够经济地生产抗微生物肽，人们对采用抗微生物肽作为传统的小分子药物的替代品很感兴趣。但是，大量生产抗微生物肽是昂贵的，这实际上限制了抗微生物肽的大规模使用。例如，由于肽具有单一序列，因此肽的合成非常昂贵。必须将每一个氨基酸添加到生长的肽链上，其效率通常达不到最佳。因此，随着链长度的增加，其产率在下降。
蛋白质的重组生产相对于固相合成具有一些优点，包括序列忠实性、方便、成本低，以及能够生产较长的蛋白质。但是，重组技术不能普遍应用，而且由于抗微生物肽易于杀死多种宿主细胞，重组生产抗微生物肽尤其困难。甚至当合成为非活性融合蛋白时，蛋白前体必须被切割以释放活性肽，且通常需要进一步纯化。这些附加的步骤提高了成本并降低了重组蛋白质的产率。
Pittsburgh，PA的Demegen公司拥有几种为医用而开发的肽。一种是以商品名DEMEGELTM开发的D2A21(FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF)。这种单一抗微生物肽是一种使用4和3个氨基酸群以保持极性和非极性面成直线(3.6残基/圈)的两亲性α-螺旋肽。其通过传统方法——每次一个氨基酸——合成。
D2A21具有抵御多种细胞类型的活性，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)、沙眼衣原体(C.trachomatis)和铜绿假单胞菌(T.aeruginosa)。初步结果已经证实了在大鼠前列腺癌模型中的抗肿瘤活性，以及存活率由25％提高到75％，而且没有引起任何明显的毒性。尽管对该活性的基本原理还不确定，人们认为，肿瘤细胞膜与正常细胞的细胞膜完全不同，因此更容易被抗微生物肽溶解(Arlotti(2001))。最后，已经表明D2A21具有抵御单纯疱疹病毒(HSV)的活性。当与经过修饰的类脂辛基甘油混合时，D2A21比其它五种抵御HSV的肽(包括爪蟾抗菌肽和防卫素)更好。
尽管前途光明，必须每次加入一个氨基酸地合成类似D2A21的肽，其成本大约为每克50到500美元。作为另一个例子，乳链菌肽是一种用于加工乳制品的抗微生物肽，其活性肽的销售价格大约为每磅6000美元。
一种可供选择的方法是设计具有多个氨基酸重复单元的肽。可以比合成长链肽更为廉价地合成氨基酸的短序列，并将重复单元寡聚以获得完整的肽长度。近年来，采用这种方法的成果包括US5789542和Javadpour(1996)。这些参考文献教导了可聚合为14和21个残基肽的7个残基(七聚物)的重复单元(其)可以生成抗微生物肽的基本成分。通过使用该七聚物，生成了“模拟的”，每圈具有3.5个氨基酸的α-螺旋。但是，七聚物的合成仍过于昂贵，因此限制了这种方法。
合意地存在一种方法，能够廉价地生产具有可与单一肽相比的含有抗微生物活性的肽。更合意地，由此方法合成的抗微生物肽无需忠实于传统的α-螺旋结构，以至于少于7个残基的小型重复单元可以用于组成最终的肽。因其简易，可以廉价地合成这种肽，且这种肽仍具有显著的抗微生物活性。
发明概述本发明包括一种抗微生物周期肽的合成方法，并进一步包括这种肽本身及其多种用途。
在一种优选实施方案中，由4个或更少氨基酸的单体单元合成简单的肽。同样的单体单元首尾相连，直到达到大约15-16个氨基酸的最小尺寸。通过设计仅仅使用四聚物(4mer)、三聚物(3mer)或二聚物(2mer)单体的周期肽，与传统的定制合成法相比充分降低了生产成本。此外，即使给定的肽在每剂量基本成分的性能方面活性略低，其明显较低的生产成本仍能降低每单位剂量的成本。
可以通过合成的方法或通过微生物、病毒或酶表达法生产单体。该单体越小，制备的成本越低。二聚的单体单元可以以低价格商业购得因而特别优选。同样的单体可以逐一多聚，以控制最终的尺寸，或者多聚为混合物，随后选择尺寸。可供选择的是也可以使用不同尺寸的混合物，而且这是尤其优选的具体实施方式
。
每个单体应含有带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸等等。该单体还应含有疏水性的氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸等等，优选含有至少一种具有大侧链的疏水性氨基酸，例如苯丙氨酸。但是，当针对水疗法比较肽活性时不能发现清晰的趋势。
优选至少25％的(以数量计，而不是重量)为带正电荷的氨基酸，优选至少为30％。对含有75％阳离子残基(cationic residues)的周期肽的抗微生物活性进行了检测。
所得肽的总链长优选为至少14到16个氨基酸，但是在小至4个残基的肽中仍检测到活性。在活性方面尺寸的上限还没有发现，但是即使是有活性的，据认为，非常大的多聚体容易遇到稳定性或内吸收输送问题。因此，我们建议实际限制为大约50、80或100个残基，而且初步结果表明长约80个残基的肽是有活性的。所得肽的总链长更优选为长约14到40、或16到36、或20到24个氨基酸。
该肽可以含有具有上述性质的天然的或合成的氨基酸。可以用D型或L型氨基酸合成这些肽。用D型氨基酸合成的肽的优点在于不易被蛋白水解降解。混合的肽应主要为D型(80％)，以便利用此特性。也可以利用非肽键以提高“肽”的稳定性。此处测试的肽并未封端，但具有自由的氨基和羧基末端。但是，如果需要可以采用封端和衍生。
“抗微生物活性”指小于或等于125微克/毫升的IC50的水平的抵御细菌、酵母、真菌和其它原生动物的活性。类似地定义抗细菌和抗真菌活性。“生物杀伤活性”指24小时时3.5对数杀伤(“Biocidal activity”means having killing activityof less than or equal to 125 ppm for 3.5 log kill at 24 hr)等于或低于125ppm的杀伤活性。“抗病毒活性”指IC50低于5mM、优选低于1mM时抵御病毒的活性。“抗肿瘤活性”指低于或等于250微克/毫升的TX50或(50％中毒量)水平的抵御肿瘤细胞的活性。
按照通常的方法可以合成许多周期性抗微生物肽。单体的通式为P2N2、P3N、PN2、P2N和NP，其中P为任意的阳离子残基，N为任意的疏水性残基，且N和P残基为任意次序(就所有情况而论，在所给单体中，第一和第二个P或N残基可以相同或不同)。优选序列包括PNNP、NNPP、NPPN、PPNN、PNPN、NPNP、PNP、NPP、PPN、NPN、PNN、NNP、NP和PN。优选地，P可以是K(赖氨酸)、O(鸟氨酸)或R(精氨酸)的任何一种，N可以是A(丙氨酸)、F(苯丙氨酸)、G(甘氨酸)、L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、T(苏氨酸)、Y(酪氨酸)、W(色氨酸)、V(缬氨酸)或M(甲硫氨酸)的任何一种。
周期肽具有多种用途，包括农业的(在牧场、果园、葡萄园、花园等中使用，用于控制细菌、真菌和病毒的疫情)；收获后谷物、水果和蔬菜的处理；兽医用途；个人卫生产品；婴儿产品；沐浴露；坚硬表面消毒剂；治疗传染病和肿瘤的医药用途；皮肤治疗(头皮屑、痤疮、牛皮癣)；药物渗透性增强剂；医疗器材处理；眼部治疗(传染病控制、隐形眼镜消毒、隐形眼镜护理液的防腐剂)；药物防腐(例如疫苗)；个人护理产品保存；家用产品保存；食物加工；肉类加工消毒剂；饮用水、果汁和饮料的防腐剂；以及食物的防腐剂。它们可以是洗涤剂、牙膏、坚硬表面清洁剂和消毒剂；浴室和厨房的清洁剂；除臭剂、纺织品和皮肤护理物等等中的活性成分。
实施例1由商业肽合成商那里定制周期肽用于最初的抗微生物测试。目前为止测试的抗微生物肽包括表1中列示的那些。该肽的末端未封闭(自由的H和OH)。
表1具体的周期肽序列
实施例2抗微生物测试通过按照如下的National Committee for Clinical Laboratory Standard的指导方针的微量肉汤稀释法测定MIC和IC50值在96孔组织培养盘中，将2X肉汤(如下定义)中固定体积的细菌悬液加入到浓度1,000到1微克/毫升之间改变的混合物或单一化合物中，该混合物或单一化合物通过使用无菌水进行系列二倍稀释而获得。测试的细菌为绿脓杆菌美国标准菌种收藏所编号(ATCC)10145、大肠杆菌ATCC 2592和金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林)ATCC 33591。
所有试验与最适生长条件(37℃、pH7.0、没有额外的盐、培养基-被称为标准生长条件)下的细菌生长比较。在每个盘中，检测无生长对照(仅有培养基)、阳性生长对照(细菌与非测试样品)、阳性抗微生物对照(具有已知抗微生物活性的试剂)和测试化合物。阳性对照包括非周期型的抗微生物肽D2A21(FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF)和D4E1(FKLRAKIKVRLRAKIKL)。
将盘培养过夜，使用TITERTEK MULTISKAN PLUSTM在620纳米处测得的光密度(OD620)确定相对生长百分比。MIC被定义为导致98％的生长抑制的测试样品的最低浓度。采用S型曲线拟合软件程序(CRAPHPAD，TMISI Software，TMSan Diego，CA)计算IC50值。一式两份测试所有样品，每次化验重复至少两次。在下表中，KFAK为重复单元，并检测了KFAK的多聚体。以微克/毫升为单位报道IC50和MIC。
表2.(KFAK)n抵御绿脓杆菌的抗微生物活性
出乎意料的是，这些周期肽的表现相当于或优于它们的单一对应物(D2A21)。受到此令人惊讶的结果的鼓舞，合成多种周期肽，并采用同样的实验方案测试其抗菌活性。结果列示在下文中。
表3周期肽和抗菌活性
*PBF16a＝KFAKKFAKKFAKKAAK(非周期性)**PBF16b＝KFAKKFAKKAAKKAAK(非周期性)***PBF16c＝KFAKKAAKKFAKKAAK(非周期性)回顾这些结果，很容易浮现几种模式。首先，由小至二聚体的单体单元合成的周期肽显示出强的抗微生物活性(例如，LK(7-12))，这是很清楚的。考虑到大多数抗微生物肽教导必须保持螺旋结构，并为此使用重复的七聚体，而且几乎不存在具有β折叠的片状结构的抗微生物肽，这一点非常令人惊讶。
其次，这表明，较长的肽比较小的肽更有效。例如，肽应至少为大约14到16个氨基酸以显示最佳效果(将KFAK(1-3)与KFAK(4-8)对比)第三，在许多情况下周期肽表现出比现有技术的单一肽(将D2A21和D4E1与FKAK(5)对比)更好的活性。由于这意味着可以用具有相等或更佳的功效的周期肽取代现有技术的单一肽而充分节约了成本，因此特别有用。
第四，测试的具有相似残基含量的非周期肽未显示抗微生物活性(参见PBF16a-c)。
实施例3抗真菌测试由于周期肽的抗菌活性很有希望，采用进一步实验以确定周期肽是否也具有抗真菌活性。实验设计与上面的相似，为真菌生长的需要作出适应性调节，包括使用沙氏葡萄糖肉汤(SDB)和沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养。
表4周期肽和抗真菌活性
结果表明，一些周期肽能够非常有效地抵御真菌病原体(例如，KFAF(7)，KFK(10))，尽管大多数是种特异的。
实施例4抗肿瘤测试受到周期肽的强抗微生物活性的鼓舞，同样测试肿瘤细胞。采用红血球(RBC)确定周期肽不会杀灭正常的哺乳动物细胞，这明显限制了它们的效力。
RBC实验方案来自于Blondelle(2000)，通常描述如下使用MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，钠盐)细胞减少测定法测定对HeLa细胞系的毒性。在Dulbecco PBS中(pH7.35)制备MTS(2毫克/毫升)，过滤，等分并在-20℃下贮藏。在96孔平底盘中，细胞悬液(每孔中6×104细胞/毫升250微升，)在37℃下培养48小时(5％CO2恒温箱)。随即以通过系列二倍稀释法获得的不同浓度的肽(50微升)加入到细胞单层中(当各个孔中的培养基被抽吸掉，并接着加入50微升的Dulbecco’s Modified Eagles Medium之后)，然后将该盘在37℃下条件下培养24小时(5％CO2恒温箱)。随即在检测前以1∶20的比例将吩嗪硫酸甲酯溶液(PMS在DPBS中0.92毫克/毫升)加入到MTS中，由此测定增殖。向每个孔中加入二十微升MTS-PMS溶液，并将该盘在37℃下培养1小时(5％CO2恒温箱)。比较490纳米时测得的含有每种肽的细胞的吸光度与没有肽的细胞的吸光度，由此确定毒性的相对百分比。使用S型曲线拟合软件(Graphpad Prism)计算TX50(50％毒性所需的浓度)。
表5周期肽和抗肿瘤活性
如期待的那样，周期肽的一部分具有抗肿瘤活性，但不会破坏诸如红血球(RBCs)之类的正常细胞。尤其是二肽LK(8-9，12)表现出极好的前景；杀死HeLa细胞，而不是RBCs。但是，抗肿瘤活性的可预知性比抗微生物活性稍差，在使用前需要针对细胞范围对每种周期肽进行检测。
实施例5生物杀灭测试由于IC50和MIC是易于实施的简单、普通的测试，因而在前面的实验中测量IC50和MIC。但是，这些测试事实上测量的是生物静态(biostat)活性，而不是真正的生物杀灭活性。因此，在本实施例中测量生物杀灭活性。
通过降低试样量、将检测材料组织为阵列结构、确定最大可能数量(MPN)以及使用多通道液体处理装置的方法，改善生物杀灭功效的实验方案。我们称这种新的方法为“高通量微量分析和快速定量”或“HMARQ”。HMARQ直接适用于现有的工业的药效测试，例如多循环保藏激发法或时程消毒测试。
在高通过量盘中实施HMARQ，例如96孔微滴定量培养盘。典型样品的体积已经降低到200至300微升，但是如果需要可以进一步降低。在这些实施例中，不超过总体积的10％包含生物杀灭剂和有机体溶液，对于所有样品来说，所有的非基质添加物均规格化。
首先将合意浓度的微生物接种到样品基质。随后将接种过的样品基质加入到含有待研究的生物杀灭剂的96孔化验模块上。每个样品模块含有生物杀灭剂处理过的样品和未处理过的对照试样(没有生物杀灭剂)。一旦样品制备，通过涡流将样品的整个模块混合，直到每个样品均为均质的。通常，混合一结束就开始研究，并根据分析的需要移动样品。当进行杀灭时间测试(生物杀灭剂活性的速度)时，考虑到快速混合和分析，在将生物杀灭剂加入到样品中之后，加入微生物。
采用最大可能计数法(MPN)测定细菌浓度(CFU/毫升)。将污染的溶液顺序稀释，直到达到“无生长”的终点。终点代表MPN，并以细菌浓度的单位表示。一系列1∶10稀释可以产生1log的细菌浓度分解度，而且通过将处理过的样品中的有机体浓度与未处理的样品中的有机体浓度比较，由此确定对数降低值。例如，如果在细菌生长消失前，样品需要四次1∶10稀释，那么样品中细菌浓度的MPN小于或等于1×104CFU/毫升(1E4)。如果在一系列8倍稀释中的每个孔显示细菌生长，那么MPN大于或等于1×108CFU/毫升(1E8)。这种计算方法通常适于所有非丝状微生物。
培养基包括用于细菌的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和用于真菌的沙氏葡萄糖肉汤(SDB)。其可以购得并按照制造指南制备。指示物培养基是用于细菌的TSB/R和用于真菌的SDB/R。将50微摩尔过滤消毒的刃天青加入到消毒并冷却的培养基中，由此制备指示物培养基。使用胰蛋白酶大豆琼脂盘(TSA)和SDA斜面以提供用于细菌和真菌接种培养。当存在细菌生长时指示物染料呈粉红色或白色。蓝色表明没有生长，紫色表明存在生长并将随附加的时间而溶解。
采用如上所述的HMARQ测试，生成周期肽并检测其杀灭活性。在本实验中，对较宽范围的肽进行了活性测试。15分钟或24小时时3.5对数杀灭需要以ppm(微克/毫升)表示单位，结果列示在下面。
表6周期肽与生物灭杀活性
结果表明，大多数周期肽具有真正的生物灭杀活性。令人惊讶的是，甚至太小以至于不能跨膜的肽也显示了生物灭杀活性(FKA(2)、FKA(4)、LK(2)、LK(4))。因此，周期肽的尺寸的下限实际上可以低至4个残基。
实施例6病毒测试前面的实验证明了杀菌和杀真菌活性，以及抗肿瘤活性。下一个预言性实验将证实抗病毒活性。
唯一的抗微生物肽D2A21，其氨基酸含量类似于本文中展示的肽，已经显示出具有抗微生物、抗真菌、抗肿瘤和抗病毒的活性。类似地，两种充分表征的来自昆虫的天然抗微生物肽——蜂毒肽和天蚕素——已经表现出能够对人类免疫缺陷性病毒1(HIV-1)有效，对蜂毒肽而言其IC50值在0.9到1.5mM之间，对天蚕素而言其IC50值在2到3mM之间(Wachinger(1998))。因此，我们预言，上面描述的肽的集合也同样具有抗病毒活性。
可以以多种方法测量抗病毒活性，但是一种简单的测定对反转录病毒(如HIV或FIV)效果的方法，是测量反转录病毒的降低的反转录酶(RT)活性，并测定50％抑制浓度，为了有效其应为大约1mM(Jia Ma(2002))。
本文中引用的所有参考文献经此引用，全部并入本文。为方便起见，将参考文献列示在此。
1.Durell SR等人，Modeling the ion channel structure of cecropin，Biophys J.(1992年12月)63(6)1623-31。
2.E.Gazit等人，Interaction of the Mammalian Antibacterial PeptideCecropin P1 with Phospholipid Vesicles，Biochemistry(1995年)34，11479。
3.Arlotti等人，Efficacy of a synthetic lytic peptide in the treatment ofProstate cancer，Urol Oncol.(2001年)6(3)97-102。
4.US57895425.Javadpour等人，De Novo Antimicrobial Peptides with LowMammalian Cell Toxicity，J.Med.Chem.(1996年)39(16)3107-3113。
6.Watchinger等人，Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibitrepilcation of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viralgene expression，J.Gen.Virol.(1998年)(79)731-740。
7.Jia Ma等人，Inhibitory Activity of Synthetic Peptide Antibiotics onFeline Immunodeficiency Virus Infectivity In Vitro，J.Virol.(2002年)76(19)9952-9961。
8.S.E.Blondelle和Karl Lohner，Biopolymer (Peptide Science)，(2000年)卷55，74-87。
序列表<110>陶氏化学公司R·M·斯特罗姆P·J·布龙达塞马<120>周期性抗微生物肽<130>43225-62424USPT<140>to be assigned<141>2004-02-24<150>to be assigned<151>2003-02-24<160>56<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>16<212>PPT<213>周期性肽<400>1Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15<210>2<211>20<212>PRT<213>周期性肽<400>2Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys20<210>3<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>3Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20<210>4<211>28
<212>PRT<213>周期性肽<400>4Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25<210>5<211>32<212>PRT<213>周期性肽<400>5Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25 30<210>6<211>48<212>PRT<213>周期性肽<400>6Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25 30Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys35 40 45<210>7<211>68<212>PRT<213>周期性肽<400>7Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25 30Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys
35 40 45Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys50 55 60Lys Phe Ala Lys65<210>8<211>84<212>PRT<213>周期性肽<400>8Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25 30Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys35 40 45Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys50 55 60Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys65 70 75 80Lys Phe Ala Lys<210>9<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>9Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg1 5 10 15Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg20<210>10<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>10
Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg1 5 10 15Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg20 25<210>11<211>32<212>PRT<213>周期性肽<400>11Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg1 5 10 15Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg Arg Phe Ala Arg20 25 30<210>12<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>12Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys1 5 10 15Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys20<210>13<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>13Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe1 5 10 15Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe20<210>14<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>14Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala1 5 10 15
Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala20<210>15<211>20<212>PRT<213>周期性肽<400>15Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu1 5 10 15Leu Lys Lys Leu20<210>16<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>16Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu1 5 10 15Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu20<210>17<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>17Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu1 5 10 15Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu20 25<210>18<211>32<212>PRT<213>周期性肽<400>18Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu1 5 10 15Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu
202530<210>19<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>19Lys Phe Ala Phe Lys Phe Ala Phe Lys Phe Ala Phe Lys Phe Ala Phe1 5 10 15Lys Phe Ala Phe Lys Phe Ala Phe Lys Phe Ala Phe20 25<210>20<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>20Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys1 5 10 15Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys20 25<210>21<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>21Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys1 5 10 15Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys20 25<210>22<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>22Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys1 5 10 15Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys20 25
<210>23<211>28<212>PRT<213>周期性肽<400>23Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ala Lys1 5 10 15Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ala Lys20 25<210>24<211>15<212>PRT<213>周期性肽<400>24Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys1 5 10 15<210>25<211>18<212>PRT<213>周期性肽<400>25Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys<210>26<211>21<212>PRT<213>周期性肽<400>26Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys20<210>27<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>27
Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys20<210>28<211>27<212>PRT<213>周期性肽<400>28Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys20 25<210>29<211>30<212>PRT<213>周期性肽<400>29Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys20 25 30<210>30<211>36<212>PRT<213>周期性肽<400>30Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe20 25 30Lys Lys Phe Lys35<210>31<211>48<212>PRT<213>周期性肽<400>31
Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe20 25 30Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys35 40 45<210>32<211>63<212>PRT<213>周期性肽<400>32Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe20 25 30Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys35 40 45Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys Lys Phe Lys50 55 60<210>33<211>6<212>PRT<213>周期性肽<400>33Phe Lys Ala Phe Lys Ala1 5<210>34<211>12<212>PRT<213>周期性肽<400>34Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala1 5 10<210>35<211>18<212>PRT<213>周期性肽
<400>35Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala<210>36<211>21<212>PRT<213>周期性肽<400>36Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala20<210>37<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>37Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala20<210>38<211>27<212>PRT<213>周期性肽<400>38Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala20 25<210>39<211>30<212>PRT<213>周期性肽<400>39Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe
1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala20 25 30<210>40<211>51<212>PRT<213>周期性肽<400>40Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys20 25 30Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala35 40 45Phe Lys Ala50<210>41<211>63<212>PRT<213>周期性肽<400>41Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe1 5 10 15Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys20 25 30Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala35 40 45Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala Phe Lys Ala50 55 60<210>42<211>4<212>PRT<213>周期性肽<400>42Leu Lys Leu Lys1
<210>43<211>10<212>PRT<213>周期性肽<400>43Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10<210>44<211>16<212>PRT<213>周期性肽<400>44Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15<210>45<211>18<212>PRT<213>周期性肽<400>45Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15Leu Lys<210>46<211>20<212>PRT<213>周期性肽<400>46Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Leu Lys20<210>47<211>22<212>PRT<213>周期性肽<400>47Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15
Leu Lys Leu Lys Leu Lys20<210>48<211>24<212>PRT<213>周期性肽<400>48Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys20<210>49<211>36<212>PRT<213>周期性肽<400>49Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys20 25 30Leu Lys Leu Lys35<210>50<211>48<212>PRT<213>周期性肽<400>50Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys20 25 30Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys35 40 45<210>51<211>14<212>PRT<213>周期性肽
<400>51Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg1 5 10<210>52<211>18<212>PRT<213>周期性肽<400>52Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg1 5 10 15Leu Arg<210>53<211>22<212>PRT<213>周期性肽<400>53Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg1 5 10 15Leu Arg Leu Arg Leu Arg20<210>54<211>33<212>PRT<213>周期性肽<400>54Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys1 5 10 15Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly20 25 30Lys<210>55<211>45<212>PRT<213>周期性肽<400>55Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly20 25 30Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys35 40 45<210>56<211>21<212>PRT<213>周期性肽<400>56Lys Thr Lys Lys Thr Lys Lys Thr Lys Lys Thr Lys Lys Thr Lys Lys1 5 10 15Thr Lys Lys Thr Lys20
权利要求
1.一种抗微生物肽，包括具有2、3或4个残基的重复的同一单体单元的周期肽，n其中所述的抗微生物肽的最小长度为4个残基，具有25-75％阳离子残基，并且其它残基为疏水性残基，所述的抗微生物肽的IC50≤125微克/毫升。
2.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽的最大长度为80个残基，最小长度为14个残基。
3.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽是具有不同长度的抗微生物肽的混合物。
4.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的疏水性残基具有大的侧链。
5.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽24小时时3.5对数杀灭的生物杀灭活性为≤125ppm。
6.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽测得的抗病毒活性IC50为≤5mM。
7.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述的单体为二聚体，并且抗微生物肽的抗肿瘤细胞活性TX50为≤250微克/毫升。
8.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述单体选自PNNP、NNPP、NPPN、PPNN、PNPN、NPNP、PNP、NPP、PPN、NPN、PNN、NNP、NP和PN，其中P为任意的阳离子残基，N为任意的疏水性残基。
9.根据权利要求1的抗微生物肽，其中所述单体包括P2N2、P3N、PN3、PN2、P2N和NP，其中P为任意的阳离子残基，N为任意的疏水性残基，N和P残基为任意顺序。
10.一种抗微生物肽，包括a)一种具有重复的同一单体单元的周期肽；b)其中单体选自P2N2、PN3、P3N、P2N、NP2和NP，其中P为任意的阳离子残基，N为任意的疏水性残基，且其中N和P残基为任意顺序；c)其中，抗微生物肽的最小长度为4个残基；d)抗微生物肽抵御靶细胞的抗微生物活性的靶细胞IC50为≤125微克/毫升。
11.根据权利要求10的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽的最大长度为80个残基，最小长度为14个残基。
12.根据权利要求10的抗微生物肽，其所述的抗微生物肽24小时时3.5对数杀灭的生物杀灭活性为≤125ppm。
13.根据权利要求10的抗微生物肽，其中所述的抗微生物肽的抗肿瘤细胞活性TX50为≤250微克/毫升。
14.权利要求10的抗微生物肽，其中所述的单体选自PNNP、NNPP、NPPN、PPNN、PNPN、NPNP、PNP、NPP、PPN、NPN、PNN、NNP、NP和PN，P为K、O或R残基中的任意一种，N为A、F、G、L、I、T、Y、W、V或M残基中的任意一种。
15.一种肽，包括a)一种具有重复的单体单元的周期肽，；b)其中单体选自PNNP、NNPP、NPPN、PPNN、PNPN、NPNP、PNP、NPP、PPN、NPN、PNN、NNP、NP和PN，P为K、O或R残基中的任意一种，N为A、F、G、L、I、T、Y、W、V或M残基中的任意一种；c)其中肽的最小长度为14个残基，最大长度为80个残基；d)肽的抵御靶细胞的抗微生物活性IC50为≤125微克/毫升。
16.一种包括选自序列ID号1至56的序列肽。
17.一种基本上由选自序列ID号1至56的序列组成的肽。
18.一种由选自序列ID号1至56的序列组成的肽。
19.一种药用组合物，其含有权利要求1至18任意一项所述的肽和药学上可接受的载体。
20.一种合成周期肽的方法，包括通过缩聚的方法将具有2、3或4个残基的同样的单体单元低聚，生成抗微生物肽；a)所述抗微生物肽具有≥14个残基的长度；至少25％的阳离子残基，其余残基为疏水性的，并且对于靶细胞的IC50为≤125微克/毫升。
21.一种抑制靶细胞生长的方法，包括向靶细胞使用有效抑制所述靶细胞生长剂量的如权利要求1至18任意一项所述的肽。
22.一种杀灭靶细胞的方法，包括向靶细胞使用有效杀灭所述靶细胞生长剂量的如权利要求1至18任意一项所述的肽。
全文摘要
本发明的一种具体实施方式
包括一种合成周期肽的方法，其具有抗微生物用途，并进一步包括这种肽本身。一种优选的方法包括，由同样的四个或更少氨基酸的单体单元聚合而成的简单的周期肽的合成方法，其中活性肽的最小长度为15或16个残基，其中阳离子残基的最小百分比为至少25％。
文档编号C07K7/08GK1894277SQ200480010299
公开日2007年1月10日 申请日期2004年2月24日 优先权日2003年2月24日
发明者R·M·斯特罗姆, P·J·布龙达塞马 申请人:陶氏环球技术公司