本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种喹唑啉衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB蛋白家族成员，其它三个亚型分别是HER2(Neu，ErbB2)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)，它们在细胞的增殖和分化过程中发挥着重要作用，也是目前被研究最为深入的酪氨酸受体蛋白之一。EGFR广泛存在于皮肤、毛囊和胃肠道等正常表皮组织中，对维持正常生理活动发挥着重要作用。然而，EGFR的过度表达或持续激活会引发众多癌症，在包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈部癌等在内的癌症中都有EGFR异常情况的出现。
在2003～2004年，EGFR小分子抑制剂Gefitinib和Erlotinib先后被美国FDA批准上市用于治疗非小细胞肺癌患者，这些药物尤其对携带活化突变的EGFR基因型(占该癌症患者总数的10～20％)的非小细胞肺癌患者有效。不幸的是，高敏感型患者在服用药物大约一年后，往往会形成获得性耐药。在获得性耐药机制中，最普遍(占耐药患者总数的50％)的一种是EGFR的二次突变T790M，即第790位上的苏氨酸突变为甲硫氨酸，它能够增加EGFR与ATP的结合能力，从而使Gefitinib这些药物分子难以竞争过ATP与EGFR的结合，从而失去药效。
大量的研究表明，发展靶向性EGFR和HER2酪氨酸激酶的双重抑制剂具有以下优势：1.同时抑制EGFR和HER2两种酪氨酸激酶，更易于克服在使用单一酪氨酸激酶抑制剂时EGFR家族其他成员上调引起的细胞生长信号冗余从而产生的抗药性；2.由于EGFR和HER2异源二聚体活性最高，EGFR和HER2酪氨酸激酶的双重抑制剂对更多数的癌症患者有效。3.与单一抑制剂相比，双重抑制剂对肿瘤细胞抑制效果具有叠加效应。体外和体内试验也表明，对EGFR和HER2酪氨酸激酶双重抑制的抗癌效果大于对单一受体的抑制。另外与同时使用两个分别作用于单一靶点的药物相比，作用于两个靶点的药物患者使用起来比较方便，还可以避免药物与药物的相互作用。
综上所述，开发靶向EGFR和HER2酪氨酸激酶的双重不可逆抑制剂是理性的选择。
目前，进入临床研究的不可逆双重酪氨酸激酶抑制剂有Afatinib,HKI-272和PF299804，临床实验数据表明这类抑制剂具有很好的开发前景。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种新结构的喹唑啉衍生物，该类新结构的喹唑啉衍生物，对EGFR及HER2两种酪氨酸激酶同时具有抑制作用，并且对多种癌细胞具有很好的抑制活性。
一种式I所示的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1任选自：苯基，取代的苯基，含有并环类的芳基，杂芳基；
R2任选自：C1-C6链状烷基，C3-C8环状烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基，含有O、N、S、P杂原子的C3-C8环状杂烷基；
R5任选自：氢，卤素，氰基，C1-C6链状烷基，C3-C8环状烷基；
R6任选自：氢，C1-C6链状烷基，C3-C8环状烷基；
R7任选自：氢，卤素，氰基，C1-C6链状烷基，C3-C8环状烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基，含有O、N、S、P杂原子的C3-C8环状杂烷基；
并且，R5，R6，R7中任意两个取代基可成环；
X选自：C,S＝O；
Y选自：C-CN,N；
W选自如下基团：
其中：R3任选自：氢，C1-C3链状烷基；
R4任选自：氢，C1-C3链状烷基。
上述喹唑啉衍生物的研发，是为了克服药物抗性以及早期可逆抑制剂给药量大的缺点，所进行的不可逆抑制剂的研究。利用EGFR和HER2激酶ATP结合区边缘的Cys773和Cys805氨基酸残基上巯基具有较强的亲核性的特点，在药物分子中引入一个Michael加成受体，使药物分子能够与激酶形成共价键结合，达到不可逆抑制的目的。
在其中一些实施例中，R1选自如下基团：
其中，R8任选自：氢，C1-C6烷基，C6-C10取代芳烷基，卤素，CF3，CHF2，CH2F，OR9，NR9R10，CN，CO2R9，CON R9R10，SO2R9，SO2N R9R10，NO2，NCON R9R10，NCO2R9，OCONR9R10，CSN R9R10，NCSN R9R10；
R9、R10各自任选自：氢、C1-C6烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基；
Z选自：C,N,O。
在其中一些实施例中，R1选自如下基团：
其中：R8选自：氢，C1-C6烷基，卤素。
在其中一些实施例中，R2选自如下基团：
其中：
R11，R12各自任选自：氢，C1-C6链状烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基；
并且，R11和R12两个取代基可以成环；
N选自：1-6。
在其中一些实施例中，R7选自如下基团：
其中：
R11，R12各自任选为：氢，C1-C6链状烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基；
并且，R11和R12两个取代基可以成环；
m选自：1-6。
在其中一些实施例中，R1选自如下基团：
其中：R8选自：氢，C1-C6烷基，卤素；
R2选自如下基团：
其中：
R11，R12各自任选自：氢，C1-C6链状烷基；
n选自：1-2；
R5选自：氢，氰基；
R6选自：氢；
R7选自如下基团：
其中：
R11，R12各自任选为：氢，C1-C6链状烷基，含有O、N、S、P杂原子的C1-C6链状杂烷基；
并且，R11和R12两个取代基可以成环；
m选自：1-2；
X选自：C,S＝O；
Y选自：C-CN,N；
W选自如下基团：
其中：R3任选自：氢；
R4任选自：氢。
在其中一些实施例中，该喹唑啉衍生物选自如下化合物之一：
N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-(二甲氨基)乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-吗啉基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-(二甲氨基)乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丁基-2-烯基酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
(E)-N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯基酰胺；
N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丁基-2-烯基酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)乙烯磺酰胺；
N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺；
N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺；
(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺；
(E)-N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-4-吗啉代丁基-2-烯酰胺；
(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)-4-吗啉代丁基-2烯酰胺；
N-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)甲基)丙烯酰胺；
N-丙烯酰-4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-甲酰胺；
N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-2-氰基-2-烯酰胺；
N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺。
本发明还公开了上述的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，采用以下路线合成：
或采用以下路线合成：
或采用以下路线合成：
本发明还公开了上述的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述肿瘤包括血管瘤、子宫内膜异位症、胃肠间肿瘤、组织细胞性淋巴癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝 癌、皮肤癌、上皮细胞癌、鼻咽癌、白血病中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的喹唑啉衍生物或其药学上可接受的盐，对酪氨酸激酶具有不可逆的抑制作用，且该类化合物能够同时抑制EGFR和HER2两种酪氨酸激酶，更易克服在使用单一酪氨酸激酶不可逆抑制剂时EGFR家族其它成员上调引起的抗药性。并且，当在喹唑啉的7位引入取代基后，该类化合物虽然对酶活性与阳性对照药相当，但是其对多种癌症细胞系具有优于阳性对照药的效果，这可能与药物分子的代谢以及进入细胞的生物利用度有关。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。
本发明的化合物及其盐也可以通过已知用于制备化学相关化合物的方法制备，在实施例中涉及的原料均可通过现有技术的类似方法获得。
“取代的”是指用指定取代基的基团置换特定结构中的氢基。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。如本文中所使用，术语“取代”预期包括有机化合物的所有可允许取代基。在一广泛方面，所述可允许取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。诸如氮等杂原子可具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的任何可允许取代基，所述取代基满足杂原子的价数。
“杂芳基”是指含有5-14元单环或多环(例如，双环或三环)的4n+2芳香环系统(例如，在环状轨道共享6，10或14个π电子)，并且芳环体系具有环碳原子和1-4个环杂原子，，其中每个环杂原子独立地选自氮，氧和硫(“5-14元杂芳基”)。包含一个或多个氮原子的杂芳基，连接点可以是碳或氮原子，如果过化学价允许。杂芳基的多环系统的一个环或者两个环可以包括在一个或多个杂原子。“杂芳基”还包括如上定义所述的杂芳基环系统，稠合有一个或多个碳环或杂环基团，其中连接点是杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员的数量只包括杂芳基环体系上成员的数目。“杂芳基”还包括如上定义所述的杂芳基环系统，稠合有一个或多个芳基基团，其中连接点可以是芳基或杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员的数量只包括在稠合多环(芳基/杂芳基)环体系中的环成员数目。多环杂芳基，其中一个不含有杂原子的环(例如，吲哚基，喹啉基，咔唑基，以及类似物)，其连接点可以是在任意一环上，也就是说，可以是在包含杂原子的环上(例如，2-吲哚基)或在不含有杂原子的环上(例如，5-吲哚基)。含2个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于，咪唑，吡唑，恶唑，异恶唑基，噻唑基，和异噻唑。含有1个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于，吡啶基。含2个杂 原子的示例性6元杂芳基包括但不限于，哒嗪基，嘧啶基，和吡嗪基。
“烷基”是指饱和烃基或不饱和烷基，“链状烷基”是指直链或支链的烷基，如C1-C6链状烷基是指具有1至6个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的烷基，其中饱和直链烷基的示例包括但不限于乙基，正丙基等，饱和支链烷基的示例包括但不限于异丙基，叔丁基等，不饱和直链烷基的示例包括但不限于乙烯基、丙烯基等，不饱和支链烷基的示例包括但不限于2-甲基丙烯基等；“环状烷基”是指具有环状结构的烷基，如C3-C8环状烷基指具有3至8个碳原子的饱和或不饱和的具有环状结构的烷基，其中饱和环状烷基的示例包括但不限于环丙基，环戊基、乙基取代环己基等，不饱和环状烷基的示例包括但不限于环戊烯等。除非另外指明，烷基可以是未被取代的(即“未取代的烷基”)或被一个或多个取代基取代的(即“取代的烷基”)。
“杂烷基”是指如本文所定义的烷基，其中主链还包括1个或多个杂原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。
实施例1
化合物7-1，N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-(二甲氨基)乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺的制备。
按照以下线路合成：
步骤(1)制备化合物2(即2-胺基-4-氟-5-碘苯甲酸甲酯)，方法如下：
取一250mL洁净两口圆底烧瓶，依次加入50g原料1(322.58mmol),100mL叔丁醇和50mL水，搅拌下分批加入44.g(161.29mmol)单质碘，然后缓慢滴加40mL 30％的双氧水，于油浴中加热至50℃保温2h。TLC监测反应。反应结束后，体系冷却至室温，加入 50mL饱和亚硫酸氢钠水溶液，让后用150mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，重结晶，即得到目标化合物2(59.61g，产率66％)。步骤(2)制备化合物3，方法如下：
取一50mL洁净单口圆底烧瓶，依次加入1.8g化合物2,原甲酸甲酯1.36g，乙酸铵0.988g，乙腈20mL。加热至回流，TLC监测反应。反应结束后，体系冷却至室温，加入5mL水，搅拌，抽滤，滤饼用5mL水洗涤两次，抽干，然后用5mL乙醚洗涤两次，真空干燥，得乳白色固体，即为化合物3(1.58g，产率86％)。
步骤(3)制备化合物4-1，方法如下：
取一洁净二口瓶中加入干燥的DMF 50mL和NaH(60％)(692mg，34.6mmol)130mg，体系在室温下搅拌均匀后滴加2-二甲基乙醇胺(1.3mL,26mmol)，体系搅拌30分钟后加入5g化合物3(17.3mmol)，90℃下反应，TLC监测反应，反应完全后冷却至0℃，滴加水有沉淀析出，过滤烘干得褐色固体，即为化合物4-1(5.35g，产率98％)。
步骤(4)制备化合物5-1，方法如下：
取一洁净二口瓶中加入化合物4-1(3.15g，10mmol)，甲苯20mL和POCl3(5mL)，体系搅拌均匀后往体系中缓慢滴加Et3N(2.69mL)，加完后加热至75℃搅拌4小时，TLC监测反应，原料反应完全后往体系中滴加10mL溶解有原料8-1(1.6g)的乙腈溶液，继续在75℃下搅拌2小时，TLC监测反应，完全反应完后冷却至室温，过滤，滤饼加入到装有75毫升1.2M的氢氧化钠水溶液中，体系搅拌2小时后过滤，滤饼用10毫升水洗涤2次后烘干得黄色固体，即为化合物5-1(4.01g，91％)。
步骤(5)制备化合物7-1，方法如下：
取一洁净两口瓶，加入50mg化合物5-1、Pd(Ph3)2Cl28mg、CuI 2.3mg和5mL N,N-二甲基甲酰胺，用氮气置换体系三次后滴加187mg的DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)，体系搅拌均匀后滴加24mg的化合物6-1，反应体系在室温下搅拌,TLC监测(DCM:MeOH＝10:1)，反应完全后，加水有沉淀析出，过滤，滤饼烘干后过柱纯化得白色固体，即为化合物7-1(30mg，65％)。
该目标化合物的表征数据为：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):δ9.89(brs,1H),8.54(s,1H),8.29(s,1H),8.18-8.20(m,1H),7.81-7.85(m,1H),7.40-7.54(m,1H),7.21(s,1H),6.30(dd,J＝16Hz,8Hz,1H),6.11(dd,J＝12Hz,3Hz,1H),5.59(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),4.24(t,J＝8Hz,1H),2.78(t,J＝8Hz,2H),2.25(s,6H),1.67(s,6H).
实施例2
化合物7-2，N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-吗啉基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用N-(2-羟乙基)吗啉为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-2。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),8.69(t,J＝5.6Hz,1H),8.63(s,1H),8.56(s,1H),8.19(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.82(ddd,J＝9.0,4.3,2.7Hz,1H),7.42(t,J＝9.1Hz,1H),7.23(s,1H),6.27(dd,J＝17.1,10.0Hz,1H),6.16(dd,J＝17.1,2.3Hz,1H),5.66(dd,J＝10.0,2.4Hz,1H),4.26-4.31(m,4H),3.60(q,J＝4.7Hz,4H),2.79-2.83(m,2H),2.57-2.62(m,4H).
实施例3
化合物7-3，N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-(二甲氨基)乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤5)采用化合物6-2为原料，制备得到目标化合物7-3。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.93(s,1H),8.78(t,J＝5.8Hz,1H),8.69(s,1H),8.56(s,1H),8.21(dd,J＝7.0,2.6Hz,1H),7.84(dt,J＝7.5,3.4Hz,1H),
7.42(t,J＝9.1Hz,1H),7.22(s,1H),6.29(dd,J＝17.1,10.1Hz,1H),6.16(d,J＝16.9Hz,1H),
5.66(dd,J＝10.0,2.4Hz,1H),4.21-4.29(m,4H),2.77(t,J＝5.4Hz,2H),2.31(s,6H).
实施例4
化合物7-4，(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丁基-2-烯基酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用2-甲氧基乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-3为原料，制备得到目标化合物7-4。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),8.69-8.71(m,1H),8.64(s,1H),8.57(s,1H),8.19-8.20(m,1H),7.80-7.84(m,1H),7.44(t,J＝9.1Hz,1H),7.21(s,1H),6.27(dd,J＝16Hz,8Hz,1H),6.15(dd,J＝12Hz,3Hz,1H),5.65(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),4.22-4.31(m,4H),1.41(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例5
化合物7-5，N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-5。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),8.69-8.71(m,1H),8.64(s,1H),8.57(s,1H),8.19-8.20(m,1H),7.80-7.84(m,1H),7.44(t,J＝9.1Hz,1H),7.21(s,1H),6.27(dd,J＝16Hz,8Hz,1H),6.15(dd,J＝12Hz,3Hz,1H),5.65(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),4.22-4.31(m,4H),1.41(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例6
化合物7-6，N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用2-甲氧基乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-6。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),8.69-8.71(m,1H),8.64(s,1H),8.57(s,1H),8.19-8.20(m,1H),7.80-7.84(m,1H),7.44(t,J＝9.1Hz,1H),7.24(s,1H),6.27(dd,J＝16Hz,8Hz,1H),6.15(dd,J＝12Hz,3Hz,1H),5.65(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),4.23-4.33(m,4H),3.75-3.82(m,2H),3.38(s,3H).
实施例7
化合物7-7，(E)-N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯基酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用2-甲氧基乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-4为原料，制备得到目标化合物7-7。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.91(s,1H),8.56-8.57(m,2H),8.19-8.21(m,2H),7.83-7.85(m,1H),7.44(t,J＝9.1Hz,1H),7.20(s,1H),6.60(dt,J＝15.4,6.1Hz,1H),6.13(d,J＝15.5Hz,1H),4.28(dd,J＝5.6,3.2Hz,2H),3.77(dd,J＝5.3,3.2Hz,2H),3.34(s,3H),2.99(dd,J＝6.1,1.6Hz,2H),2.15(s,6H),1.67(s,6H).
实施例8
化合物7-8，(E)-N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯基酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤(3)中选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-5为原料，制备得到目标化合物7-8。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.61(dd,J＝5.0,1.6Hz,1H),8.53(d,J＝9.3Hz,2H),8.31(s,1H),8.05(d,J＝2.6Hz,1H),7.89(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.80–7.66(m,2H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.38(dd,J＝7.5,4.9Hz,1H),7.26(d,J＝9.1Hz,1H),7.15(s,1H),6.61(dt,J＝15.5,6.4Hz,1H),6.19(d,J＝15.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.30–4.14(m,2H),3.27-3.29(m,2H),2.35(s,6H),1.68(s,6H),1.42(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例9
化合物7-9，N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基 丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用8-2为原料，制备得到目标化合物7-9。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),8.59(d,J＝4.3Hz,1H),8.52(s,1H),8.50(s,1H),8.29(s,1H),8.04(d,J＝2.6Hz,0H),7.88(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.71(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),7.58(d,J＝7.9Hz,1H),7.48–7.30(m,1H),7.25(d,J＝9.0Hz,1H),7.14(s,1H),6.28(dd,J＝10.1Hz,2.3Hz,1H),5.59(dd,J＝10.1,2.3Hz,1H),5.60(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),5.28(s,2H),4.19(q,J＝6.8Hz,2H),1.68(s,6H),1.41(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例10
化合物7-10，N-(3-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用化合物8-2为原料，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-10。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.70(t,J＝5.6Hz,1H),8.61(s,1H),8.59(d,J＝4.8Hz,1H),8.51(s,1H),8.04(d,J＝2.6Hz,1H),7.93–7.81(m,1H),7.70(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.58(d,J＝7.8Hz,1H),7.43–7.30(m,1H),7.25(d,J＝9.1Hz,1H),7.17(s,1H),6.27(dd,J＝17.1,10.0Hz,1H),6.15(dd,J＝17.1,2.3Hz,1H),5.66(dd,J＝10.0,2.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.29(d,J＝5.6Hz,2H),4.24(q,J＝7.0Hz,2H),1.40(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例11
化合物7-11，N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用化合物8-3为原料，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-11。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.71(t,J＝5.6Hz,1H),8.62(s,1H),8.51(s,1H),8.03(d,J＝2.6Hz,1H),7.71(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.55–7.40(m,1H),7.29-7.33(m,2H),7.25(d,J＝9.0Hz,1H),7.22–7.10(m,2H),6.37–6.21(m,1H),6.16(dd,J＝17.1,2.3Hz,1H),5.66(dd,J＝10.0,2.3Hz,1H),5.24(s,2H),4.30(d,J＝5.6Hz,2H),4.24(q,J＝7.0Hz,2H),1.41(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例12
化合物7-12，(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丁基-2-烯基酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用化合物8-3为原料，步骤5)采用6-3为原料，制备得到目标化合物7-12。
该化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.61(s,1H),8.51(s,1H),8.48(t,J＝5.7Hz,1H),8.03(d,J＝2.6Hz,1H),7.71(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),7.55–7.41(m,1H), 7.37–7.12(m,5H),6.69(dd,J＝15.2,6.9Hz,1H),5.95(dd,J＝15.3,1.8Hz,1H),5.24(s,2H),4.26(d,J＝5.5Hz,2H),4.10(q,J＝5.3Hz,2H),1.78-1.82(m,3H),1.41(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例13
化合物7-13，N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用2-甲氧基乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用化合物8-3为原料，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-13。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),8.72(t,J＝5.6Hz,1H),8.64(s,1H),8.53(s,1H),8.05(d,J＝2.6Hz,1H),7.73(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),7.48(td,J＝8.1,6.1Hz,1H),7.40–7.11(m,5H),6.28(dd,J＝17.1,9.9Hz,1H),6.17(dd,J＝17.1,2.4Hz,1H),5.68(dd,J＝10.0,2.4Hz,1H),5.26(s,2H),4.30-4.33(m,4H),3.77(dd,J＝5.3,3.5Hz,2H),3.39(s,3H).
实施例14
化合物7-14，N-(3-(4-((3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)乙烯磺酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用化合物8-3为原料，步骤5)采用6-6为原料，制备得到目标化合物7-14。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.75(s,1H),8.62(s,1H), 8.52(s,1H),8.05–7.95(m,2H),7.71(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.50–7.42(m,1H),7.36–7.15(m,5H),6.86(dd,J＝16.5,10.0Hz,1H),6.14(d,J＝16.5Hz,1H),6.02(d,J＝10.0Hz,1H),5.25(s,2H),4.25(d,J＝6.9Hz,2H),4.05(q,7.0Hz,2H),1.42(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例15
化合物7-15，N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用甲醇为原料，操作方法如实施例1，制备得到目标化合物7-15。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6):δ9.91(s，1H)，8.56(d，J＝8.8Hz,1H),8.30(s,1H),8.17-8.22(m,1H),7.75-7.90(m,3H),7.43(t,J＝9.2Hz,1H),6.22-6.35(m,1H),6.05-6.15(m,1H),5.60(dd,J＝10,2Hz,1H),3.96(s,3H),1.69(s,6H).
实施例16
化合物7-16，N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-丙基-2-炔-1-基)丙烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用甲醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-2为原料，制备得到目标化合物7-16。
该化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.86(s,1H),8.65-8.8(m,1H),8.65(s,1H),8.58(s,1H),8.30(s,1H),8.16-8.25(m,1H),7.75-7.90(m,1H),7.43(t,J＝9.2Hz, 1H),6.22-6.35(m,1H),6.12-6.20(m,1H),5.65(dd,J＝10,1.2Hz,1H),4.31(d,J＝5.2Hz,2H),3.97(s,3H).
实施例17
化合物7-17，(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用甲醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-4为原料，制备得到目标化合物7-17。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.87(s,1H),8.65-8.8(m,1H),8.65(s,1H),8.58(s,1H),8.16-8.25(m,1H),7.74-7.90(m,1H),7.43(t,J＝9.2Hz,1H),7.23(s,1H),6.60-6.70(m,1H),6.14(d,J＝15.2Hz,1H),4.30(d,J＝5.6Hz,2H),3.97(s,3H),3.21(d,J＝5.6Hz,2H),2.29(s,6H).
实施例18
化合物7-18，(E)-N-(4-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-4-吗啉代丁基-2-烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用甲醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-7为原料，制备得到目标化合物7-18。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.91(s,1H),8.64(s,1H),8.57(s,1H),8.21(s,1H),7.85-8.21(m,1H),7.78-7.86(m,1H),7.44(t,J＝9.2Hz,1H),7.21(s,1H),6.50-6.63(m,1H),6.14(d,J＝15.6Hz,1H),3.95(s,3H),3.58(m,4H),3.05(d,J＝5.6Hz,2H),2.36(m,4H),1.24(s,6H).
实施例19
化合物7-19，(E)-N-(3-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)丙基-2-炔-1-基)-4-吗啉代丁基-2烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用甲醇为原料，操作方法如实施例1，步骤5)采用6-8为原料，制备得到目标化合物7-19。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.86(s,1H),8.58-8.65(m,2H),8.578(s,1H),8.15-8.25(m,1H),7.75-7.90(m,1H),7.44(t,J＝9.2Hz,1H),7.21(s,1H),6.55-6.68(m,1H),6.10(d,J＝15.6Hz,1H),4.28(d,J＝5.6Hz,1H),3.59(m,4H),3.07(d,J＝5.6Hz,2H),2.36(m,4H).
实施例20
化合物20，N-丙烯酰-4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-甲酰胺的制备。
按照以下线路合成：
步骤(1)制备化合物10，方法如下：
取一干燥洁净的500mL单口圆底烧瓶，依次加入9.9g丙二氰，37.4mL原甲酸三乙酯，35.4mL乙酸酐，升温至140℃反应6h。反应完后，加入少量活性炭继续30min，停止反应趁热过滤(加硅藻土)，用乙醇洗，滤液旋干(先用水泵旋干，再用油泵抽干)，得化合物10。
步骤(2)制备化合物11，方法如下：
取一500mL单口圆底烧瓶，加入300mL乙醇置于0℃，称取1.9g钠(剪碎)加入，加完升至10℃搅拌直至钠完全溶解(或者加入2.218g C2H5ONa代替)，然后加入5.1mL乙酰乙酸乙酯于室温下搅拌半小时，再加入2g化合物10于80℃反应半小时，冷却至室温。反应完后，旋干，加入100mL水于0℃下滴加浓盐酸(调pH为1-2)，析出大量固体，过滤干燥(如果干燥不完全，会抑制下一步的反应进行)，得化合物11。
步骤(3)制备化合物12，方法如下：
取一干燥洁净的100mL单口烧瓶，依次加入2.06g化合物11，2mL N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛,50mL甲苯，加热至105℃，反应5h左右(反应会产生水，加分水器分水)。反应完后，旋干，加入乙醚旋干固化，再加乙醚搅拌过滤，得化合物12。
步骤(4)制备化合物13，方法如下：
取一干燥洁净的50mL单口圆底烧瓶，依次加入1.42g化合物12,0.831g 3-氯-4-氟苯胺,10mL乙酸，加热至125℃回流反应1.5h。反应完后，溶液倒入100mL水中析出大量固体过滤，用大量水洗，乙醇洗干燥得化合物13。
步骤(5)制备化合物14，方法如下：
取一干燥洁净25ml圆底烧瓶，将K2CO3(6mmol)加入5mL DMF中，然后加入化合物13(2.0mmol)以及2-溴乙基甲醚(3.3mmol)，在60℃油浴温度下搅拌过夜，TLC监测反应。当原料反应完全后，加入20ml的水淬灭反应。反应液用乙酸乙酯萃取三次(3×10mL)，合并有机相，食盐水洗一次(20ml)，然后用Na2SO4干燥。过滤蒸除溶剂即得化合物14。
步骤(6)制备化合物15，方法如下：
取一洁净干燥圆底烧瓶，将化合物14(1mmol)溶于DMF(4mL)中，加入0.14mL甲酰胺(3.5mmol)。将反应体系加热至100℃，往反应体系中滴加NaOMe(30％)的甲醇溶液(0.33ml,1.8mmol)并在30分钟内滴加完毕。TLC监测反应，原料消耗完全后将反应体系冷却至室温并往反应体系中加入CH2Cl2(30ml)。反应体系用硅藻土过滤后得滤液。旋除溶剂即得粗品。过硅胶柱后得纯品化合物15。
步骤(7)制备化合物20，方法如下：
将化合物15(0.2mmol)在氮气保护下溶于3mL干燥的THF中。将反应体系冷却至0℃。将NaH(60％)(0.4mmol)分批加入反应体系中。反应体系在0℃下搅拌10分钟，然后升至室温搅拌45分钟。将反应体系冷却至0℃下，将溶解有丙烯酰氯(0.22mmol)的1mL干燥THF滴加入反应体系。滴加完毕后反应体系在0℃搅拌10分钟然后在室温下搅拌4小时。TLC监测反应，反应完全后加1.5M的盐酸淬灭反应，加乙酸乙酯萃取。有机相分别用饱和的碳酸铯溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂硅胶过柱纯化即得纯品化合物20。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)9.13(s,1H),8.84(s,1H),7.92(brs,1H),7.47(s,1H),7.42(d,J＝6.0Hz,1H),7.32(t,J＝9.2Hz,1H),7.21(t,J＝8.6Hz,1H),6.57(d,J＝16.4Hz,1H),6.19(dd,J＝16.4,10.4Hz),5.85(br s,1H),5.79(d,J＝10.4Hz,1H),4.44(t,J＝4.2Hz,2H),4.44(t,J＝4.2Hz,2H),3.88(t,J＝4.4Hz,2H),3.47(s,3H).
实施例21
化合物21，N-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-6-基)甲基)丙烯酰胺的制备。
按照以下线路合成：
将LiAlH4(0.5mmol)加入到25ml干燥的THF中，冷却至0℃。往反应体系中缓慢滴加溶解有化合物15(78mg,0.2mmol)的干燥THF溶液。滴加完全后在0℃下搅拌10分钟，然后加热至回流。待反应完全后，用饱和硫酸钠溶液淬灭反应。用THF萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后即得产物15-1。
将化合物15-1(0.14mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，于0℃下加入三乙胺(0.14mmol)后缓慢滴加丙烯酰氯(0.17mmol)。滴加完毕后缓慢升至室温，于室温下搅拌两小时。反应完全后，加入饱和NaHCO3水溶液淬灭反应。用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，食盐水洗后无水硫酸镁干燥，过柱纯化即得纯品化合物21。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)8.68(s,1H),7.90(d,J＝6.4Hz,1H),7.87(s,1H),7.54-7.51(m,2H),7.23(s,1H),7.16(t,J＝8.6Hz,1H),6.48(d,J＝17.2Hz,1H),6.20(dd,J＝17.2,10.4Hz),5.89(d,J＝10.4Hz,1H),5.41(s,2H),4.29(t,J＝4Hz,2H),3.83(t,4Hz,2H),3.46(s,3H).
实施例22
化合物22，N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)-2-氰基-2-烯酰胺的制备。
参照实施例1的方法制备，仅是在步骤3)选用乙醇为原料，操作方法如实施例1，步骤4)采用6-9为原料，制备得到目标化合物22。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),8.59(d,J＝4.3Hz,1H),8.52(s,1H),8.50(s,1H),8.29(s,1H),8.04(d,J＝2.6Hz,0H),7.88(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.71(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),7.58(d,J＝7.9Hz,1H),7.48–7.30(m,2H),7.25(d,J＝9.0Hz,1H),7.14(s,1H),5.60(dd,J＝8Hz,3Hz,1H),5.28(s,2H),4.19(q,J＝6.8Hz,2H),4.23(d,J＝7.9Hz,3H),1.68(s,6H),1.41(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例23
化合物23，N-(4-(4-((3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-甲基丁基-3-炔-2-基)丙烯酰胺的制备。按照以下线路合成：
二口瓶中加入0.5克市售购得的原料23-1、15毫升乙腈、15毫升水和15毫升醋酸，体系在零度下缓慢滴加0.8毫升的硫酸，搅拌30分钟溶液变澄清时加入0.11克的亚硝酸钠，升温至室温搅拌30分钟后滴加0.70克碘化钾的15毫升水溶液。加完后升至50度搅拌30分钟。冷却体系，有沉淀析出，过滤，滤饼用冰水洗涤后烘干得褐色固体，即为化合物23-2(0.41克，66％)。
取一洁净两口瓶，加入原料23-280mg、Pd(Ph3)2Cl28mg、CuI 2.3mg和5mL N,N-二甲基甲酰胺，用氮气置换体系三次后滴加187mg的DIPEA，体系搅拌均匀后滴加24mg的原 料6-1，反应体系在室温下搅拌,TLC监测(DCM:MeOH＝10:1)，反应完全后，加水有沉淀析出，过滤，滤饼烘干后过柱纯化得白色固体，即为化合物23(58mg，65％)。
该目标化合物的表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,1H),8.60(d,J＝4.8Hz,1H),8.47(d,J＝3.1Hz,1H),8.30(s,1H),7.88(t,J＝7.7Hz,1H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.44(d,J＝2.2Hz,1H),7.38(dd,J＝7.5,4.9Hz,1H),7.34–7.19(m,2H),6.29(dd,J＝17.2,10.1Hz,1H),6.10(dd,J＝17.1,2.3Hz,1H),5.58(dd,J＝10.1,2.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.21(q,J＝7.0Hz,2H),1.67(s,4H),1.42(t,J＝6.7Hz,3H).
对比例
参照文献：PCT Int.Appl.(2014),WO 2014063631A120140501和Nature Chemical Biology(2014),10(9),760-767的方法制备以下化合物：
实验例
一、体外酶抑制活性
用酶联免疫法测定酶的抑制活性。
将上述实施例制备得到的化合物进行酶抑制活性的测定，对EGFR和HER2酶抑制活性测定采用Z′-LYTETM激酶测试盒(invitrogenTM,Z′-LYTETMKinase assay kit-TYR6peptide,参考文献：Nature,373,pp.536-9(1995))进行测试。
具体方法如下：按照Z′-LYTETM激酶测试盒使用说明书进行试剂配置；先把酶和化合物分别按照一定的配比加于384孔板，混匀，放置30min；然后加入ATP，混匀，放置2h；加5μL Development Regent，混匀，于室温下，放置15min，30min，1h用酶标仪进行检测；1h后加入5μL的Stop regent，混匀后用酶标仪进行检测。计算相应的磷酸化比例，根据药物的浓度与对应的激酶抑制率作图，得到剂量反应曲线，从中求得药物的半数抑制浓度(IC50)。结果如下：
表1.体外酶抑制活性
注：a为0.1-10nM,b为10-100nM，c为100-1000nM。
由上述数据可知，本发明所提供的酪氨酸激酶不可逆抑制剂对EGFR及HER2两种酪氨酸激酶同时具有抑制作用，其半数抑制浓度与阳性对照物WZ4002和Afatinib相比，或优于阳性对照物，或至少于阳性对照物相当，特别是化合物7-15和化合物7-16，其对EGFR及 HER2两种酪氨酸激酶的半数抑制浓度均与阳性对照物相当，具有很好的酶抑制活性。
二、体外细胞抑制活性
上述化合物对EGFR和HER2酪氨酸激酶显示出较高抑制活性，以下进一步测试它们对EGFR和HER2相关的肿瘤细胞的抑制活性。
我们采用了MTT(噻唑蓝)法测定目标化合物对人非小细胞肺癌细胞系(Del19)Hcc827，表皮癌细胞系A431，人非小细胞肺癌细胞系H1975，人乳腺癌细胞系SK-BR-3、BT474和MCF-7，人胃癌细胞系BCG-823的抑制活性。
以下采用MTT(噻唑蓝)法检测样品对肿瘤细胞抑制活性。肿瘤细胞有：表皮癌细胞系A431，EGFRWT过表达，人乳腺腺癌细胞SK-BR-3，HER2过表达；人乳腺癌细胞系BT-474，EGFR和HER2过表达；对照组人乳腺癌细胞MCF-7，EGFR和HER2低表达。
1.MTT(噻唑蓝)法实验原理。
活细胞中线粒体的NADPH相关脱氢酶类，可以将黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色的formazan，细胞死亡，该酶失去活性，MTT不被还原。在酶标仪上于570nm波长处检测光密度(OD)值。从而测出药物作用下活性细胞和凋亡细胞的比例。
2.实验方法。
先对所有目标化合物粗筛5μM的抑制率，然后选择抑制率高的化合物进一步测定IC50。
3.MTT药物筛选实验流程。
(1).胰酶消化：按照胰酶消化细胞的流程进行，消化后的细胞收集于离心管中。
(2).计算细胞浓度：按照细胞计数的流程进行。
(3).用完全培养基稀释细胞至细胞浓度大约为30000个/ml。每孔加入100μL的细胞工作液，空白对照孔加入100μL的完全培养基。
(4).加药：受试药物用DMSO溶解到10mM，-20℃保存备用。实验前解冻，细胞贴壁后，用完全培养基稀释到100μM。药物浓度设置：最高终浓度为100μM，1：5等比稀释到20、4、0.8、0.16、0.032μM，共6个浓度梯度。最高浓度和次高浓度用完全培养基稀释，其余四个浓度用含2‰DMSO的完全培养基稀释。加入100μL的药物浓度于对应孔中，每个浓度做6个复孔。细胞对照孔只加入100μL含2‰DMSO的完全培养基。
(5).共培养：在37℃，5％CO2条件下共培养72h。
(6).加入MTT：小心吸去上清液，每孔加入100μL经培养基稀释的0.5mg/ml的MTT工作液，培养箱中共同孵育4～5h。
(7).吸光度测定：共同孵育后，小心吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，置振荡器上 振荡溶解10min，在BioTeck酶标仪上测定570nm处的吸光度。
(8).IC50计算：将OD数据导出到Excel，计算各浓度条件下细胞存活率，然后在GraphPadPrism 4软件上计算IC50。
注：细胞对照孔——不加药，不足体积用含2‰DMSO培养基补足，其余条件相同。
空白对照——只加200μL培养基。
4.实验结果。
具体实验结果如下：
表2.体外酶抑制活性IC50
注：a为0.1-10nM,b为10-100nM，c为100-1000nM。NA指未进行检测。
从上述结果中可以看出，本发明的喹唑啉衍生物类化合物，对于多种癌细胞系均有抑制作用，且其至少对一类癌细胞系的IC50小于阳性对照物，特别是化合物7-9,化合物7-10,化合物7-13,化合物7-16，对三类癌细胞系的IC50在0.1-10nM之间，比阳性对照物的IC50小三个数量级，具有非常好的活性。
并且，从上述结果中可以看出，酶活性结果和细胞活性结果并不完全一致，这可能是由于细胞活性实验受药物分子跨细胞膜转运、细胞中微环境的影响以及细胞内代谢等原因导致这一结果。
本发明通过设计并合成了大量化合物，并对其进行筛选，得到了式I所示的喹唑啉衍生物，具有非常好的细胞抑制活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。