刺糖多胞菌HBERC‑25376及其培养、活性物质分离方法与应用与流程

刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养、活性物质分离方法与应用技术领域本发明涉及一种刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养方法，活性物质的分离方法，及在农作物病虫害防治中的应用。

背景技术：
近年来，我国农药残留导致的食品安全问题非常突出，频频发生的农药中毒事件不断给全社会敲响了警钟。同时因大量高毒高残留化学农药的使用，导致我国农产品出口形势严峻，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏生态平衡。生物农药是绿色食品和有机农产品生产不可或缺的生产资料，对于保证农产品质量安全和生态环境安全，提高人民生活水平具有重要的积极意义。

技术实现要素：
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种悬浮率高，喷药不堵塞喷头，可喷雾，也可颗粒剂穴施，防治效果好的刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养方法，活性物质的分离方法与在农作物病虫害防治中的应用。本发明目的的实现方式为，刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，SaccharopolysporaspinosaHBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2013076。形态特征如下：菌落直径2-3mm，分散状；基丝无色，直径约0.6-0.8μm；气丝白色至灰白色，直径0.8-1.0μm，菌苔表面粉状；孢子丝直至弯曲形，每链含20-30个卵圆形孢子，孢子大小1.0×1.5μm。刺糖多胞菌HBERC-25376培养方法，具体步骤如下：（1）菌种的准备：将斜面菌种或甘油冻存管或冻干管中菌种孢子或菌丝，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的500毫升带挡板三角瓶中，在25-30℃条件下，在摇床上100—350转/分培养3-6天，在严格无菌条件下，取样，染色，镜检；取菌种的斜面孢子在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在25-30℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到一定浓度后，按1：1加入事先准备好的体积比为40%的无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存，每次使用一支冻存管；种子培养基、发酵培养基配方：甘露醇1-3%，大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%；pH值6.5-7.5，每瓶装100mL；（2）扩大或发酵：待种子瓶长好以后，按体积3—10%的接种量转入二级种子培养基或发酵培养基中；二级种子培养基或发酵培养基，发酵过程同第一级发酵；发酵过程需要5-7天，用HPLC检测，待产物达到较高产量时即可放罐；（3）发酵液预处理：在发酵完成后，用稀酸将发酵液pH调整到4-5，然后进行板框过滤或离心，得到上清液和菌丝体两部分；（4）上清液的处理：上清液处理方式有二：①用薄膜浓缩器在50-60℃，0.1-0.09MPa条件下浓缩3-8倍后，加入防腐剂、稳定剂、表面活性剂，制成液剂产品；所述防腐剂为：苯甲酸钠或山梨酸钾，所述稳定剂为：黄原胶或琼脂，所述表面活性剂为：吐温80或1231，防腐剂、稳定剂、表面活性剂统称助剂；②采用萃取法或树脂吸附法进行提取，萃取法，将等体积的乙酸乙酯与发酵上清液混合，充分搅拌1±0.2小时，上清液中的活性物质就会转移到溶剂中，分离出酯相，在减压下蒸干，即得目标活性物质提取物；所采用的减压浓缩条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃；树脂提取法，将大孔吸附树脂按说明书进行预处理，然后按2%-5%的比例加入上清液中，200-400转/分搅拌处理1-2小时，用40-100目筛网过滤，获得树脂，将收获的树脂用少量纯水冲洗，然后按1：10-20的比例（W/V）加入乙酸乙酯，置容器中100-300转/分搅拌30-120分钟，弃去树脂，将酯相分离出来，减压浓缩即可获得目标产物提取物；所采用的减浓缩条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃。刺糖多胞菌HBERC-25376活性物质的分离方法，刺糖多胞菌的活性物质有刺糖多胞菌HBERC-25376的活性物质束霉素(BundlinA)、结节霉素(Nodusmycin)、椒疫霉素(Capsimycin)，它们在同一菌种采用相同的培养基发酵时会同时产生；束霉素A的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在10-11分钟流出的组份即为束霉素A，其化学结构式为；ChemicalFormula:C25H33NO7ExactMass:459.23结节霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在16-17分钟流出的组份即为结节霉素，其化学结构为；ChemicalFormula:C28H37NO8ExactMass:515.25椒疫霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在20-21分钟流出的组份即为椒疫霉素，其化学结构式为ChemicalFormula:C30H40N2O6ExactMass:524.29MolecularWeight:524.65刺糖多胞菌HBERC-25376活性物质的应用，束霉素A用作制备小菜蛾、棉铃虫的防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂；结节霉素用作制备农作物细菌性病害防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂；椒疫霉素用作制作小菜蛾、棉铃虫防治，以及辣椒疫霉病防治的制剂。本发明的刺糖多胞菌具有良好的杀虫、杀菌（真菌、细菌）活性，可用于小菜蛾、棉铃虫等农作物害虫及辣椒疫霉等农作物真菌病害的防治；活菌制剂也有用于生物防治的潜力；活菌制剂毒性很低，部分也可用于动物及人类疾病的防治，如肠道传染病等。还可通过固体发酵或固-液两相发酵制成活菌制剂。附图说明图1是束霉素A的紫外吸收收光谱及质谱图，图2是结节霉素的紫外吸收收光谱及质谱图，图3是椒疫霉素的紫外吸收收光谱及质谱图，图4是HBERC-25376的发酵过程曲线图，图5是菌种表面特征，图6是菌种的进化树图，图7是HBERC-25376结节霉素的核磁共振氢谱图，图8是HBERC-25376结节霉素的二维核磁共振图，图9是HBERC-25376结节霉素的二维核磁共振碳谱图，图10是刺糖多胞菌HBERC-25376液剂在湖北省生物农药工程研究中心试验基地进行的防治小菜蛾的温室试验效果图。本发明的菌种为刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，SaccharopolysporaspinosaHBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNo：M2013076，保藏日期2013年3月12日，存活证明日期2013年4月17日。具体实施方式本发明的刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2013076。刺糖多胞菌HBERC-25376的形态特征（见图5）如下：菌落直径2-3mm，分散状；基丝无色，直径约0.6-0.8μm；气丝白色至灰白色，直径0.8-1.0μm，菌苔表面粉状；孢子丝直至弯曲形，每链含20-30个卵圆形孢子，孢子大小1.0×1.5μm。图6的菌种的进化树图，证实本菌种的分类地位是刺糖多胞菌。刺糖多胞菌HBERC-25376的在不同培养基上的培养特征如下：表1HBERC-25376的培养特征从表1可见，刺糖多胞菌HBERC-25376在ISP-2号培养基上生长很好，在高氏一号培养基上生长尚可。不产生水溶性色素。刺糖多胞菌HBERC-25376的生理生化特征试验结果如下表：表2HBERC-25376的生理生化试验结果刺糖多胞菌培养方法，具体步骤如下：（1）菌种的准备：将斜面菌种或甘油冻存管或冻干管中菌种孢子或菌丝，在严格无菌条件下，接种至装有50、100、150或200毫升种子培养基的500毫升带挡板三角瓶中，这些培养基事先要用121℃灭菌30分钟来杀灭其中的杂菌。在28℃条件下，在摇床上100、150、200、300或350转/分培养3-6天，在严格无菌条件下，取样，染色，镜检，如菌丝生长好，染色均匀，无杂菌污染即为合格菌种。甘油管的制作：取菌种的斜面孢子适量，在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在25-30℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到一定浓度后，按1：1加入事先准备好的40%（V/V）无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存。每次使用一支冻存管。种子培养基配方：甘露醇1-3%，大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%。pH值6.5-7.5。每瓶装100mL。（2）扩大或发酵：待种子瓶长好以后，按3—10%（V/V）的接种量转入二级种子培养基（如果进行发酵罐发酵的话）或发酵培养基中。这些培养基及其容器同样需要进行严格的灭菌操作。如果采用摇瓶发酵，二级种子培养基或发酵培养基，发酵过程同第一次发酵。如用发酵罐发酵，则还需采用通气、搅拌方式来保证菌种良好的氧气供应。如果有条件的话，在发酵罐中发酵还应安装pH、溶氧探头，监测发酵罐中的pH、溶氧变化情况，不可超出适合发酵的条件。发酵罐的搅拌速度视罐体大小不同，可由200转/分至500转/分，培养基的装量按罐体容积的60%—80%。发酵过程需要5-7天，发酵中间可取样分析其中糖和氮的变化情况，最重要的数据是产物量的变化。用HPLC检测，待产物达到较高产量时即可放罐。所述种子培养基、发酵培养基配方：甘露醇1-3%，大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%；pH值6.5-7.5。每瓶装100mL。（3）发酵液预处理：在发酵完成后，要用稀酸将发酵液pH调整到4-5，然后进行板框过滤或离心，得到上清液和菌丝体两部分。本活性物质主要存在于上清液中，其含量占总量的90%以上，菌丝中的产物量不到总量的10%。（4）上清液的处理：上清液可有三种处理方式：①用薄膜浓缩器在50-60℃，0.1-0.09MPa条件下浓缩3-8倍后，加入防腐剂、稳定剂、表面活性剂，即可制成液剂产品。所述防腐剂有：苯甲酸钠、山梨酸钾等。所述稳定剂有：黄原胶、琼脂等。所述表面活性剂有：吐温80、1231等。②萃取法可以采用乙酸乙酯，也可采用其它适当的有机溶剂。将等体积的乙酸乙酯与发酵上清液混合，充分搅拌1±0.2小时，上清液中的活性物质就会转移到溶剂中，分离出酯相。将酯相在减压条件下蒸干，即得目标产物提取物。所采用的减压浓缩条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃。除减压浓缩外，也可采用其它浓缩方式。③树脂提取法，将河北沧洲保恩吸附材料科技有限公司的HPD-100型大孔吸附树脂，日本三菱化成的HP-20大孔吸附树脂等按说明书进行预处理，然后按2%-5%的比例加入上清液中，200-400转/分搅拌处理1-2小时，用40-100目筛网过滤，获得树脂，将收获的树脂用少量纯水冲洗，然后按重量、体积比1：10-20的比例加入乙酸乙酯，置容器中100-300转/分搅拌30-120分钟，弃去树脂，将树酯相分离出来，减压浓缩获得目标产物提取物；所采用的减浓缩条件为：真空度0.1-0.2bar，温度40-60℃。刺糖多胞菌活性物质的分离方法，刺糖多胞菌的活性物质有刺糖多胞菌HBERC-25376的活性物质束霉素(BundlinA)、结节霉素(Nodusmycin)、椒疫霉素(Capsimycin)，三种在同一菌种采用相同的培养基发酵时会同时产生；束霉素A的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在10-11分钟流出的组份即为束霉素A。束霉素A的紫外吸收收光谱及质谱图见图1，证明结构的正确性。结节霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在16-17分钟流出的组份即为结节霉素。结节霉素的紫外吸收收光谱及质谱图见图2，证明结构的正确性。椒疫霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在20-21分钟流出的组份即为椒疫霉素。椒疫霉素的紫外吸收收光谱及质谱图见图3，证明结构的正确性。经紫外和质谱、核磁共振解析，已获得三种化合物的化学结构。它们分别是为束霉素(BundlinA)、结节霉素(Nodusmycin)、和椒疫霉素(Capsimycin)。本申请人作了HBERC-25376结节霉素的核磁共振氢谱图（见图7），二维核磁共振图（见图8），二维核磁共振碳谱图（见图9），这些谱图证明HBERC-25376结节霉素结构的正确性。当需要分离的产物量比较大时，可采用硅胶柱柱层析分离。方法是：（1）柱湿法装填：采用直径10-50mm的玻璃柱，径高比为1：10-30。将硅胶用足量乙酸乙酯湿润，搅拌均匀，装入玻璃柱中，用乙酸乙酯洗下壁上的硅胶，静置30分钟以上，放出多余的溶剂备用。（2）样品准备：将待分离样品用甲醇溶解，加入4-5倍量（V/W）硅胶，搅匀，挥去溶剂。（3）上样：将硅胶与样品的混合物小心加入柱中，正好在液面上。（4）梯度洗脱：依次用100%石油醚、石油醚：乙酸乙酯=80：20、60：40、50：50、40：60进行洗脱，每种洗脱液体积为硅胶柱体积的3-5倍，按硅胶柱体积收集洗脱液。第11-12管为束霉素A、第14-15管为结节霉素、第19-20管为椒疫霉素。样品量更大时，比如大于100克纯品时可用塔式层析装置分离。上述三种化合物的检测可用高效液相色谱仪（HPLC）检测，条件是：采用SunfireC18反相柱，进样量5μL，流动相采用乙腈和纯水，其中分别加入0.2%的乙酸（V/V），梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器（PDA），扫描波长200-500nm，运行时间40分钟。洗脱条件如下：表3HPLC洗脱条件上述提取物经剂型化处理后，通过含量测定，即可投入实际使用。剂型化的步骤包括加入稳定剂、分散剂、粘着剂、防腐剂等不同助剂。一种助剂可能起到几种作用。常用的助剂有：吐温80、1231、苯甲酸钠、山梨酸钾、木质素磺酸钠、黄原胶等。剂型化处理后的产品可直接投入使用。如用于农用物病虫害的防治，可直接兑水稀释喷雾。本发明的产品也可通过固体发酵制成活菌制剂。固体发酵培养基配方为：大米1000克，葡萄糖100克，大豆蛋白粉150克，水份足量。采用蒸锅蒸煮30分钟的方法来制备培养基。用不锈钢浅盘进行发酵。种子制备方法同液体发酵相同。图4说明本菌种发酵过程中活性物质及各种参数的变化，说明本菌株的发酵周期为120小时左右。接种后在28℃条件下培养，时间为6-10天。完成培养后经风干或气流烘干制成活菌制剂。刺糖多胞菌HBERC-25376活性物质的应用，活性物质束霉素A用作制备小菜蛾、棉铃虫的防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂。活性物质结节霉素用作制备农作物细菌性病害防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂；活性物质椒疫霉素用作制作小菜蛾、棉铃虫防治，辣椒疫霉防治的制剂。本发明产品也可用于动物疾病的防治，如肠道传染病等。图10是刺糖多胞菌HBERC-25376的发酵液在湖北省生物农药工程研究中心试验基地进行的防治小菜蛾的温室试验效果图，从图中可见用药后小菜蛾死亡。