一种单染色体水平的甲基化测序方法与流程

本发明涉及医学遗传学领域，尤其涉及一种单染色体水平的甲基化测序方法。

背景技术：

目前甲基化分析主要是基于全基因组和单细胞水平的分析方法。

1.全基因组甲基化测序。DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA甲基化谱式绘制。然而，由于全基因组甲基化的检测手段分析的是细胞群的总体平均反应，因而这种细胞群的平均结果会淹没掉个体细胞的反应，例如，癌症组织某个基因启动子区域甲基化率高于稍高于癌旁组织，全基因组甲基化的检测手段无法判断这种甲基化率微弱的升高是由于整个癌组织中各种细胞甲基化水平都有一个微弱的升高，还是由于某一种细胞的甲基化水平急剧升高而造成的；其同样也会模糊我们对大脑、血液系统、免疫系统及其组成这些系统的细胞之间异质性的认识。

2.单细胞DNA甲基化检测。不同单细胞的甲基化检测有助于认识细胞之间的差异，而从整个系统中挑选多个不同的单细胞进行研究，则可以重建出整个系统，这种重建过程能够提供更多更有价值的信息。然而，单细胞DNA甲基化检测能提供单细胞的甲基化信息，却无法精确到单染色体的甲基化信息。DNA的甲基化是可以遗传的，例如，精子所携带的表观遗传信息被传递到子代，并调控早期胚胎发育的基因表达。又或者印记基因的甲基化程度不同，这取决于它来自父亲还是母亲。单细胞DNA甲基化检测可能无法确定这种甲基化的信息是遗传于父本还是母本。

总之，以上常用的两种方法无法精准的在单染色体水平上分析甲基化信息。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种单染色体水平的甲基化测序方法，本发明提供的方法具有成本低、试验方法简单、耗时周期短以及设备成熟等优点，可广泛应用于癌症的早期诊断和鉴别诊断的临床研究中，其具备全基因组和单细胞水平甲基化检测方法的优势并可确定甲基化信息的遗传来源，从而可广泛应用于表观遗传的研究。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种单染色体水平的甲基化测序方法，所述方法包括以下步骤：

(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞；

(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体；

(3)将单倍体进行稀释，用Bisulfite处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分，利用高通量测序技术进行甲基化测序。

本发明主要是提供了一种使用显微注射技术分离单染色体的方法，利用该方法实现在染色体水平上分析甲基化信息，并确定遗传信息的来源。

本发明提供的方法具有成本低、试验方法简单、耗时周期短以及设备成熟等优点，可广泛应用于癌症的早期诊断和鉴别诊断的临床研究中并可确定甲基化信息的遗传来源。

根据本发明，步骤(1)所述培养与收集待测样本中的淋巴细胞，包括以下操作：

a)采集人体的外周静脉血血液样本，无菌条件下向细胞培养液中滴加30-35滴血液样本；

b)混匀后于37℃，5％CO₂条件下，培养69h；

c)无菌条件下加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL，继续培养3-5h；

d)收集处于有丝分裂中期的淋巴细胞，并将其分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。

本发明中，所采集的人体的外周静脉血血液样本可低至1-2mL，因此，该检测方法具有样本用量少的特点。

本发明中，优选采用规格为2mL的注射器向细胞培养液中滴加血液样本，例如采用规格为2mL的注射器将30-35滴血液样本滴加到含有细胞培养基的细胞培养瓶中；对于细胞培养瓶的个数，例如可以是2瓶、3瓶等，在此不做特殊限定。

根据本发明，步骤(1)所述细胞培养液采用市售淋巴细胞培养液，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，在此不做特殊限定。

示例性地，本发明所述单染色体水平的甲基化测序方法中，步骤(1)具体采用如下操作：

采集人体的外周静脉血血液样本2mL，提供两个含有细胞培养液的细胞培养瓶，无菌条件下使用2mL注射器分别向细胞培养液中加30滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO₂孵育69h，加入秋水仙碱后使其最终浓度为0.2μg/mL，继续培养3h；将两瓶培养液合并后收集淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。

根据本发明，步骤(2)所述显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体，包括以下操作：

a)配制如下组分的细胞裂解液：

b)显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在步骤a)的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到含有纯水的离心管中；

c)将混匀的含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个含有纯水的离心管中。

优选地，步骤b)和步骤c)所述离心管中均存有9μL纯水。

示例性地，本发明所述单染色体水平的甲基化测序方法中，步骤(2)具体采用如下操作：

显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在提前准备好的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，每管存有9μL含染色体的纯水。

示例性地，本发明所述单染色体水平的甲基化测序方法，包括以下步骤：

(1)采集人体的外周静脉血血液样本2mL，提供两个含有细胞培养液的细胞培养瓶，无菌条件下使用2mL注射器分别向细胞培养液中加30滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO₂孵育69h，加入秋水仙碱后使其最终浓度为0.2μg/mL，继续培养3h；将两瓶培养液合并后收集淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用；

(2)配制如下组分的细胞裂解液：

显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在提前准备好的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，每管存有9μL含染色体的纯水；

(3)将单倍体进行稀释，用Bisulfite处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分，利用高通量测序技术进行甲基化测序；

所述方法不以治疗和诊断为目的。

本发明中，步骤(3)所述Bisulfite处理是采用本领域公知的方法进行，在此不做特殊限定。

本发明中，步骤(3)所述高通量测序技术是本领域技术人员根据实际需要采用的公知技术，在此不做特殊限定。

本发明中，所述待测样本的细胞为淋巴细胞。

与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明通过在单染色体水平下进行甲基化测序，相比采用全基因组测序，可以使结果更加准确和可靠，而且所用血液样本可低至1-2mL，具有样本用量少的特点；

(2)本发明提供的方法具有成本低、试验方法简单、耗时周期短以及设备成熟等优点，可广泛应用于癌症的早期诊断和鉴别诊断的临床研究中，其具备全基因组和单细胞水平甲基化检测方法的优势并可确定甲基化信息的遗传来源，从而可广泛应用于表观遗传的研究。

附图说明

图1是显微注射分离一个中期淋巴细胞的操作示意图；

图2是单染色体逐级稀释到8份的示意图；

图3是构建单染色体甲基化测序文库的流程图；

图4是甲基化测序数据生物信息学分析图。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1淋巴细胞的培养与收集

采集人体的外周静脉血血液样本2mL，无菌条件下使用2mL注射器分别向两瓶淋巴细胞培养液中加35滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO₂孵育69h，加入秋水仙碱后并使其最终浓度为0.2μg/mL，继续培养3h。合并两瓶培养液，收集淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。

细胞悬浮液配制组分如下：

实施例2单细胞挑取及单染色体分离

配制如下组分的细胞裂解液：

吸取实施例1中的10μL淋巴细胞悬浮液置于培养皿中，显微镜下观察，使用显微注射系统吸取一个中期细胞，其具体操作如图1所示；放在提前准备好的轻缓细胞膜裂解液中，显微镜下观察到细胞裂解，染色体分散后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，使每管存有9μL含染色体的纯水，图2示出了单染色体逐级稀释到8份的过程。

实施例3染色体扩增及文库构建

存有9μL含染色体的纯水的8个离心管，采用WGA4和WGA3的全基因组扩增方法对染色体进行扩增。扩增后的染色体经Bisulfite处理，末端加引物以及标记，经PCR扩增后构建测序文库，其构建测序文库的过程如图3所示。

实施例4高通量测序和生物信息学分析

构建的单染色体文库经高通量测序得到原始数据，生物信息学分析每个离心管内含有的染色体数目及编号，甲基化测序数据生物信息学分析过程如图4所示，其具体过程为：对原始数据进行预处理，通过基因组比对，对获得的BAM/SAM文件进行甲基化分析，分别获得测序深度与甲基化程度、CpG/CHG/CHH位点甲基化差异以及基因组区域甲基化差异，获得CpG岛报告，从而获得基因的单染色体水平的甲基化信息。本发明采用一种可视化的环形图来显示染色体在8个离心管的分布情况。

通过实施例1-4，本发明实现了在单染色体水平下进行甲基化测序，其具有结果准确可靠、所用血液样本低的特点，可可广泛应用于癌症的早期诊断和鉴别诊断的临床研究中，其具备全基因组和单细胞水平甲基化检测方法的优势并可确定甲基化信息的遗传来源，从而可广泛应用于表观遗传的研究。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。