一种单克隆抗体FnAb12及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种单克隆抗体fnab12及其应用。
背景技术：
：fcrn(neonatalfcreceptor，新生儿fc受体)是主要组织相容性复合体i类分子(mhc-i)的结构类似物，它是由两条多肽链非共价偶联组成异源性二聚体，一条是i型跨膜蛋白α链，由胞外的α1、α2、α3三个结构域,跨膜区以及胞内段组成，另一条是β2-微球蛋白链(β2m)。fcrn的主要功能是结合igg分子的fc段和血清白蛋白(sa)，阻止了其内吞后进入细胞的蛋白降解通路，从而延长了它们在体内的寿命。免疫球蛋白(igg)和白蛋白(serumalbumin,sa)，是人体含量最大的两种蛋白分子，约占整个血浆蛋白的80％，各自的含量大约为12和40mg/ml。sa在体内的功能主要包括转运各种小分子物质，维持血液ph和渗透压等。而igg作为主要的抗体亚类起到保护机体免遭病原体侵害的重要作用。igg和sa在体内半衰期长达三周左右，远远高于体内的其他大多数蛋白，主要原因就是它们和fcrn的相互作用，阻止了其在细胞内的降解。已知fcrn存在于内涵体中，血液循环中的igg和sa在血管内皮细胞等的内吞作用下，进入胞内内涵体，在内涵体酸性ph值的条件下，fcrn与igg和sa结合，结合的亲和力在500nm-2000nm之间，从而保护igg和sa免遭进一步的代谢降解。并通过内涵体的再循环，重新回到细胞表面，在血液中性ph的条件下(即ph7.4的条件下)亲和力高于10um，igg和sa与fcrn解离，重新进入血流循环。根据这一机理，能够利用fcrn介导的igg和sa的循环机制，延长蛋白药物在体内的循环半衰期。如通过基因工程的方法，将fc段或者sa与药物或蛋白等偶联，或者开发能稳定结合igg或sa的特异性配体，把治疗药物通过化学或生物的方式偶联到这些配体上，从而间接达到延长体内生存期的目的。如已上市的产品抗自身免疫疾病药物enbrel和alprolix等。但是，由于野生型的fc段除了与fcrn结合的功能，还可以结合其他fc受体，并可能激发抗体介导的细胞毒性反应(adcc)的能力，所以药物－fc偶联产品也会产生复杂的副作用。蛋白－sa偶联也类似。所以研究者们一直在致力于对fc段的序列或者sa的序列进行了各种突变，通过改变在不同ph下与fcrn的结合效率，得到了较好的igg持续血药浓度。其中ph相关的fcrn结合特性的目的，是为了药物在内吞体中(ph为6.0-6.5)与fcrn有特异性的高效的结合，而当循环到细胞表面时(ph为7.2-7.4)，又能有最大程度的释放。但是，影响这一效果的因素有很多，在本领域中很难获得具有合适特性的蛋白分子。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种单克隆抗体fnab12及其应用，实验结果表明，将本发明获得的抗体序列与蛋白、多肽或其它药物分子偶联，利用fcrn的循环保护机制，能够极大地延长药物的半衰期和疗效。在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有以下的一个或多个互补决定区cdr：seqidno:22所示的cdr1，seqidno:24所示的cdr2，和seqidno:26所示的cdr3。在另一优选例中，所述重链可变区具有seqidno:28所示的氨基酸序列。本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区cdr：seqidno:30所示的cdr1’，seqidno:32所示的cdr2’，和seqidno:34所示的cdr3’。在另一优选例中，所述的轻链可变区具有seqidno:36所示的氨基酸序列。本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或本发明第四方面所述的轻链。在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗fcrn蛋白的抗体。在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体(scfv)、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；(ii)多肽、蛋白药物序列；以及(iii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。在另一优选例中，所述多肽蛋白药物选自下组：胰岛素、il-2、干扰素、降 钙素、ghrh肽、肠肽类似物、白蛋白、其它细胞因子、和激素等。在另一优选例中，所述多肽蛋白药物为单链抗体(scfv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6×his标签、gggs序列、flag标签。在另一优选例中，所述的重组蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体；或(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有seqidno:21、23、25、27、29、31、33、或35所示的序列。本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及(ii)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九面所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了对构建好的单链抗体噬菌体文库进行筛选的方法。图2显示了典型的fcm(流式细胞仪检测)结果，显示选定的噬菌体克隆与hfcrn&β2m或hla-a2&β2m在ph6.0和ph7.4的结合。图3显示了g12与glp-1r-fc蛋白的结合。glp-1r-fc或higg偶联到cm5芯片上，将200nm的g8、fnab8、g12、fnab12高速流过芯片表面检测他们与glp-1r-fc和higgfc的结合。图4显示了g12与hfcrn蛋白的结合。hfcrn&β2m固定于cm5芯片，将200nm的g12、fnab12高速流过芯片表面来检测它们与hfcrn在ph6.0和ph7.4的结合。图5显示了g12对hek293/cre-luc/glp-1r细胞的效果。图6显示了体内的对食物诱导糖尿病(diet-induceddiabetis)小鼠模型的降血糖疗效。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种结合hfcrn的单克隆抗体，实验结果表明，将本发明获得的序列与蛋白或多肽偶联，利用fcrn的循环保护机制，可以极大地延长半衰期和疗效。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的 数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。fcrn本发明的单克隆抗体针对fcrn(新生儿fc受体)，并且与fcrn的结合具有显著的ph依赖性。本发明的一方面提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合fcrn，并且所述单克隆抗体与fcrn的结合具有ph依赖性。在本发明的一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体在约ph≥7.0(优选地≥7.2，更优选地≥7.4；最优选地≥7.6；并且ph≤8.5)的条件下与fcrn的结合活性为a1；所述单克隆抗体在约ph≤6.8(优选地≤6.6，更优选地≤6.4；最优选地≤6.2；并且ph≥3.0)的条件下与fcrn的结合活性为a2；则a1/a2≥100(优选地≥200，更优选地≥400；最优选地≥600；并且ph≤10)。单克隆抗体和fcrn的结合活性，可以采用本领域常规的方法进行检测，如文献1中报道的方法。在本发明的一个优选的实施方式中，所述fcrn的氨基酸序列为：抗体如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一 端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nihpubl.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：iga,igd,ige,igg和igm，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如igg1,igg2,igg3,igg4,iga和iga2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本发明还包括具有所述的抗fcrn蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗fcrn蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，cdr)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗fcrn蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗fcrn蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab或(fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。如本文所用，术语“重链可变区”与“vh”可互换使用。如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementaritydeterminingregion,cdr)”可互换使用。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体(fnab8)的重链可变区包 括以下三个互补决定区cdr：cdr1，其氨基酸序列为gytftgyy(seqidno:4)，其编码核苷酸序列为，ggatacaccttcaccggctactat(seqidno.:3)；cdr2，其氨基酸序列为isphsggt(seqidno.:6)，其编码核苷酸序列为，atcagccctcacagtggtggcaca(seqidno.:5)；cdr3，其氨基酸序列为argvygmdr(seqidno.:8)，其编码核苷酸序列为，gcgcgcggtgtttacggtatggatcgt(seqidno.:7)。在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：qvqlvqsgaevkkpgasvkvscktsgytftgyyihwvrqapgqglewmghisphsggtdyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycargvygmdrwgqgtlvtvss(seqidno.:10)；其编码核苷酸序列为：caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagacttctggatacaccttcaccggctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggacatatcagccctcacagtggtggcacagactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacactgccgtgtattactgtgcgcgcggtgtttacggtatggatcgttggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctca(seqidno.:9)。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。如本文所用，术语“轻链可变区”与“vl”可互换使用。在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体(fnab8)的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区cdr：cdr1’，其氨基酸序列为ssnigsns(seqidno:14)，其编码核苷酸序列为，agctccaacatcggaagtaatagt(seqidno.:13)；cdr2’，其氨基酸序列为snn(seqidno:16)，其编码核苷酸序列为，agtaataat(seqidno.:15)cdr3’，其氨基酸序列为aawddslngrvl(seqidno:18)，其编码核苷酸序列为，gcagcgtgggatgacagcctgaatggccgtgtacta(seqidno.:17)在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：qavltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsnsvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslngrvlfgggtkltvl(seqidno.:20)，其编码核苷酸序列为：caggctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaagtaatagtgtaaactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcagcgtgggatgacagcctgaatggccgtgtactattcggcggagggaccaagctgaccgtccta(seqidno.:19)。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体(fnab12)的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：cdr1，其氨基酸序列为gytftsyd(seqidno:22)，其编码核苷酸序列为，ggatacaccttcaccagttatgat(seqidno.:21)；cdr2，其氨基酸序列为mnpnsgnt(seqidno.:24)，其编码核苷酸序列为，atgaaccctaacagtggtaacaca(seqidno.:23)；cdr3，其氨基酸序列为argvdlgdg(seqidno.:26)，其编码核苷酸序列为，gcgcgcggtgttgacctgggtgatggt(seqidno.:25)。在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqatgqglewmgwmnpnsgntgyaqkfqgrvtmtrntsistaymelsslrsedtavyycargvdlgdgwgqgtlvtvss(seqidno.:28)；其编码核苷酸序列为：gaggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcaactgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccaggaacacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcggtgttgacctgggtgatggttggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctca(seqidno.:27)。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。如本文所用，术语“轻链可变区”与“vl”可互换使用。在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体(fnab12)的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区cdr：cdr1’，其氨基酸序列为qdidnn(seqidno:30)，其编码核苷酸序列为，caggacattgacaacaac(seqidno.:29)；cdr2’，其氨基酸序列为das(seqidno:32)，其编码核苷酸序列为，gatgcgtcc(seqidno.:31)cdr3’，其氨基酸序列为qqyynlplt(seqidno:34)，其编码核苷酸序列为，caacagtattacaatctgcctctgact(seqidno.:33)在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：diqltqspsslsasvgdrvtltcqatqdidnnlnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisdlqpedvatyycqqyynlpltfgggtkvdik(seqidno.:36)，其编码核苷酸序列为：gacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatccgttggcgacagagtcaccctcacttgccaggcgactcaggacattgacaacaacttaaattggtatcaacaaaagccggggaaagcccctaagctcctgatctacgatgcgtccaatttggaaacaggagtcccgtcacggttcagcgggagtggatctgggacagattttactttcaccattagtgacctacagcctgaagatgttgcaacatattactgtcaacagtattacaatctgcctctgactttcggcggagggaccaaagtggatatcaaa(seqidno.:35)。在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合fcrn蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如seqidno.:30的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如seqidno.:36的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。在另一优选例中，所述的抗体为抗fcrn蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人igg1、igg2等的重链恒定区或轻链恒定区。本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少约90％同源性，较佳地至少约95％同源性。一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明抗体指具有fcrn蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸 进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno.:21、23、25、27、29、31、33、或35所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的 变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与seqidno.:21、23、25、27、29、31、33、或35所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与seqidno.:10和/或seqidno.:20所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、il-2、干扰素、降钙素、ghrh肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(koppe等，2005，癌转移评论(cancermetastasisreviews)24，539)；2.生物毒(chaudhary等，1989，自然(nature)339，394；epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(cancerimmunologyandimmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如il-2等(gillies等，1992，美国国家科学院院刊(pnas)89，1428；card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(cancerimmunologyandimmunotherapy)53，345；halin等，2003，癌症研究(cancerresearch)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(lapotko等，2005，癌症通信(cancerletters)239，36；huang等，2006，美国化学学会杂志(journaloftheamericanchemicalsociety)128，2115)；5.病毒颗粒(peng等，2004，基因治疗(genetherapy)11，1234)；6.脂质体(mamot等，2005，癌症研究(cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。本发明的药物组合物可直接用于结合fcrn蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的主要优点在于：(1)本发明提供的单克隆抗体，其与fcrn结合的亲和力在弱酸性ph时显著高于igg和sa,而在中性ph时保持了与igg和sa相似的弱亲和力，可以比igg和sa更有效的利用fcrn进行在体内的再循环，从而显著的延长半衰期；(2)本发明的单克隆抗体，与fcrn的结合显著地具有ph依赖性，能够用作药物的载体，与多肽、蛋白或其它药物偶联或重组表达后，通过延长药物的半衰期，降低药物的给药剂量和频率，降低药物成本的同时，可以增加病人的顺应性；(3)本发明的单克隆抗体，可以用于制备单链抗体或双链抗体，与药物分子偶联或重组表达，由于单链抗体和双链抗体分子量较小，可以用非哺乳动物细胞系统进行表达，从而简化生产流程，降低生产成本；(4)本发明提供的单克隆抗体可以为人源抗体，无须再进行人源化。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，higg,hla-a2蛋白购自invitrogen；b2m,glp-1r-fc购自义翘神州生物技术有限公司；萤光素酶检测试剂盒和检测仪器购自promega公司；亲和素包被的酶标板购自invitrogen；生物素标记试剂盒购自solulink；等离子表面共振技术检测用的仪器、缓冲液，耗材等均购自gehealthcare；检测用的hfcrn&b2m蛋白，表达hfcrn&b2m的细胞株egfp-fnrn和表达hla-a2&b2m的细胞株egfp-hla-a2由发明人按参考文献2、3制备；其余的通用细胞培养和转染试剂购自invitrogen,化学试剂购自sigma公司。实施例1单克隆抗体的筛选和制备本实例中，对构建好单链抗体噬菌体文库进行筛选，具体筛选方法如图1 所示，即先将b2m和hfcrn&b2m进行生物素标记，然后先将生物素标记的b2m与噬菌体抗体文库混合，进行差减法筛选，用偶联有亲和素蛋白的磁珠去除与b2m结合的噬菌体后，其上清与生物素标记的hfcrn&b2m蛋白混合，用磁珠收集与hfcrn结合的噬菌体，扩增后进行下一轮的淘选，连续进行三轮淘选后，挑取单个噬菌体扩增，应用噬菌体酶联免疫吸附检测方法鉴定阳性的噬菌体，然后测序，将基因克隆到新的表达载体上，表达抗体并纯化，进行随后的结合、亲和力等鉴定。通过在不同ph值(ph6.0/ph7.4)的差相淘选，筛选到两株能特异性识别humanfcrn，具有高亲和力，而结合常数具有显著的ph依赖性的单链抗体-fnab8和fnab12。在ph6.0条件下，其针对fcrn的亲和力比野生型igg和sa高100-200倍，而在ph7.4时的亲和力则与野生型igg和sa差不多(>10um)，具体参数见表1。该单链抗体与fcrn的结合在细胞水平上与igg同样具有ph依赖性，实验结果表明，应用表达hfcrn&b2m的hek293细胞株和表达hla-a2&b2m的对照细胞株，检测了fnab8和fnab12与fcrn结合的特异性和ph依赖性，具体而言，fnab8和fnab12与higg一样，不结合表达hla-a2的hek293细胞(下层)，在中性ph条件下也不与表达hfcrn的hek293细胞结合(中层)，只有在弱酸性ph条件下，fnab8和fnab12特异性的结合细胞表达的hfcrn(上层)，而阴性对照抗体(nc)与hla-a2和hfcrn均不结合。如图2所示，应用表达hfcrn&b2m的hek293细胞株和表达hla-a2&b2m的对照细胞株，检测了fnab12与fcrn结合的特异性和ph依赖性，具体而言，fnab12与higg一样，不结合表达hla-a2的hek293细胞(下层)，在中性ph条件下也不与表达hfcrn的hek293细胞结合(中层)，只有在弱酸性ph条件下，fnab12特异性的结合细胞表达的hfcrn(上层)，而阴性对照抗体(nc)与hla-a2和hfcrn均不结合。表1.fnab8和fnab12对hfcrn的亲和力配体样本kd(ph6.0)kd(ph7.4)hfcrn&b2mfnab82.62e‐09>10umhfcrn&b2mfnab121.50e‐08>10um采用本领域中常规的方法对fnab8和fnab12抗体进行测序和分析，结果表明如下：fnab8抗体seqidno.:fnab12抗体seqidno.:重链cdr14重链cdr122重链cdr26重链cdr224重链cdr38重链cdr326重链可变区10重链可变区28轻链cdr114轻链cdr130轻链cdr216轻链cdr232轻链cdr318轻链cdr334轻链可变区20轻链可变区36实施例2融合蛋白的制备将表达glp1(7-36氨基酸，含有a8g，g22e，r36g三个突变位点)的核苷酸序列用(g4s)3连接序列连接到fnab8或fnab12的核苷酸序列的5’端，将基因序列合成后插入表达载体pcdna3.1中(金斯瑞生物技术有限公司)，然后将质粒转染哺乳动物细胞制备蛋白。本实施例中所使用的glp1(aa7-36)蛋白的氨基酸序列如下：hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvkgg(seqidno.:2)本实例中成功地将glp1(aa7-36)分别与两株单链抗体融合表达，制备得到了融合蛋白，与fnab8融合表达制得的融合蛋白命名为g8，与fnab12融合表达制得的融合蛋白命名为g12。融合蛋白g8的氨基酸序列如下：hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvkgggggggsggggsggggsqavltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsnsvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslngrvlfgggtkltvlgsrggggsggggsggggslemaqvqlvqsgaevkkpgasvkvscktsgytftgyyihwvrqapgqglewmghisphsggtdyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycargvygmdrwgqgtlvtvss(seqidno.:11)，其中，下划线部分为单链抗体序列。融合蛋白g12的氨基酸序列如下：hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvkgggggggsggggsggggsdiqltqspsslsasvgdrvtltcqatqdidnnlnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisdlqpedvatyycqqyynlpltfgggtkvdikrsrggggsggggsggggslemaevqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqatgqglewmgwmnpnsgntgyaqkfqgrvtmtrntsistaymelsslrsedtavyycargvdlgdgwgqgtlvtvss(seqidno.:12)，其中，下划线部分为单链抗体序列。实施例3融合蛋白的体外活性检测应用等离子表面共振技术(spr)对glp-1融合蛋白与其相应的受体蛋白的结合进行鉴定，应用biacoret100将glp-1r-fc蛋白和higg通过化学偶联的方法固定在cm5芯片上，将200nm的fnab8，g8，fnab12和g12分别高速流过芯片表面，检测其结合信号。应用biacore对glp-1融合蛋白与hfcrn的结合进行鉴定，将hfcrn偶联在cm5芯片上，将200nm的fnab8，g8，fnab12和g12分别高速流过芯片表面，检测其结合信号。本实施例的实验结果证明，g8和g12能特异性的与glp-1r结合。且g8和g12均能与fcrn蛋白结合，并保持了结合的ph依赖性。图3显示了g12与glp-1r-fc蛋白的结合。glp-1r-fc或higg偶联到cm5芯片上，将200nm的g8、fnab8、g12、fnab12高速流过芯片表面检测他们与glp-1r-fc和higgfc的结合。图4显示了g12与hfcrn蛋白的结合。hfcrn&β2m固定于cm5芯片，将200nm的g12、fnab12高速流过芯片表面来检测它们与hfcrn在ph6.0和ph7.4的结合。实施例4融合蛋白的细胞活性检测应用cre-luc/glp-1rhek293细胞系对glp-1融合蛋白的细胞生物学活性进行鉴定，简而言之，按5×104/孔将cre-luc/glp-1rhek293细胞接种到96孔细胞培养板中过夜培养，第二天将系列稀释的g8或g12溶液加入细胞培养板中，培养 5小时后，用pbs洗涤细胞两次，然后用细胞裂解夜裂解细胞，用promega的luciferase检测试剂盒检测萤光素酶的活性；glp-1与细胞表面表达的glp-1r结合，将激发camp的生成，从而诱导luciferase的表达，其活性与glp-1和其受体的结合强度成比例，通过测定luciferase的活性，从而可以测定glp-1与glp-1r的结合活力。实验结果表明，g8和g12与glp-1r的结合活性呈剂量相关性，其ec50与文献报导的glp-1多肽的活性基本相当，证实了该融合蛋白保留了glp-1的生物学活性并与之有相当的药效。图5显示了g12对hek293/cre-luc/glp-1r细胞的效果。实施例5体内活性实验c57bl/6雄鼠，7周龄，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，饲以标准小鼠饲料或高脂饲料(hfd，45％kcal来自于脂类，江苏美迪森生物医药有限公司)18天，选取肥胖小鼠(与标准饲料组相比，体重增加超过20％，血糖增加30％以上)随机分成3组，每组3只，每只皮下注射g8,g12或埃塞那肽0.1mg,用血糖仪测定各个时间点的小鼠血糖变化。实验结果表明，g8和g12有显著的降低血糖的效果并且药效持续时间显著长于埃塞那肽(exenatide)。图6显示了体内的对食物诱导糖尿病(diet-induceddiabetis)小鼠模型的降血糖疗效。实施例6体内半衰期测定选择两只健康母猴(购自广西长春生物技术有限，平均6.5-7岁，体重3.3公斤)，尾静脉给药，注射生物素标记的fnab8抗体，1mg/kg体重，在0,0.5,6,24,48,96,240,408,576,744,1008小时各采集2ml血浆样品，应用预包被有亲和素的酶标板，夹心法检测fnab8的血药浓度，用winnonlin软件分析，得出药物动力学研究结果如表2所示，其在体内的平均滞留时间为240小时左右(半衰期分别为204和98小时)而几乎所有单链抗体在体内的半衰期均只有数分钟到数小时，fnab8的半衰期是一般单链抗体的数十到数百倍。表2.猕猴体内fnab8的pk数据idβphaset1/2(h)aucinf(ug*h/ml)cl_f(ml/h/kg)mrt(h)cyno-120420840.48273cyno-29822000.45204bphaset1/2(h):药物清除半衰期；aucinf(ug*h/ml)：峰下面积；cl_f(ml/h/kg)：清除速率；mrt(h)：平均滞留时间综合上述研究结果，本研究发明的两株新型单链抗体序列，具备与hfcrn结合的特异性、高亲和力和ph依赖性，与功能性蛋白融合表达能在保持自身结合性状的同时，维持融合蛋白的生物学功能，而且体内研究表明，单链抗体有较长的半衰期，因此，这两株新型抗体具备用于开发延长半衰期的生物药品的巨大潜力。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。参考文献：[1]m.raghavan,v.r.bonagura,s.l.morrison,p.j.bjorkman,analysisofthephdependenceoftheneonatalfcreceptor/immunoglobulinginteractionusingantibodyandreceptorvariants.,biochemistry.34(1995)14649–14657.doi:10.1021/bi00045a005.[2]r.l.shields,a.k.namenuk,k.hong,y.g.meng,j.rae,j.briggs,etal.,highresolutionmappingofthebindingsiteonhumanigg1forfcγri,fcγrii,fcγriii,andfcrnanddesignofigg1variantswithimprovedbindingtothefcγr,j.biol.chem.276(2001)6591–6604.doi:10.1074/jbc.m009483200.[3]g.j.christianson,v.z.sun,s.akilesh,e.pesavento,g.proetzel,d.c.roopenian,monoclonalantibodiesdirectedagainsthumanfcrnandtheirapplications,mabs.4(2012)208–216.doi:10.4161/mabs.4.2.19397.当前第1页12