本发明涉及发酵法生产有机酸的技术领域，尤其是一种L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法。
背景技术：
L-精氨酸-α-酮戊二酸盐(L-arginine-α-ketoglutarate，AAKG)，简称精酮合剂，是由L-L-精氨酸(L-Arg)与α-酮戊二酸(α-KG)络合形成的氨基酸盐，可以从溶液中以盐的形式结晶析出。在不同的结晶条件下，AAKG可以形成单精氨酸酮戊二酸盐(MAAKG)和双精氨酸酮戊二酸盐(DAAKG)两种形式，目前研究和应用较多的主要是MAAKG，其晶型为无色棱柱状，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能够完全解离为L-精氨酸和α-酮戊二酸。本文研究的AAKG均指MAAKG，其结构式如下：
AAKG不仅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，而且可以作为功能性营养强化剂和护肝药物应用于临床。α-酮戊二酸能直接快速推动人体内柠檬酸循环(TCA循环)，产生更大量的细胞能量(ATP)来供给受损的肝细胞使肝细胞保持正常功能，从而使肝脏能得以正常健康的运转；同时L-精氨酸直接快速加入Urea cycle(尿素循环)，使血液中的氨毒由转氨及去氨双重作用来去除肝脏疾病所引起的高血氨症，使肝脏恢复正常功能及健康。另外，AAKG还可用于增强体格、促进肌肉的快速增长和创伤恢复，促进肝细胞对营养和能量的代谢，增强力量和精力，其生理机制在于AAKG能够在短期内提高体内NO的水平，增强蛋白质同化作用。目前，AAKG作为功能食品在国际市场上销量日益增加，并与鸟苷酸酮戊二酸盐(OKG)一起，在医学、营养、运动领域备受重视。
目前AAKG的制备工艺主要有三种方式：直接混合法、冻干法和结晶法。
直接混合法是将等摩尔的L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末进行简单的混合而成，其制备方法简单，成本较低，是商品化生产最为通用的方法。但该法生产的AAKG不是结晶型产品，二者之间没有盐键结合，产品质量受到原料的品质、混合的均匀度影响。
冻干法是将L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末进行等摩尔混合并溶解，再将溶液冷冻干燥成为冻干粉，该工艺能够得到相对稳定的结晶型AAKG，但存在晶型不可控、冻干过程能耗大等问题，一般仅适合AAKG注射剂生产。
结晶法是将L-精氨酸、α-酮戊二酸按等摩尔比例混溶后，通过溶液浓缩或者加入有机溶剂、降低温度等方法，使AAKG以晶体形式析出，其产品纯度高，质量可控。相比而言，混合法和冻干法，在制备过程中不能够去除原料带入的杂质，对原料品质有着较高的要求，而结晶工艺是一个能有效去除杂质的精制过程，因而能够使用纯度相对较低的原料，甚至是低浓度的发酵液。
中国专利CN 102531968A中涉及到提取精酮合剂工艺中的α-酮戊二酸来源是通过2,2-二氯戊二酸二甲酯反应获得，其合成路线较长，使用了大量的有机溶剂，对人体的毒害较大，不适宜用作食品和药用产品原料；中国专利CN 102020593A中涉及到提取工艺中的α-酮戊二酸是通过微生物发酵获得的，其发酵液副产物成分复杂(尤其是代谢过程中的有机酸的积累)，对后期提取造成一定的干扰。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种L-精氨酸-Α-酮戊二酸(精酮合剂)的制备方法，步骤如下：
(1)制备α-酮戊二酸溶液：采用大肠杆菌BL21(DE3)(Escherichia coli)表达谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物，通过酶转化法得到α-酮戊二酸酶转化液，酶转化液通过微滤、超滤、离子交换除杂后获得α-酮戊二酸溶液；
(2)制备L-精氨酸溶液：利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)发酵L-精氨酸，获得L-精氨酸发酵液，通过微滤、超滤、离子交换、脱氨后获得L-精氨酸溶液；
(3)混合结晶：将α-酮戊二酸溶液与L-精氨酸溶液按照等摩尔比进行混合，调至pH为4.0±0.5，脱色后进行减压浓缩、喷雾干燥，即得。
上述精氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌为常用生产菌株、大肠杆菌BL21(DE3)是市场通用菌种。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，具体步骤如下：
(1)将α-酮戊二酸酶转化液和精氨酸发酵液经活菌灭活，用稀盐酸调节pH为4.0-4.5，进入微滤膜分离系统进行微滤，分别得到去除菌体的α-酮戊二酸微滤液和精氨酸微滤液；操作温度为10-50℃，进膜压力与出膜压力差为0.05-0.1Mpa，过滤过程分多次加入纯化水顶洗，直至溶液中α-酮戊二酸和精氨酸的含量低于2.0g/L后停机，获得α-酮戊二酸微滤液和精氨酸微滤液；
(2)将步骤(1)所得澄清的α-酮戊二酸微滤液和精氨酸微滤液分别泵入超滤膜过滤器，过滤除蛋白，其操作条件为pH 2-12、温度10-50℃，操作压力差(进膜压力与出膜压力差)为0.05-0.1MPa，得到α-酮戊二酸超滤液和精氨酸超滤液；
(3)将步骤(2)所得α-酮戊二酸超滤液上732阳离子交换树脂(吸附钠离子、谷氨酸阳离子等杂质)，收集pH小于2.0的α-酮戊二酸流出液；精氨酸过滤液上732阳离子交换树脂吸附，待吸附饱和后用去离子水反洗，之后采用3-8％的氨水洗脱，收集pH为9-11的精氨酸高流分洗脱液，洗脱液经过脱氨后获得L-精氨酸溶液；
(4)将步骤(3)所得α-酮戊二酸流出液和L-精氨酸溶液按照摩尔比1：1的比例进行混合，调至pH为4.0±0.5，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合液；
(5)向步骤(4)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合液中加入1.5-2.0％的活性炭脱色，温度60℃，搅拌脱色25min，过滤得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脱色液；
(6)将步骤(5)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合脱色液进行减压浓缩至原体积液的12-18％，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合浓缩液；
(7)将步骤(6)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合浓缩液进行喷雾干燥，即得目标产物(是一种L-精氨酸-α-酮戊二酸合剂粉末)。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，所述微滤膜分离系统采用中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.1um。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，所述微滤膜分离系统为中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.1um。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000。
优选的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，所述精氨酸-α-酮戊二酸混合液经活性炭脱色后溶液透光率大于90％。
本发明结构有如下有益效果：
上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，具有如下技术效果：
(1)采用通过酶转化L-谷氨酸得到α-酮戊二酸酶转化液，同时采用L-精氨酸生产菌发酵得到L-精氨酸发酵液，通过对酶转化液和发酵液进行微滤、超滤、离子交换、脱氨脱色等处理，将二者等摩尔比例混合后进行脱色、减压浓缩、喷雾干燥等单元操作；并采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白，去除菌体蛋白效果较好，过滤液澄清透明；
(2)采用阳离子交换工艺，高效去除难分离的谷氨酸等杂质，得到的L-精氨酸-α-酮戊二酸经高效液相色谱检测分析其纯度达98.0％以上。
附图说明
图1是本发明所述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的(精酮合剂)提取工艺流程图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，现配合附图进行详细阐述：
实施例1
一种L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，具体步骤如下：
a、分别取α-酮戊二酸酶转化液和L-精氨酸发酵液32.0L和18.1L(α-酮戊二酸和L-精氨酸含量分别为31.2g/L和65.8g/L)于80℃加热10min以上，用盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统进行微滤，分别得到去除菌体的α-酮戊二酸微滤液和L-精氨酸微滤液；所述微滤膜分离系统采用中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.1um，操作温度为30℃，进膜压力与出膜压力差为0.05Mpa，过滤过程分多次加入纯化水顶洗，直至溶液中α-酮戊二酸和L-精氨酸的含量低于2.0g/L后停机，获得α-酮戊二酸微滤液和L-精氨酸微滤液。
b、将经a步得到澄清的α-酮戊二酸微滤液和L-精氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，分别得到α-酮戊二酸超滤液和L-精氨酸超滤液；所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000，其操作条件为pH 4.0，操作温度30℃，进膜压力与出膜压力差为0.08MPa。
c、将b步获得的α-酮戊二酸超滤液上732阳离子交换树脂吸附钠离子、谷氨酸阳离子等杂质，收集pH小于2.0的α-酮戊二酸流出液；精氨酸过滤液上732阳离子交换树脂吸附，待吸附饱和后用去离子水反洗，之后采用6％的氨水洗脱(可以为3-8％的任意浓度的氨水进行洗脱)，收集pH为9-11的精氨酸高流分洗脱液，洗脱液经过脱氨后获得L-精氨酸溶液。
d、将c步获得的α-酮戊二酸流出液和精氨酸溶液分别按照摩尔比1：1的比例混合，pH为4.0，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合液；
e、将d步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合液加入1.8％的活性炭脱色，温度60℃，搅拌脱色25min，过滤得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脱色液，透光率为97.5％(一般情况下，保证过滤得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脱色液的透光率在97.0％以上即可)；
f、将d步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合脱色液进行减压浓缩至原体积液的17％，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合浓缩液；
g、将f步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合浓缩液进行喷雾干燥，得到L-精氨酸-α-酮戊二酸合剂粉末。
h、将g步得到的L-精氨酸-α-酮戊二酸晶体，称重1801.7g，计算收率为82.3％，纯度为98.1％。
综上，本发明所述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制备方法，利用发酵法生产L-精氨酸，酶转化液和发酵液分别含有α-酮戊二酸和L-精氨酸，除此之外还有菌体、水溶性蛋白、色素、谷氨酸钠盐等，根据酶转化液和发酵液的特点，首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除菌体、大部分蛋白和色素，膜过滤液依次通过阳离子交换柱除去杂质，得到α-酮戊二酸和精氨酸高流分溶液，将两者按照等摩尔比例混合后通过活性炭脱色、减压浓缩、喷雾干燥得到纯度98.0％的L-精氨酸-α-酮戊二酸晶体，收率达到82.0％以上。所述制备方法有效解决了现有生产工艺中存在的分离提取工艺复杂，收率低，产品纯度低，大量制备成本高等问题，采用从α-酮戊二酸的酶转化液中加入L-精氨酸发酵液生产L-精氨酸-α-酮戊二酸，具有生产周期短，副产物少，分离提取相对容易等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。