一种小动物肝脏特异性基因转染方法以及以其为基础的转基因小动物模型的构建方法与流程

本发明属于生物学领域，涉及小动物肝脏特异性基因转染方法以及转基因动物模型的构建方法，特别是涉及一种以眼底静脉丛注射技术和静脉高压转染技术(水动力法)为基础的小动物肝脏特异性基因转染方法及其在构建转基因动物模型中的应用。

背景技术：
眼底静脉丛注射技术是生物医学实验中的一种常规技术。该技术作为一种常规的实验手段，可以将一系列外源物质递送到活体动物静脉血管内。通常，在生物实验中，该技术可以作为治疗性细胞输注、药物静脉内递送和外源基因转染的方法。与其它静脉注射方法相比，该方法有操作简单方便、适于重复进行和对实验动物损伤小等优点。更为重要的是，该技术适用于某些无法通过其他静脉途径进行外源物质递送的实验动物身上，这样就克服了尾静脉注射技术等传统注射技术无法逾越的技术鸿沟。静脉高压注射转染法(水动力法)是一种较新的活体动物基因转染方法。该方法可以被定义为，通过将大剂量的含有目的基因重组质粒的生理盐水溶液快速注入实验动物静脉内，进而使目的基因特异性的高效表达于实验动物的肝组织细胞中的活体动物基因转染方法。其中，在该类型的基因转染方法中，应用最为广泛的是尾静脉水动力转染法，在动物实验和实验动物造模过程中常常可以见到该方法的应用。然而，这种经典的活体动物转染技术也有其难以克服的局限性，如仅仅适用于某些尾静脉明显且容易穿刺的实验动物身上(如小鼠、大鼠)，而其他一些尾静脉不明显或根本没有尾静脉的动物则无法使用(如新生鼠)。因此，该方法被局限的应用在大、小鼠的动物实验当中，如果希望该方法在其他类型的实验动物身上使用，就必须对其进行改进。因此，迫切需要一种简单方便、适于重复进行和对实验动物损伤小，且适用范围广泛(可用于多种实验动物)的活体动物体内基因转染方法。

技术实现要素：
针对现有的实验动物静脉高压注射转染法(水动力法)适用范围较小、重复操作困难等问题，本发明的目的是提供一种简单方便、适于重复操作和对实验动物损伤小、适用范围广泛(可用于多种实验动物)，以眼底静脉丛注射技术和静脉高压注射转染法为基础的小动物肝脏特异性基因转染方法。本发明所提供的基因转染方法，是将超过2μg的携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达。在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组表达质粒的注射量优选为5-50μg，尤其优选为10μg；所述生理盐水的注射量优选为相当于实验动物体重6-10％，尤其优选为10％；所述注射速度优选为5-12秒，尤其优选为8秒；所述目的基因的表达时间优选为8-24小时。所述目的基因的选择是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，外源基因既可以是只表达指示作用的报告基因，如萤火虫荧光素酶(Fluc)基因、分泌型Gissass荧光素酶(Gluc)基因、β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因等，还可以是具有治疗作用、模拟疾病感染或有其他应用前景的目的基因，如HBV基因或HCV基因等；用于构建携带有目的基因的重组质粒的出发质粒可为任意一种表达外源基因的真核表达质粒，如pCI-neo、pcDNA、pGL、pVAX或pNFkB-Luc等；以pCI-neo为出发质粒构建的携带Gluc基因的重组表达质粒为pCI-Gluc，以pGL3为出发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒为pCMV-Fluc，以pcDNA为出发质粒构建的携带lacZ基因的重组表达质粒为pCMV-β-Gal。所述实验动物的选择也是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，如成年鼠、新生鼠、乳鼠、树鼩等，优选为6-8周龄的成年鼠、新生24小时内的新生鼠、新生1-7天的乳鼠、成年或新生树鼩。本发明还提供了一种构建转基因小鼠模型的方法，包括下述步骤：1)构建携带目的基因的重组表达质粒；2)将携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达，得到转基因小鼠模型。所述目的基因为HBV或HCV全基因组基因。以pGL3(购自美国Promega公司)为出发载体构建的携带HBV1.2倍基因组的重组真核表达质粒为pGL-CP-Fluc-HBV1.2；以pCI-neo(购自美国Promega公司)为出发载体构建的携带HCV全基因组的重组真核表达质粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV。本发明公开了一种高效、简单、重复性好、可广泛应用的小动物肝脏特异性基因转染方法(以下简称眼底静脉丛水动力基因转染方法)。该方法将眼底静脉丛注射技术和静脉高压注射转染法巧妙地结合在一起，通过该方法可以使外源基因特异性地在动物肝脏中表达，且其对肝脏组织所造成的损伤作用是短暂的、有限的。通过该方法可使含有不同目的基因的重组真核表达质粒表达目的蛋白。该技术可以用于多种动物模型的建立和基因治疗的效果评价，例如，通过转染常见的报告指示基因—-分泌型Gissass荧光素酶Gluc、萤火虫荧光素酶Fluc和β-半乳糖苷酶β-Gal基因对成年小鼠、新生鼠和成年树鼩进行活体基因转染。检测结果表明该方法不仅可用于构建常规实验动物如成年大、小鼠转基因动物模型，还可用于构建特殊实验动物如新生鼠和非人灵长类动物如树鼩的转基因动物模型。此外，应用该技术通过将含有乙型肝炎病毒(HBV)基因组或丙型肝炎病毒(HCV)全基因组的重组质粒转染到新生24小时内的新生鼠肝脏细胞中，可以建立模拟婴幼儿垂直感染HBV或HCV的动物模型。用本发明的方法可以评价不同外源基因在实验动物体内表达所引起的生物学反应，也可作为建立动物模型的一种手段，可广泛应用于各个门类的生物医学动物实验当中，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明图1为眼底静脉丛水动力基因转染方法对基因转染效率的影响图，其中：A为眼底静脉丛水动力基因转染方法中注射溶液体积对基因转染效率的影响；B为眼底静脉丛水动力基因转染方法中注射速度对基因转染效率的影响；C为眼底静脉丛水动力基因转染方法中注射质粒用量对基因转染效率的影响。图2为实施例2实验结果图片，其中：A为活体荧光成像结果显示眼底静脉丛水动力转染pCMV-Fluc质粒24小时后，外源基因萤火虫荧光素酶在小鼠脏器组织中的表达情况；B为应用化学发光法对研磨后提取的组织蛋白中萤火虫荧光素酶活性的测量，测量的组织为心、肝、脾、肺、肾、脑，测量时间点为8小时和24小时；C为眼底静脉丛水动力转染pCMV-β-Gal质粒后24小时，通过冰冻切片观测各种组织细胞表达β-半乳糖苷酶的染色结果。图3为实施例3实验结果图片，其中：A为眼底静脉丛水动力转染后0、1、2、3、5、7天，通过血清谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测发现血清生物化学指标的变化。B为眼底静脉丛水动力转染后0、1、2、5天，通过组织石蜡切片HE染色观测组织学变化的结果。图4为实施例4实验结果图片，其中：A为使用萤火虫荧光素酶重组表达质粒(pCMV-Fluc)应用眼底静脉丛水动力转染新生24小时内的新生鼠，外源基因在新生鼠肝脏内持续表达，活体荧光成像的检测结果及正常生长过程的照相图片；B为使用萤火虫荧光素酶重组表达质粒(pCMV-Fluc)应用眼底静脉丛水动力转染新生24小时内的新生鼠，外源基因在新生鼠肝脏内持续表达的荧光素酶激活程度的定量结果；C为使用萤火虫荧光素酶重组表达质粒(pCMV-Fluc)应用眼底静脉丛水动力转染新生24小时内的新生鼠，外源基因在新生鼠各组织内的表达分布情况。图5为实施例5实验结果图片，其中：A为成年树鼩图片及使用萤火虫荧光素酶重组表达质粒(pCMV-Fluc)应用眼底静脉丛水动力转染成年树鼩后24小时活体荧光成像结果；B为对成年树鼩进行眼底静脉丛水动力转染pCMV-β-Gal质粒24小时，通过冰冻切片观测各种组织细胞表达β-半乳糖苷酶的染色结果。图6为实施例6实验结果图片，其中：A为对新生鼠进行眼底静脉丛水动力转染pGL-CP-Fluc-HBV1.2后24小时观测到新生鼠肝脏部位标记HBV1.2倍基因组的报告基因萤火虫荧光素酶的表达情况；B为Western-blotting方法检测眼底静脉丛水动力转染pGL3-CP-Fluc和pGL-CP-Fluc-HBV1.2后24小时的新生鼠的肝脏组织HBVHBcAg、Fluc和GAPDH的表达情况；C为对新生鼠进行眼底静脉丛水动力转染pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV后24小时观测到新生鼠肝脏部位标记HCV全基因组的报告基因萤火虫荧光素酶的表达情况；D为免疫组织化学方法对眼底静脉丛水动力转染pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV后24小时的新生鼠的肝脏组织切片做HCVNS4A抗原的免疫组织化学检测结果，深染处即为染色阳性结果。具体实施方式针对现有动物基因转染方法和静脉高压基因转染技术中存在适用范围较小(仅适用于部分常规实验动物)等问题，本发明的目的是提供一种简单方便、适于重复进行和对实验动物损伤小、适用范围广泛(可用于多种实验动物)，以眼底静脉丛注射技术和静脉高压注射转染法为基础的小动物肝脏特异性基因转染方法。本发明所提供的基因转染方法，是将超过2μg的携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达。在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组表达质粒的注射量优选为5-50μg，尤其优选为10μg；所述生理盐水的注射量优选为相当于实验动物体重6-10％，尤其优选为10％；所述注射速度优选为5-12秒，尤其优选为8秒；所述目的基因的表达时间优选为8-24小时。所述目的基因的选择是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，外源基因既可以是只表达指示作用的报告基因，如萤火虫荧光素酶(Fluc)基因、分泌型Gissass荧光素酶(Gluc)基因、β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因等，还可以是具有治疗作用、模拟疾病感染或有其他应用前景的目的基因，如HBV基因或HCV基因等；用于构建携带有目的基因的重组质粒的出发质粒可为任意一种表达外源基因的真核表达质粒，如pCI-neo、pcDNA、pGL、pVAX或pNFkB-Luc等；以pCI-neo为出发质粒构建的携带Gluc基因的重组表达质粒为pCI-Gluc，以pGL3为出发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒为pCMV-Fluc，以pcDNA为出发质粒构建的携带lacZ基因的重组表达质粒为pCMV-β-Gal。所述实验动物的选择也是广泛的，可根据需要构建的实验动物模型进行选择，如成年鼠、新生鼠、乳鼠、树鼩等，优选为6-8周龄的成年鼠、新生24小时内的新生鼠、新生1-7天的乳鼠、成年或新生树鼩。本发明还提供了一种构建转基因小鼠模型的方法，包括下述步骤：1)构建携带目的基因的重组表达质粒；2)将携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达，得到转基因小鼠模型。所述目的基因为HBV或HCV全基因组基因。以pGL3出发载体构建的携带HBV1.2倍基因组的重组真核表达质粒为pGL-CP-Fluc-HBV1.2；以pCI-neo为出发载体构建的携带HCV全基因组的重组真核表达质粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、本发明眼底静脉丛水动力基因转染方法的建立，及其转染条件在成年小鼠身上的优化本发明眼底静脉丛水动力基因转染方法的建立，及其转染条件在成年小鼠身上的优化方法具体包括以下步骤：一、重组质粒pCI-Gluc的构建使用限制性内切酶EcoRI和NotI对质粒extGluc[E.B.Santos，R.Yeh，J.Lee，Y.Nikhamin，B.Punzalan，B.Punzalan，K.L.Perle，S.M.Larson，M.Sadelain，R.J.Brentjens，SensitiveinvivoimagingofTcellsusingamembrane-boundGaussiaprincepsluciferase，NatureMedicine，15(2009)338-344.]和pCI-neo载体(购自美国Promega公司)分别进行双酶切，双酶切体系为：extGluc或pCI-neo载体7μl、EcoRI和NotI(购自美国NewEnglandBiolabs公司)各2.5μl、10×Buffer5μl、ddH2O33μl，总体积50μl，酶切条件为：37℃酶切8h，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了500bp的分泌型Gissass荧光素酶Gluc基因片段和5000bp的pCI-neo载体酶切片段，用凝胶回收试剂盒(购自大连宝生物工程TakaRa公司)回收并纯化两个基因片段，然后，将回收获得的分泌性Gluc片段(500bp)与pCI-neo载体片段(5000bp)进行连接，连接反应体系为：pCI-neo载体片段1μl、分泌型Gluc基因片段5μl、10×T4DNALigaseBuffer1μl、T4DNALigase1μl(购自美国NewEnglandBiolabs公司)、ddH2O2μl，共10μl，连接反应条件为：4℃连接过夜，得到携带Gluc基因的重组表达质粒pCI-Gluc。二、本发明眼底静脉丛水动力转染法中注射溶液体积对转染效率的影响将步骤一中构建的重组质粒pCI-Gluc用无内毒素质粒大量纯化试剂盒(购自德国Qiagen公司)进行质粒纯化，然后选6-8周龄的雄性BALB/c小鼠20只(购于军事医学科学院实验动物中心)，将10μgpCI-Gluc质粒溶解于相当于小鼠体重4％、6％、8％、10％的生理盐水中，以8秒的速度注射入小鼠眼底静脉丛内。24小时后通过尾静脉采血法，采血80-150μl。血样在4℃中放置4小时，待血清析出后，4500rpm离心20分钟以分取血清，-70℃保存。生物发光检测Gluc表达量时，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(购自美国Promega公司)生物发光测试仪，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(购自美国Promega公司)试剂盒，参数设置为延迟10秒，自动加入底物100μl，通过电脑获得相关数据。结果如图1A所示(横坐标为生理盐水注射体积(百分比体重)，纵坐标为相对基因表达水平，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明不同剂量的含有质粒的生理盐水快速注入小鼠眼底静脉丛后，外源基因可以表达。当注射液体量为小鼠体重10％时，外源基因的表达水平最高，且与其他注射剂量相比都有明显差别(p＜0.01)，因此，将本发明眼底静脉丛水动力转染法中生理盐水的注射量定为相当于实验动物体重4-10％，优选为相当于实验动物体重6-10％，尤其优选为相当于实验动物体重10％。三、眼底静脉丛水动力基因转染方法中注射速度对转染效率的影响将重组质粒pCI-Gluc用无内毒素质粒大量纯化试剂盒进行质粒纯化。然后选6-8周龄的雄性BALB/c小鼠20只，将pCI-Gluc10μg溶解于相当于小鼠体重10％的生理盐水，分别以5、8、12和25秒的速度注射入小鼠眼底静脉丛内。24小时后通过尾静脉采血法，采血80-150μl。血清分离方法同步骤二。生物发光检测Gluc表达量时，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(购自美国Promega公司)生物发光测试仪，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(购自美国Promega公司)试剂盒，参数设置为延迟10秒，自动加入底物100μl，通过电脑获得相关数据。结果如图1B所示(横坐标为注射时间(s)，纵坐标为相对基因表达水平，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明当小鼠体重10％的含有质粒DNA的生理盐水以5-25秒的速度注入小鼠眼底静脉虫后外源基因可以高效的表达，且5-8秒内注射完成时外源基因表达最高，但注射速度过快小鼠可能死亡。因此，将本发明眼底静脉丛水动力转染法中注射速度定为5-25秒，优选为5-12秒，尤其优选为8秒。四、眼底静脉丛水动力基因转染方法中质粒用量对转染效率的影响将重组质粒pCI-Gluc用无内毒素质粒大量纯化试剂盒进行质粒纯化。然后选6-8周龄的雄性BALB/c小鼠20只，将质粒pCI-Gluc2、5、10、50μg溶解于相当于小鼠体重10％的生理盐水，分别以8秒的速度注射入小鼠眼底静脉丛内。24小时后通过尾静脉采血法，采血80-150μl。血清分离方法同上。生物发光检测Gluc表达量时，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(购自美国Promega公司)生物发光测试仪，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(购自美国Promega公司)试剂盒，参数设置为延迟10秒，自动加入底物100μl。通过电脑获得相关数据。结果如图1C所示(横坐标为质粒用量(微克)，纵坐标为基因表达量，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明不同剂量的质粒DNA注入小鼠体内后，外源基因均有表达。从实验结果可以发现，在成年小鼠实验当中，10μg质粒已经可以使外源基因的表达达到饱和，即使增加质粒用量(如50μg)外源基因的表达也不会增加。因此，将本发明眼底静脉丛水动力转染法中携带有目的基因的重组表达质粒的注射量应大于2μg，优选为5-10μg，尤其优选为10μg。综上所述，本发明所提供的眼底静脉丛水动力基因转染法，是将超过2μg的携带有目的基因的重组表达质粒溶解于相当于实验动物体重4-10％的生理盐水，以5-25秒的速度注射入实验动物的眼底静脉丛内，8-36小时后目的基因在实验动物肝脏处获得表达。实施例2、本发明眼底静脉丛水动力基因转染方法转染后外源基因表达靶器官的确认用下述方法验证实施例1建立的眼底静脉丛水动力转染法转染后外源基因表达的靶器官：一、萤火虫荧光素酶(Fluc)基因表达靶器官的检测首先用无内毒素质粒大量纯化试剂盒(购自德国Qiagen公司)对携带有萤火虫荧光素酶(Fluc)基因的重组质粒pCMV-Fluc[FuQX，JiaSZ，SunZD，TianFM，DuJ，ZhouY，WangYL，WangLH，ZhanLS.phiC31integraseandliver-specificregulatoryelementsconferhigh-level，long-termexpressionoffireflyluciferaseinmouseliver.BiotechnologyLetters.2009，31：1151-1157.]进行质粒纯化，然后选6-8周龄的雄性BALB/c小鼠10只，将pCMV-Fluc10μg溶解于相当于小鼠体重10％的生理盐水，以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至小鼠体内。在转染后24小时按150mg/kg的用量小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(购自美国Promega公司)，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行检测。通过活体成像技术可以观测到小鼠腹部有强烈的发光。迅速短颈处死小鼠将小鼠解剖，十分钟内将该小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑取出继续进行活体成像。结果如图2-A所示(1为心，2为肝，3为脾，4为肺，5为肾，6为脑)，可以发现小鼠腹部的生物发光基本上来自于肝脏，其他组织未见明显的生物发光信号。为进一步确认眼底静脉丛水动力转染法转染后外源基因表达的靶器官，用组织蛋白抽提液(康为世纪生物科技有限公司，北京，中国)将心、肝、脾、肺、肾、脑各组织裂解，并分离组织蛋白，方法为：取20μl组织蛋白于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(购自美国Promega公司)生物发光测试仪，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(购自美国Promega公司)试剂盒，参数设置为延迟10秒，加入100μl的Fluc底物。结果如图2-B所示(横坐标为组织名称，纵坐标为转染后8h、24h后基因表达量，Con为阴性对照，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，除在8小时时肾脏组织有极微弱的发光外，其他生物发光全部集中在肝脏组织中，且萤火虫荧光素酶(Fluc)激活约为其阴性对照(只注射生理盐水)的104倍。二、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因表达靶器官的检测通过将10μgβ-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β-Gal[周勇，阎少多，阎虎，等。树鼩水动力转染方法的建立及在HBV模型探索中的应用，军事医学，2011，10(35)：742-745]溶解于相当于小鼠体重10％的生理盐水，以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至小鼠体内。24小时后，取小鼠各脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)，冰冻切片后进行X-Gal染色。结果如图2-C所示，可以发现外源基因的表达主要集中在肝细胞中。综上所述，本发明眼底静脉丛水动力转染法转染后外源基因表达的靶器官为肝脏。实施例3、本发明眼底静脉丛水动力基因转染方法转染后对靶标动物组织的损伤情况在基于实施例2所得的实验结果，可以看出该技术可能对实验动物的机体，尤其是肝组织产生一定的副作用，因此，用下述方法观察本发明外源基因转染方法对实验动物(实施例2步骤一转染pCMV-Fluc质粒的小鼠)肝组织的损伤情况：首先分析眼底静脉丛转染技术转染后的小鼠血清中血清谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等血清生化指标的变化，具体方法为：通过眼球取血法从小鼠体内取得约300μl的全血于1.5mL离心管中，4℃放置4小时待血清析出，然后4500rpm离心20分钟，分离血清并保存于-70℃低温冰箱中，待0、1、2、3、5、7天小鼠血清全部都获得后，使用日立全自动临床生化分析仪TBA-200FR对小鼠血清样品进行ALT、AST分析。检测结果如图3-A所示，可以发现，小鼠血清中的ALT在眼底静脉丛转染后1天明显上升，高达500IU/L左右，然后随即开始迅速下降，到第3天时仅有50-90IU/L，但此值仍高于小鼠生理水平，血清ALT水平约在第5天恢复正常水平，此后一直保持在正常水平。血清AST的结果与ALT的变化基本相同。此外，还通过石蜡包埋的HE组织切片观察眼底静脉丛水动力转染法对肝细胞的损伤情况，具体方法为：取适当大小待检测的肝脏组织置于10％福尔马林溶液中固定24h以上；肝组织经流水过夜冲洗完全水化后，再经过由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，二甲苯渗透，最后石蜡包埋成蜡块并切成厚度为5μm切片，脱蜡后，浸入PBS中水化5min，将切片浸入苏木精染液中染色10-30min后取出，用水冲洗去浮色；切片浸入0.1％盐酸酒精中分色数秒；再用水冲洗反蓝，直到切片颜色变蓝；浸入I％伊红染液中复染30sec-2min，水冲洗去残余染料；按照顺序将该切片经过70％、80％、90％、95％的酒精脱色和分化伊红颜色各1-2min；将该切片浸入100％酒精脱色15min，中间更换一次；浸入100％酒精+二甲笨(1∶1)中透明5-10min，再经过二甲苯(I号缸)透明2-5min，二甲苯(II号缸)透明5min；中性树脂固片。结果如图3-B所示(Control表示阴性对照，只注射生理盐水)，与血液生化指标相同，在转染后的1天，肝细胞肿胀变形，肝组织特有的组织形态受到破坏，视野下有坏死和凋亡细胞出现；第2天，肝细胞病变明显减轻，肝组织结构趋向正常，肝细胞肿胀现象消失，细胞形态基本恢复；肝脏细胞可在第5天完全恢复正常的生理结构。以上实验结果充分说明了本发明眼底静脉丛水动力转染法对肝脏的损伤作用是瞬时的，基本在一周之内恢复正常。实施例4、眼底静脉丛水动力基因转染方法在乳鼠身上的应用一、外源基因在乳鼠体内表达情况按照实施例1中眼底静脉丛在成年鼠身上的优化条件对乳鼠的眼底静脉丛水动力转染进行初步应用。用无内毒素质粒大量纯化试剂盒对重组质粒pCMV-Fluc进行质粒纯化，然后选新生24小时内的BALB/c新生鼠10只(购于军事医学科学院实验动物中心)，将pCMV-Fluc10μg溶解于相当于新生鼠体重10％的生理盐水中，以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至新生鼠体内。新生鼠保温后放回母鼠笼中。分别于第1、2、3、5、8、12、18天通过IVIS活体成像仪对新生鼠进行成像，观察外源基因在新生鼠体内的表达情况。新生一周内的新生鼠通过固定四肢保证新生鼠在成像过程中保持静止，一周以上的乳鼠通过气体麻醉，活体成像的其他操作过程同前。结果如图4-A和图4-B所示，可以看出，新生鼠在转染后一天，外源基因的表达水平达到顶峰，随后逐步下降，但外源基因的表达基本可以维持约2周的时间。二、眼底静脉丛水动力转染新生鼠，转染靶器官的确认为了了解眼底静脉丛水动力转染后新生鼠外源基因的表达靶器官情况是否与成年鼠相同，将纯化后的质粒pCMV-Fluc10μg溶解于相当于新生鼠体重10％的生理盐水中，然后以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至新生24小时内的小鼠体内。1天后，新生鼠腹腔注射150mg/kg的萤火虫荧光素酶底物，5分钟后将新生鼠断颈处死，分离心、肝、脾、肺、肾、脑等组织，应用IVIS活体成像仪以中灵敏度水平成像60秒。结果如图4-C(1为心，2为肝，3为脾，4为肺，5为肾，6为脑)所示，可见新生鼠肝组织中表达了较强的荧光素酶活性，肺脏组织有相对较弱的荧光素酶激活，而其他组织没有荧光素酶的激活。综上所述，用本发明眼底静脉丛水动力转染方法向乳鼠体内转染外源基因后，基因表达水平与成年鼠体内表达情况相近，外源基因主要表达于乳鼠的肝脏组织中，肺组织中也有少量的表达。实施例5、眼底静脉丛水动力基因转染方法在非人灵长类树鼩身上的应用在完成实施例1-4的内容后，检测本发明的眼底静脉丛水动力转染法是否可应用于体积较大的实验动物身上，如非人灵长类实验动物树鼩，实验方法为：分别将纯化后的重组质粒pCMV-Fluc(与施例2之一同)和pCMV-β-Gal(与施例2之二同)各200μg溶解于相当于树鼩10％体重的生理盐水中，然后以15秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至20-40周龄的树鼩体内。24小时后，使用3％的异氟烷气体将树鼩麻醉，并腹腔给予150mg/kg的萤火虫荧光素酶底物，5分钟后，活体成像树鼩腹部部分。结果如图5-A所示，可以发现，Fluc外源基因在树鼩体内可以高效的表达。同时，将转染有重组质粒pCMV-β-Gal24小时后的树鼩断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑后迅速用液氮将组织速冻，使用冰冻切片机切取6μm厚的组织切片，固定后用X-Gal染色，观察β-半乳糖苷酶的表达情况。眼底静脉丛水动力转染后β-半乳糖苷酶lacZ基因在实验动物树鼩的组织中的表达情况如图5-B所示，肝组织细胞中可以发现蓝染的颗粒，与在其他实验动物身上获得的结果相似，表明lacZ外源基因仅在肝脏表达。实施例6、用本发明的眼底静脉丛水动力基因转染方法构建HBV及HCV新生动物模型及其检测在完成实施例1-5的内容后，将本发明建立的转基因方法实际应用到生物医学相关实践当中，即通过该方法可以构建HBV及HCV全基因组在新生鼠肝脏中表达的肝炎病毒各蛋白的动物模型。一、重组真核表达质粒的构建(1)重组真核表达质粒pGL-CP-Fluc-HBV1.2的构建携带HBV1.2倍基因组(含有AAV的HBV1.2倍基因组(subtypeadw，genetypeA)重组表达载体pAAV/HBV1.2包括HBV基因组1400-3182bp+1-1987bp和两个反向重复序列(ITR)，由国立台湾大学陈培哲教授惠赠)[Li-RungHuang，Hui-LinWu，Pei-JerChen，andDing-ShinnChen，AnimmunocompetentmousemodelforthetoleranceofhumanchronichepatitisBvirusinfection，TheNationalAcademyofSciencesoftheUSA，2006，103：17862-17867.]的重组真核表达质粒pGL-CP-Fluc-HBV1.2具体构建过程请参见文献[梁声强，报告基因标记的HBV小鼠模型的建立及在疫苗评价中的应用，中国人民解放军军事医学科学院硕士学位论文，2010.5，第一章，第一节，14-17页]。(2)重组真核表达质粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV的构建携带HCV全基因组(GenBank号AJ238799.1)的重组真核表达质粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV具体构建过程请参见文献[田粉梅，持续表达HCV全基因组小鼠模型的建立，中国人民解放军军事医学科学院硕士学位论文，2008.5，第一部分，第一节，11-17页]。二、HBV蛋白在新生鼠肝脏中表达的动物模型的建立及其检测将纯化后的质粒pGL-CP-Fluc-HBV1.210μg溶解于相当于BALB/c新生鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)体重10％的生理盐水中，然后以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至新生24小时内的新生鼠体内。(1)转染24小时后，将新生鼠四肢固定，腹腔注射150mg/kg的荧光素酶底物(购自美国promega公司)，5分钟后IVIS活体成像仪中灵敏度成像60秒。可以发现新生鼠的肝脏区域有生物发光信号，且信号较强(见图6-A)，这可以间接证明HBV各组分蛋白同时也在新生鼠的肝脏区域表达。(2)Western-blotting方法检测HBVHBcAg在BALB/c新生鼠肝脏中的表达。在眼底静脉丛水动力转染10μgpGL-CP-Fluc-HBV1.2到新生鼠肝脏后24小时，处死新生鼠，并将其肝脏取出迅速置于预冷的75％生理盐水中，漂洗数次，剪碎，加入裂解液，裂解后12000转/分离心收集上清，在上清液中加入4×loadingbuffer，样品置100℃的水浴箱水浴加热10min，10000g离心10min，取上清液备用。按常规胶配置方法配制不同浓度聚丙烯酰胺凝胶，电泳使样品到达分离胶底部，断开电源。电泳结束后，将凝胶转移至盛有转移缓冲液的器皿中，平衡5分钟，剪1块与凝胶大小相同的硝酸纤维膜和6张滤纸浸泡于转移缓冲液中，平衡5分钟，在转移盘中按阳极到阴极顺序，将3张滤纸、转移膜、凝胶重叠精确对齐，然后在其上再放置3张浸泡好的滤纸，各层之间应避免留有气泡，在转移盘中夹好后，放在转移槽缓冲液中，胶侧置阴极，膜侧置阳极，接通电源，电转2h，100V，转移结束后，将膜与封闭液室温振荡孵育4℃封闭过夜，将膜与封闭液稀释的一抗兔抗HBVHBcAg(1∶1000)(购自北京中杉金桥公司)室温振荡孵育2h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，将膜与用HRP标记的抗兔二抗(1∶5000)(购自北京康维世纪生物公司)室温振荡孵育1h，用漂洗缓冲液洗膜3次，每次10min，将底物试剂A和试剂B等体积混合备用(购自美国MILLIPORE公司)，将底物工作液加到膜上后应立即用保鲜膜包好，迅速放入暗盒中并将X光片压到膜上进行曝光，然后先在显影液中冲洗至胶片上出现条带，再放入定影液中漂洗十秒，即可观察结果。结果如图6-B显示，眼底静脉丛水动力转染pGL3-Fluc重组真核表达质粒的新生鼠肝脏仅有荧光素酶的表达，而眼底静脉丛水动力转染pGL-CP-Fluc-HBV1.2重组真核表达质粒的新生鼠肝脏Western-blotting方法检测既可以发现Fluc的表达，同时有HBVHBcAg的表达，说明HBV各组分蛋白均在新生鼠的肝脏中表达。三、HCV蛋白在新生鼠肝脏中表达的动物模型的建立及其检测将纯化后的质粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV10μg溶解于相当于BALB/c新生鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)体重10％的生理盐水中，然后以8秒的速度通过眼底静脉丛快速转染至新生24小时内的新生鼠体内。(1)转染24小时后，将新生鼠四肢固定，腹腔注射150mg/kg的荧光素酶底物(购自美国promega公司)，5分钟后IVIS活体成像中灵敏度成像60秒。可以发现新生鼠的肝脏区域有生物发光信号，且信号较强(见图6-C)，这可以间接证明HCV各组分蛋白同时也在新生鼠的肝脏区域表达。(2)免疫组织化学检测HCVNS4A在BALB/c新生鼠肝脏中的表达在眼底静脉丛水动力转染10μgpCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV到新生鼠肝脏后24小时，处死新生鼠，并将其肝脏取出，固定24h以上。将固定后的组织精细取材后，于4℃下脱水、透明，52℃低熔点石蜡浸蜡包埋制成蜡块。切片机对蜡块进行连续切片，片厚4μm，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，56℃烘箱内烤干，备用。免疫组织化学检测采用SP法：制片后常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，PBS洗片3次，每次5min，放入湿盒中。0.3％H2O2孵育，室温10min。PBS洗片3次，每次5min。正常血清(1∶10)孵育，室温20min。除去多余血清滴加鼠抗HCVNS4A(1∶100稀释)(购自英国abcam公司)第一抗体100μl于切片上，4℃，12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加HRP标记的羊抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥公司)100μl于切片上，室温30min。PBS洗3次，每次3min。链霉素抗生物素-过氧化物酶100μl，滴于切片上，室温30min。PBS洗3次，每次5min。DAB显色10min(购自北京中杉金桥公司)。充分水洗，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检、显微摄影记录结果。检测结果如图6-D所示，通过眼底静脉丛水动力法转染pCI-attB-AerApoEAATP-FLuc-ECMVIRES-HCV的新生鼠肝脏HCVNS4A免疫组织化学染色结果为阳性，而对照组(转染pAA-Fluc真核表达质粒)为阴性。