用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌菌株、培养方法及应用与流程

本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌菌株、培养方法及应用。

背景技术：

微生物提高石油采收率技术(Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR)是利用微生物在油藏中的生命活动及其代谢产物来提高原油产量和采收率的一种生物技术，由于其具有应用范围广、实施成本低、经济效益显著等特点，因此受到广泛关注。不同的微生物菌种其代谢特性不同，产生的代谢产物不同，其驱油机理也不同，由此也形成了不同的微生物采油工艺。微生物驱油的机理主要包括：微生物生长和代谢过程中产生气体增加地层压力、降低原油粘度；产生有机酸改善油藏岩石的渗透率；产生生物表面活性剂和有机溶剂降低油水界面张力、提高洗油效率；产生生物聚合物控制流动度选择性封堵；降解原油重质组分从而降低原油粘度、提高原油流动性等。其中，利用微生物乳化原油从而降低原油粘度的微生物采油技术能够较为显著的提高原油采收率。

利用微生物乳化原油从而降低原油粘度的微生物采油技术的关键在于菌株的选用。申请公布号CN 104371940 A和CN 102757994 A的专利申请分别公开了能够代谢产生生物表面活性剂的假单胞菌和芽孢杆菌，但是这两种菌株的生长温度为37℃，适用温度范围窄。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种嗜热芽孢杆菌，其培养温度为25℃～40℃(参见生态学杂志2013，32(3):779-786；国外油田工程第25卷第7期16～18以及申请号为201380012425的中国专利申请)，适用温度范围仍然较窄。公布号CN 102399847 A的专利申请公开了一种高温芽孢杆菌LEY11，其发酵温度虽然达到了45℃～70℃，但是需要在地面发酵，操作较为复杂，不能满足现场需要。

综上，在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题:现有的能够乳化原油的菌株不能同时满足适用温度范围广并且不需要现场发酵的 要求。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种适用温度范围广并且不需要现场发酵的用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌菌株、培养方法及应用。

具体而言，包括以下的技术方案：

一种用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌(Bacillus thermocopriae)BLG69菌株，该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株已于2015年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为：热堆肥芽孢杆菌(Bacillus thermocopriae)，保藏编号为CGMCC No.11441，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的16S rRNA基因序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，其16S rRNA在GenBank的登录号为KT807465。

该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的菌落形态学特征为:固体发酵培养基上培养2天的菌落直径大小为2～4mm，菌落呈圆形，表面平滑，边缘整齐，乳黄色；细胞形态学特征为：细胞形状为杆状，长为2～5um，宽为0.5～0.6um，属革兰氏阳性菌，可形成端生芽孢；兼性厌氧生长，过氧化氢酶和氧化酶阳性、不能利用葡萄糖。该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的生长环境为：温度37℃～60℃，pH值6～9，氯化钠浓度0～3％(w/v，质量体积浓度)；最适生长环境为：温度45℃～50℃，pH值7.5，氯化钠浓度1～2％(w/v，质量体积浓度)。

上述热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株采用以下培养方法培养得到，所述培养方法包括以下步骤：

步骤a，将采集自华北油田45℃～60℃油藏的油水样品置于经过灭菌的富集培养基中，在45℃～60℃、转速120～200rpm的摇床中振荡培养，经过分离纯化得到以原油为唯一碳源的菌株；

步骤b，将步骤a所得以原油为唯一碳源的菌株接种到发酵培养基中，在温度45℃～60℃、转速120～200rpm的摇床中振荡培养72小时，得到发酵液；检测所述发酵液的表面张力，所述表面张力达到40mN/m以下的发酵液对应的菌株即为所述热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株；

其中，

步骤a中，所述富集培养基包括以下质量份数的组分：

清水，100份；原油，8～10份；氯化铵(NH₄Cl)，0.09～0.12份；硝酸钠(NaNO₃)，0.18～0.21份；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.04～0.06份；硫酸钠(Na₂SO₄)，0.18～0.21份；硫酸镁(MgSO₄)，0.02～0.03份；碳酸钠(Na₂CO₃)，0.04～0.06份；醋酸钠(NaAc)，0.02～0.03份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.09～0.10份；所述富集培养基的pH值为7.5～8.0；

步骤b中，所述发酵培养基包括以下质量份数的组分：

油藏产出水，100份；氯化铵，0.08～0.11份；硝酸钠，0.14～0.18份；磷酸氢二钾，0.04～0.06份；硫酸镁，0.01～0.02份；氯化钠，0.8～1.1份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.1～0.12份；原油,5～8份；所述发酵培养基的pH值为7.5～8.0。

优选地，步骤a中，将采集自华北油田55℃油藏的油水样品置于经过灭菌的富集培养基中。

优选地，步骤b中，所述发酵培养基的装液量为250ml三角瓶装液量100ml或者50ml试管装液量10ml。

利用上述的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株提高原油采收率中的方法为，向含有所述热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的油藏中注入激活剂，关井预设时间后进行原油开采；其中，所述激活剂包括以下质量份数的组分：油藏产出水，100份；氯化铵，0.08～0.11份；硝酸钠，0.14～0.18份；磷酸氢二钾，0.04～0.06份；硫酸镁，0.01～0.02份；氯化钠，0.8～1.1份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.1～0.12份；原油，5～8份。

优选地，所述油藏的温度为37℃～60℃。

本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：

本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株能够以原油作为唯一碳源，在37℃～60℃的温度下代谢产生乳化剂，从而实现对原油进行乳化降低原油粘度，提高原油采收率。该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株在45℃下培养72小时后的发酵液的表面张力为29～32mN/m，乳化力90％以上，具有较强的乳化原油的能力。同时，该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株对油藏环境具有良好的适应能力，因此利用其进行驱油时，不需要在地面发酵，可以通过向油藏内注入能够促进其生长代谢的激活剂来达到提高原油采收率的效果。综上，本发明实施例提供 的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株适用温度范围广并且不需要现场发酵，在中高温油藏微生物采油技术领域具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；

图2为实施例4中热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株在发酵培养基中培养后原油乳化情况图；

图3为实施例4中未接种菌株的发酵培养基。

生物保藏信息：本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株已于2015年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为：热堆肥芽孢杆菌(Bacillus thermocopriae)，保藏编号为CGMCC No.11441；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例提供一种用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌(Bacillus thermocopriae)BLG69菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11441。

该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的16S rRNA基因序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，含有1402bp，GenBank登录号为KT807465，具体如下：

GCAGTCGAGCGGACCAATAGAAGCTTGCTTCTGTTGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATTCATCCCCTCGCATGAGGGGGTGCTGAAAGTCGGTTCACGCTGACACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGA GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTACGACCTCCCTAGAGATAGGGATTTCCCCTTCGGGGGACGGAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTCGAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACC。

热堆肥芽孢杆菌(Bacillus thermocopriae)是Han等于2013年基于16S rRNA基因的系统发育分析和其它特性建立的一个嗜热芽孢杆菌新种(参见International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.(2013),63,3024–3029)。目前报道了一个SgZ-7(JX113681)菌株，该SgZ-7菌株是从我国东莞堆肥样品中分离获得。该SgZ-7菌株可以发酵葡萄糖产酸，但是不能产生生物表面活性剂来乳化原油。

将本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中的序列进行比对，发现其与芽孢杆菌属成员具有较高的序列相似性。用Neighbor2Joining方法构建的系统发育树(图1)表明为芽孢杆菌属的新成员，与上述热堆肥芽孢杆菌Bacillus thermocopriae SgZ-7菌株具有99.86％同源性，为不同于热堆肥芽孢杆菌模式菌SgZ-7的新菌株。

本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株在不含原油的TSA(大豆酪蛋白)固体发酵培养基上生长良好，菌落呈乳黄色圆形，大小不一，直径2～4mm，表面光滑湿润，边缘平整有透明圈。其细胞为杆状，长为2～5um，宽为0.5～0.6um，产芽孢，具有运动性，革兰氏染色为阳性，兼性厌氧生长，过氧化氢酶和氧化酶阳性、不能利用葡萄糖。其生长环境为：温度37℃～60℃，pH值6～9，氯化钠浓度0～3％(w/v，质量体积浓度)；最适生长环境为：温度45℃～50℃，pH值7.5，氯化钠浓度1～2％(w/v，质量体积浓度)。

该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株能够以原油作为唯一碳源，在37℃～60℃的温度下代谢产生生物乳化剂乳化原油，降低原油粘度，并且对油藏环境具有良好的适应能力，在利用其进行驱油时，不要在地面发酵，可以通过向油藏内注入能够促进其生长代谢的激活剂来达到提高原油采收率的效果。因此，该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株在中高温油藏微生物采油技术领域具有良好的应用前景。

本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株是从华北油田45℃～60℃油藏的油水样品中分离得到，具体培养筛选方法如下：

步骤1，将采集自华北油田45℃～60℃油藏的油水样品置于经过灭菌的富集培养基中，在温度45℃～60℃、转速120～200rpm的摇床中振荡培养，经过分离纯化得到以原油为唯一碳源的菌株；由于在油水样品中存在多种能够以原油作为唯一碳源的菌株，因此需要对得到的能够以原油为唯一碳源的菌株进行进一步筛选，得到乳化原油能力强的菌株。

步骤2，将步骤1所得以原油为唯一碳源的菌株分别接种到发酵培养基中，在温度45℃～60℃、转速120～200rpm的摇床中振荡培养72小时，得到发酵液；检测所得发酵液的表面张力，能够使发酵液的表面张力达到40mN/m以下的菌株即为本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株；

其中，

步骤1中所用的富集培养基包括以下质量份数的组分：清水，100份；原油，8～10份；氯化铵，0.09～0.12份；硝酸钠，0.18～0.21份；磷酸氢二钾，0.04～0.06份；硫酸钠，0.18～0.21份；硫酸镁，0.02～0.03份；碳酸钠，0.04～0.06份；醋酸钠，0.02～0.03份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.09～0.10份；所述富集培养基的pH值为7.5～8.0；

步骤2中所用的发酵培养基包括以下质量份数的组分：油藏产出水，100份；氯化铵，0.08～0.11份；硝酸钠，0.14～0.18份；磷酸氢二钾，0.04～0.06份；硫酸镁，0.01～0.02份；氯化钠，0.8～1.1份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.1～0.12份；原油,5～8份；所述发酵培养基的pH值为7.5～8.0。

在上述的培养方法中，步骤1中，优选对采集自华北油田55℃油藏的油水样品进行分离纯化来得到本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株。

在上述的培养方法中，步骤2中，发酵培养基的装液量优选为250ml三角瓶装液量100ml或者50ml试管装液量10ml。

在上述的培养方法中，步骤1中，在富集培养基中培养的温度可以为45℃、50℃、55℃、60℃等。

在上述的培养方法中，步骤2中，在发酵培养基中培养的温度可以为45℃、50℃、55℃、60℃等。

由于本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株本身就存在于油藏中，因此可以通过向油藏当中注入能够促进其生长代谢的激活剂来加快其生长代谢的速度，促进其代谢产生生物乳化剂从而乳化原油、降低原油粘度，提高原油采收率。可以在向油藏中注入激活剂后关井一段时间，例如关井3天以上，再进行原油开采，使热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株能够充分的生长代谢。所用激活剂可以采用以下的配方(质量份数)：油藏产出水，100份；氯化铵，0.08～0.11份；硝酸钠，0.14～0.18份；磷酸氢二钾，0.04～0.06份；硫酸镁，0.01～0.02份；氯化钠，0.8～1.1份；酵母粉，0.04～0.06份；玉米浆，0.1～0.12份；原油，5～8份。

本发明实施例提供的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株特别适用于温度为37℃～60℃的油藏。

下面通过具体实验数据对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的培养筛选方法及其乳化原油性能进行进一步详细说明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法；以下实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

以下实施例中所用原油均为来自华北油田55℃油藏的原油，所用油藏产出水均为来自华北油田55℃油藏的油藏产出水。

以下实施例中进行表面张力测定所用的仪器为：JYW-200型表界面张力仪，购自河北省承德市鼎盛试验机公司。

实施例1

本实施例提供一种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的分离筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，将富集培养基在121℃下高压蒸汽灭菌30min，然后将采集自华北油田55℃油藏的油水样品置于经过灭菌的富集培养基中，在温度60℃、转速200rpm的摇床中振荡培养，富集以原油为唯一碳源的菌株。之后在不含原油的固体培养基上进行平板划线分离纯化，获得纯的以原油为唯一碳源的菌株；所用富集培养基的配方为：

清水，1000ml(即1000g)；氯化铵，1g；硝酸钠，2g；磷酸氢二钾，0.5g；硫酸钠，2g；硫酸镁，0.2g；碳酸钠，0.5g；醋酸钠，0.2g；酵母粉，0.5g；玉米浆，1g；原油，100g；该富集培养基的pH值为7.5。

步骤2，将步骤1所得以原油为唯一碳源的菌株分别接种到发酵培养基中，培养基的装液量为250ml三角瓶装液量100ml；在温度45℃、转速200rpm的摇床中振荡培养72小时，得到发酵液；检测所得发酵液的表面张力，其中，表面张力为32mN/m的发酵液对应的菌株即为热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株；所用发酵培养基配方为：

油藏产出水，1000ml(即1000g)；氯化铵，1g；硝酸钠，1.5g；磷酸氢二钾，0.5g；硫酸镁，0.1g；氯化钠，10g；酵母粉，0.5g；玉米浆，1g；原油，50g；该发酵培养基的pH值为7.5。

实施例2

本实施例提供一种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的分离筛选方法，该方法与实施例1提供的方法的区别在于：

步骤2中培养基的装液量为50ml试管装液量10ml。

实施例3

本实施例提供一种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的分离筛选方法，该方法与实施例1提供的方法的区别在于：

步骤2中，将步骤1得到的以原油为唯一碳源的菌株接种到含有原油的TSA培养基中。含有原油的TSA培养基的配方如下：

氯化钠，5g；大豆蛋白胨，5g；酪蛋白胨，10g；油藏产出水1000ml；原油，50g；该TSA培养基的pH为7.5。

实施例4

本实施例对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株乳化原油的性能进行测试，具体步骤如下：

将热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株接种母液接种于发酵培养基中，接种量为1％，培养基的装液量为50ml试管装液量10ml；在60℃、200rpm条件下的摇床中振荡培养3天；所用发酵培养基的配方为：

油藏产出水，1000ml；氯化铵，1g；硝酸钠，1.5g；磷酸氢二钾，0.5g；硫酸镁，0.1g；氯化钠，10g；酵母粉，0.5g；玉米浆，1g；原油，50g；pH为7.5。

将未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的空白发酵培养基也在60℃、200rpm条件下的摇床中放置3天作为对比。

如图2和图3所示，接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中原油明显被乳化，粘度降低，流动性得到改善，而未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中的原油未见乳化。

实施例5

本实施例对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株乳化原油的性能进行测试，本实施例与实施例4的区别在于：培养温度为55℃。

与实施例4结果相似，接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中原油明显被乳化，粘度降低，流动性得到改善，而未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中的原油未见乳化。

实施例6

本实施例对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株乳化原油的性能进行测试，本实施例与实施例4的区别在于：培养温度为50℃。

与实施例4结果相似，接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中原油明显被乳化，粘度降低，流动性得到改善，而未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中的原油未见乳化。

实施例7

本实施例对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株乳化原油的性能进行测试，本实施例与实施例4的区别在于：培养温度为45℃。

与实施例4结果相似，接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中原油明显被乳化，粘度降低，流动性得到改善，而未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的发酵培养基中的原油未见乳化。

实施例8

本实施例对热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株乳化原油的性能进行测试，本实施例与实施例4的区别在于：所有培养基为含有原油的TSA培养基，培养温度为45℃，培养时间为2天。其中，含有原油的TSA培养基的配方为：

氯化钠，5g；大豆蛋白胨，5g；酪蛋白胨，15g；油藏产出水，1000ml；原油，50g；pH为7.5。

与实施例4结果相似，接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的培养基中原油明显被乳化，粘度降低，流动性得到改善，而未接种热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株的培养基中的原油未见乳化。

上述实施例4～8中的培养液表面张力为29mN/m～32mN/m。

从上述实施例4～8可以看出，热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株能够以原油作为碳源进行生长代谢，在代谢过程中产生生物乳化剂，对原油进行乳化，降低原油粘度，从而有利于原油的开采，提高原油采收率。

实施例9

本实施例对实施例4～8所得培养液的乳化能力进行测定，具体步骤如下：

在25℃下，分别将实施例4～8中的培养液与液体石蜡混合加入到10ml离心管中，其中培养液用量为4ml，液体石蜡用量为1ml，剧烈振荡1min后静置24小时，观察乳化层的分层情况。结果表明，乳化层略有分层，乳化力在90％以上。

综上，本发明实施例提供了一种在37℃～60℃条件下能够以原油作为碳源代谢产生生物乳化剂乳化原油从而提高原油采收率的热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株。该热堆肥芽孢杆菌BLG69菌株适用温度范围广，培养方法简单，生长速度快，并且利用其进行驱油时不需要在地面发酵，在中高温油藏微生物采油技术领域具有良好的应用前景。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。