专利名称：海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法，属于高分子生物医用材料。
背景技术：
间充质干细胞(MSCs)在体外培养时表现出多向分化潜能，同时具有体外易分离、培养，并且不表达共刺激抗原B7等特性[Brinchmann JE. Expanding autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells (自体多能骨髓间充质干细胞的扩增)Journal of the neurological sciences, 2008，265 :127-130]，因此是细胞治疗理想的细胞来源，已经广泛应用于再生医学和组织工程领域。但人体组织中MSCs数量极少，约占骨髓有核细胞的0.001% 0.01%，远远不能满足临床治疗的需要[Croft A, Przyborski S. Mesenchymal stem cells from the bone marrow stroma :basic biology and potential for cell therapy (骨髓间充质干细胞基本的生物学性状和细胞治疗的潜力)Current Anaesthesia & Critical Care，2004，15 :410-417]。因此，在保证其细胞功能的前提下，在体外大规模、规范化培养和扩增MSCs成为临床应用的关键。近年来发展的微载体动态培养体系是规模化培养贴壁细胞的新措施，早期微载体多采用人工合成聚合物如聚甲基丙烯酸-2羟乙酯(PHEMA)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等制备。近年来，越来越多的研究者尝试用天然聚合物及其衍生物来制备微载体。天然聚合物来源丰富，在功能适应性、组织相容性、理化性能、 生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。制备微载体常用的的天然聚合物有明胶、胶原、海藻酸盐、壳聚糖、纤维素、葡聚糖等[(a)过琴媛，王辉.微载体培养动物细胞技术的研究进展.微生物学免疫学进展，2007, 35 73-75]。目前常用的以海藻酸盐制备的微载体大多为以二价阳离子如Ca2+、Ba2+、Sr2+等为交联剂的离子交联型水凝胶。但离子交联水凝胶中的二价离子很容易与水凝胶周围介质中的离子(如Na+、K+等)发生交换，而且这一过程很难控制也无法避免，因而此类水凝胶在生理介质环境中因离子交换易解体而失去水凝胶特性。为了克服因发生离子交换反应而引起的微载体的过度溶胀或变形，经常以聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸包覆海藻酸盐微载体或通过自由基聚合和缩合反应在海藻酸盐水凝胶载体表面引入化学交联层对其进行表面修饰，海藻酸盐微载体稳定性显著提高[(a)Darrabie MD，Kendall Jr WF，Opara EC. Characteristics of PoIy-L-Ornithine-coated alginate microcapsules (1 -L- - 氨酸涂层海藻酸盐微胶囊的特征)Biomaterials，2005，26 :6846-6852 ； (b)Mazumder MAJ, Shen F, Burke NAD, Potter MA, Sto ver HDH. Self-cross-1inking polyelectrolyte complexes for therapeutic cell encapsulation (用于治疗性细胞封装的自交联聚电解质复合物)Biomacromolecules，2008，9 :2292-2300]。将离子交联海藻酸盐水凝胶微载体用于扩增MSCs，由于微载体材料不能降解，需用胰酶将细胞消化下来。但有研究表明，酶解过程容易对干细胞染色体组型的稳定性造成不禾1J景i口向[(a)Mitalipova MM, Rao RR, Hoyer DM, Johnson JA, Meisner LF, Jones KL, et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells (保存人胚月台干细胞的遗传完整性)Nature Biotechnology, 2005, 23 :19-20]。同时，MSCs作为细胞治疗或组织工程的种子细胞使用时，动物来源的消化酶成分的混入可能对其临床使用造成潜在的危险性[Zhang J, Skardal A, Prestwich GD. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery(可用于细j^JH 殖和细胞恢复的工程化细胞外基质)Biomaterials，2008，29 :4521-4531]。而更重要的是， 由于微载体多是大孔结构，经三维动态扩增后相当数量的细胞(有时甚至达到40%以上) 存在于载体的内部孔隙中，因此很难通过常规的酶消化方式完全消化下来，从而使最终的细胞产量受到影口向[Bancel S，Hu WS. Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporous microcarriers (共聚焦激光扫描显微镜检测多孑L 微载体细胞分布)Biotechnology Progress，1996，12 :398-402]。因此，有必要从模拟MSCs 在体内生长的三维微环境角度出发，以分子水平设计和制备出细胞相容性良好的新型微载体材料，在温和的生理条件下通过非酶解途径降解载体材料，快速回收扩增后的MSCs。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法。所述的海藻酸盐水凝胶微载体具有优良的生物相容性和体外降解性的特点；其原料来源丰富，制备方法简单易行，成本较低。本发明是通过以下技术方案实现的，一种海藻酸盐水凝胶微载体，其特征在于，该海藻酸盐水凝胶的分子结构式如式1所示，其上附着了壳聚糖、肝素和碱性成纤维细胞生长因子或壳聚糖和纤连蛋白。它的性质为粒径为450 μ m 950 μ m，含水率高，柔软而富有弹性，具有多孔结构，海藻酸盐水凝胶1H-NMR谱图中，在化学位移D = 3. 25和D = 2. 85 的两个振动峰分别对应于胱胺交联桥上-S-CH2-和-CH2-NH-中两个亚甲基的质子。
权利要求
1.本发明是通过以下技术方案实现的，一种海藻酸盐水凝胶微载体，其特征在于，该海藻酸盐水凝胶的分子结构式如式1所示，其上附着了壳聚糖、肝素和碱性成纤维细胞生长因子或壳聚糖和纤连蛋白。它的性质为粒径为450 μ m 950 μ m,含水率高，柔软而富有弹性，具有多孔结构，海藻酸盐水凝胶1H-NMR谱图中，在化学位移D = 3. 25和D = 2. 85的两个振动峰分别对应于胱胺交联桥上-S-CH2-和-CH2-NH-中两个亚甲基的质子，
2. 一种制备权利要求ι所述海藻酸盐水凝胶微载体的方法，其特征在于包括以下步骤·1)将海藻酸钠加入PH为5.O的磷酸盐缓冲溶液中，配制质量浓度为2. O 8. O %的海藻酸钠溶液，并称重，按水溶性碳二亚胺与海藻酸钠质量比为(0. 5 1. 0) (0. 2 0. 8) 向海藻酸钠溶液中加入水溶性碳二亚胺，室温搅拌，得到海藻酸钠混合溶液，然后按花生油质量、质量浓度为25%的吐温80水溶液质量与海藻酸钠溶液质量比为(1 10) (0. 1 0.5) 2依次向海藻酸钠混合溶液中加入花生油和吐温80水溶液，在室温下搅拌形成均勻的W/0型悬浮液，再按胱胺质量与海藻酸钠质量比为(0.2 1.5) (0.2 0.8)向悬浮液中加入胱胺交联剂，在40°C、500rpm的条件下恒温磁力搅拌1 池，然后对产物进行抽滤和无水乙醇洗涤得到海藻酸盐水凝胶微载体；2)将步骤1)得到的海藻酸盐水凝胶微载体加入相对分子质量为1 100k、质量浓度为0. 1 1. 0%的壳聚糖溶液中浸泡1 10h，接着在pH为7. 4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡 10 Mh，然后将海藻酸盐水凝胶微载体在-20 -80°c条件下预冻10 20h，再移入冻干机中在0 20°C下冷冻干燥2d得到具有多孔结构的海藻酸盐水凝胶微载体；·3)将步骤2、得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.1 0. 5%的肝素溶液中浸泡1 证，接着在pH为7. 4的磷酸盐溶液中浸泡10 Mh，然后在质量浓度为0. 0001 0. 001%的碱性成纤维细胞生长因子溶液中浸泡1 池，得到海藻酸盐水凝胶微载体；或者将步骤2、得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0. 0001 0. 001%的纤连蛋白溶液中浸泡1 池，得到海藻酸盐水凝胶微载体。
全文摘要
本发明涉及一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法。其分子结构式如下其制备过程用悬浮交联法，在水溶性碳二亚胺的活化作用下海藻酸钠中的羧基与胱胺中的氨基发生酰胺化反应，形成化学交联海藻酸盐水凝胶微载体，经冷冻干燥后得到多孔结构微载体，其上附着壳聚糖、肝素、碱性成纤维细胞生长因子、纤连蛋白等组分。本发明的海藻酸盐水凝胶微载体制备方法简单、原料来源丰富，具有良好的体外降解性和细胞相容性；用于间充质干细胞的体外扩增，可避免胰酶消化过程对细胞造成的伤害，同时提高细胞产量。
文档编号C08J9/42GK102250390SQ20111013583
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者尹玉姬, 赵燕燕, 赵爽 申请人:天津大学