本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及RBP4基因的SNP位点的应用及其检测引物与试剂盒。
背景技术：
：自20世纪80年代以来，我国的猪肉消费占整个肉类消费的比例高达80％；最近几年，我国的猪肉总产量占全球猪肉总产量的一半。我国既是全球最大的猪肉生产国，又是全球最大的猪肉消费国。猪对于我国的重要性是不言而喻的，母猪更是猪场的命根子。猪场经营的好坏，是由平均每头母猪年提供仔猪头数和年贡献商品猪头数决定的。繁殖力是评估养猪业生产效益的重要指标，对猪产仔数性状的选育和改良是猪育种工作的主要目标之一。患卵泡囊肿的母猪通常表现为持久不发情，或者发情周期紊乱，导致母猪不孕。每年猪场淘汰的成年母猪中，患卵泡囊肿的母猪的比例10％～20％，给养猪业带来了巨大的经济损失。因此，如果能直接从母猪的基因水平判断母猪患卵巢囊肿疾病风险的高低，在最初筛选后备母猪阶段就淘汰患卵巢囊肿风险较高的青年母猪，将会减少人力物力财力的损失，增加养猪业的经济效益，有利于养猪业的发展。为了筛选引起母猪卵泡囊肿致病分子，利用蛋白组学，检测了囊肿卵泡液与正常卵泡液中的差异蛋白，绘制了卵泡液蛋白组学图谱，筛选出了两个与卵泡囊肿相关的蛋白(RBP-4和AP-1)。视黄醇结合蛋白4(retinol-bindingprotein4，RBP4)，之前被称作RBP，被认为是一种血液中视黄醇的特殊的载体。RBP4也是脂肪因子之一，已有研究表明它与胰岛素抵抗的病理生理学有关。RBP4似乎在慢性炎症疾病中与心肌代谢的标志有关，包括肥胖、二型糖尿病、代谢综合征、心血管疾病等。最近的研究显示通过RBP4诱导胰岛素抵抗和心血管疾病导致产生炎症，提示RBP4可能是一种炎症标志因子。目前，关于母猪卵泡囊肿的分子生物学检测尚存在空白，研究母猪卵泡囊肿易感基因，并对相关易感位点进行检测对于提高母猪生育水平具有重要的意义，降低卵泡囊肿的发生率。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供RBP4基因的SNP位点的应用及其检测引物与试剂盒；本发明提供的引物与试剂盒适用于母猪卵泡囊肿的分子检测，准确性良好。本发明提供了RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点在制备评估母猪卵泡囊肿发生风险的产品中的应用。本发明提供的RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点对评估大白猪的母猪卵泡囊肿发生风险具有更好的特异性。本发明研究表明，RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点基因型为CC或GC的母猪，较基因型为GG的母猪发生卵泡囊肿的风险高。RBP4基因(Retinolbindingprotein4，RBP4)，视黄醇结合蛋白基因，genbank登录号为NC_010456.4，基因全长为6729bp。本发明研究发现，母猪的卵泡囊肿发生与RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点密切相关。本发明以179头大白猪(又名大约克夏猪)为研究对象，通过齐一性χ2检验，RBP4基因+249-63G>C处位点G>C的突变，导致正常卵泡母猪与囊肿卵泡母猪在该位点的基因型的总体样本构成比存在显著性的差异(P＝0.018<0.05)。利用齐一性χ2检验进一步分析得知，正常卵泡组和囊肿卵泡组的GG和GC基因型构成差异不显著(P＝1.000>0.05)；合并GG、GC基因型为GG+GC，与CC基因型比较，发现正常卵泡母猪与囊肿卵泡母猪在该位点的基因型的总体样本构成比的不同是由CC基因型引起的，囊肿卵泡组的CC基因型比例(31.6％)极显著的高于正常卵泡组的(14％)(P＝0.008<0.01)。等位基因G和C，通过齐一性χ2检验，结果显示：正常卵泡组和囊肿卵泡组的等位基因G和C比例存在显著性差异(P＝0.020<0.05)，囊肿卵泡组的等位基因C的比例(51.9％)显著性的高于正常卵泡组的(39％)。本发明还提供了评估母猪卵泡囊肿发生风险的方法，根据RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的基因型评估母猪卵泡囊肿发生风险；RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点基因型为CC或GC的母猪，较基因型为GG的母猪发生卵泡囊肿的风险高。本发明中，对RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的基因型检测的方法可采用现有技术中的多种SNP检测技术，包括但不限于微阵列芯片法、Taqman法、质谱法、测序法、微测序、高分辨率溶解曲线法或联合应用以上方法。本发明中，采用PCR-RFLP法检测RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的基因型。具体的，RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的基因型的检测方法包括：步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；步骤2：所述扩增产物经限制性内切酶MspI酶切后，根据电泳结果判断RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型；电泳结果显示3条条带，大小依次为190bp、154bp和136bp，则RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型为GG；电泳结果显示3条条带，大小依次为190bp、136bp和125bp，则RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型为CC；电泳结果显示4条条带，大小依次为190bp、154bp、136bp和125bp，则RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型为GC。作为优选，PCR的反应程序为：作为优选，PCR的反应体系为20μL，其中：10×Mix10μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O8μL。作为优选，电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。优选的，非变性聚丙烯酰胺凝胶的质量分数为4％。作为优选，限制性内切酶MspI酶切的体系为：作为优选，酶切的温度为37℃，酶切时间为2h。也可以采用测序法对RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的基因型进行检测。具体为：步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；步骤2：所述扩增产物经测序判断RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型。本发明还提供了扩增RBP4基因+249-63G>C处SNP位点的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。本发明还提供了评估母猪卵泡囊肿发生风险的试剂盒，其中包括核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示的引物对。本发明提供的试剂盒中还包括限制性内切酶MspI。其中还可以包括MspI酶反应buffer。本发明提供的试剂盒中还包括对照品、Taq酶、PCRbuffer和无酶水。所述对照品包括CG型、GG型、CC型基因片段。其中还可以包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂。所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂包括：质量分数为30％的丙烯酰胺、5×TBE、质量分数为10％的过硫酸铵和TEMED。本发明提供的试剂盒能准确的检测出待测样本SNP的基因型。通过基因型可以初步判断母猪患卵泡囊肿的风险的高低，对于临床诊断和治疗、品种繁育以及后备母猪筛选等具有指导意义，并具有良好特异性和可重复性。其操作简便、快速。综上，本发明通过分析，发现了母猪的卵泡囊肿发生与RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点密切相关。正常卵泡母猪与囊肿卵泡母猪在该位点的基因型的总体样本构成比的不同是由CC基因型引起的，囊肿卵泡组的CC基因型比例(31.6％)极显著的高于正常卵泡组的(14％)(P＝0.008<0.01)。囊肿卵泡组的等位基因C的比例(51.9％)显著性的高于正常卵泡组的(39％)。附图说明图1示PCR扩增结果；图2示酶切结果；图3示测序结果，其中，图3-a示GG型测序结果；图3-b示GC型测序结果；图3-c示CC型测序结果；图4示三种基因型的正常组和囊肿组的比例。具体实施方式本发明提供了RBP4基因的SNP位点的应用及其检测引物与试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1随机选取大白猪母猪179头，现有技术诊断，其中患有卵泡囊肿者79头，健康母猪100头。分别抽取血液后，用天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒从母猪血液中提取基因组DNA。对上述样本进行RBP4基因+249-63G>C处的SNP位点的基因型的检测。正向引物为SEQIDNO:1：5’—GAGCAAGATGGAATGGGTT—3’反向引物为SEQIDNO:2：5’—CTCGGTGTCTGTAAAGGTG—3’PCR的反应体系为20μL，其中：10×Mix10μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O8μL。PCR的反应程序为：部分样品的扩增产物经电泳检测结果如图1。取上述PCR产物10μL，加入无菌双蒸水7μL，10×bufferwithBSA2μL，MspI限制性内切酶(10U/μL)1μL,振荡混匀后简短离心，37°水浴中酶切2h。酶切产物经4％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。部分样品的酶切产物经电泳检测结果如图2。其中GG为190bp、154bp和136bp三条带，CC为190bp、136bp和125bp三条带,GC为190bp、154bp、136bp和125bp四条带。根据酶切结果，分别对GG、GC和CC三种带型所对应的样品的RBP4基因PCR产物测序。测序结果(如图3-a～图3-c)显示，同一位点(图中箭头所示)GG和CC为纯合子，GC为杂合子(G-C套峰)，说明该位点在群体中发生突变，具有多态性。对检测结果进行统计学分析：大白猪RBP4基因SNP位点的基因频率和基因型频率分布情况以及相关性分析。经χ2检验，大白猪RBP4基因的+249-63G>C处的SNP位点，在囊肿卵泡(P＝0.09>0.05)和正常卵泡(P＝0.611>0.05)样本中基因型的分布符合哈代-温伯格平衡定律，即该研究群体处于哈代-温伯格平衡状态。表1：大白猪RBP4基因基因型频率和基因频率在囊肿卵泡和正常卵泡中的分布(％)基因型样本总数(n＝179)囊肿(n＝79)正常(n＝100)PGG58(32.4)22(27.8)36(36)GC82(45.8)32(40.5)50(50)CC39(21.8)25(31.6)14(14)0.008*G198(55.3)76(48.1)122(61)C160(44.7)82(51.9)78(39)0.020注：P值为Pearson’schi-squaretest的双尾概率值；括号中为各自所占比例；*：表示CC基因型与(GG+GC)基因型之间的比较结果。三种基因型的正常组和囊肿组的比例如图4。表2：CC基因型与GG+GC比较基因型囊肿(n＝79)正常(n＝100)PGG+GC54(68.4)86(86)CC25(31.6)14(14)0.008注：P值为Pearson’schi-squaretest的双尾概率值；括号中为各自所占比例；通过齐一性χ2检验，RBP4基因+249-63G>C处位点G>C的突变，导致正常卵泡母猪与囊肿卵泡母猪在该位点的基因型的总体样本构成比存在显著性的差异(P＝0.018<0.05)(如图4)。利用齐一性χ2检验进一步分析得知，正常卵泡组和囊肿卵泡组的GG和GC基因型构成差异不显著(P＝1.000>0.05)；合并GG、GC基因型为GG+GC，与CC基因型比较，发现正常卵泡母猪与囊肿卵泡母猪在该位点的基因型的总体样本构成比的不同是由CC基因型引起的，囊肿卵泡组的CC基因型比例(31.6％)极显著的高于正常卵泡组的(14％)(P＝0.008<0.01)(见表2)。等位基因G和C，通过齐一性χ2检验，结果显示：正常卵泡组和囊肿卵泡组的等位基因G和C比例存在显著性差异(P＝0.020<0.05)，囊肿卵泡组的等位基因C的比例(51.9％)显著性的高于正常卵泡组的(39％)(P＝0.02<0.05)。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3