本发明属于生物制剂技术领域，涉及一种γ-聚谷氨酸的生产方法，主要是一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ- 聚谷氨酸是一种由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过 α- 氨基和 γ- 羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。
γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的 吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均具有很高的商业价值和社会价值。
目前针对聚谷氨酸主要包括对其性质的研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好的材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了聚谷氨酸产业化研究和探索的进程。
在研究中发现，不同构型组成的 γ- 聚谷氨酸有不同的应用，例如，含有较高含量 L- 谷氨酸的 γ- 聚谷氨酸因其对皮肤的兼容性在化妆品行业应用广泛，在一些其他的领域，含有较高 D-谷氨酸的γ-聚谷氨酸因其降解较慢而被广泛应用。而且目前市场上对于无污染，环保的高分子材料需求越来越高，应用范围也越来越广。所以，在目前的阶段下，提高聚谷氨酸的产量以及控制构型变得越来越重要。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法，该方法通过将一定浓度的亮氨酸添加到发酵液中，使发酵代谢过程中前体增加，从而使得γ-聚谷氨酸的产量得到提高，并通过添加量和添加时间控制γ- 聚谷氨酸的构型。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
1）CGMCC3336 菌种的活化：在富含营养的固体培养基斜面上于 37℃培养 16 小时，制备得到成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含 ：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10g/ L，琼脂 20g/L， pH7.2 ；
2）种子液的制备 ：
将一环上述种子转入装有液体种子培养基的三角瓶中，37℃，220rpm 培养16小时至对数生长期 ；其中，种 子 液 培 养 基 组 成（g/L）：葡萄糖 30 ；酵母膏 7 ；胰蛋白胨 10 ； 磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.5，pH7.2；500ml 的三角瓶中分装 50ml 培养基 ；
3)发酵罐发酵：
发酵罐培养基成分为（g/L）：葡萄糖 80，谷氨酸钠 80，硝酸铵 18，氯化钠10， 硫酸镁0.5， 氯化钙1.0， 硫酸亚铁0.01，精氨酸 0.44，组氨酸 0.26，苏氨酸 0.5， 蛋氨酸 0.4，谷氨酰胺 0.5，吡哆醇 0.001， pH7.2 ；
发酵条件：5L 发酵罐装液量为 3L，种子液的接种量为10%，发酵温度 37℃，发酵中添加亮氨酸，通风量 1.0vvm，转速 400rpm，初始 pH 为7.2 。
另外，根据本发明上述实施例的适用于儿童的新型用药剂型，还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，步骤（3）中发酵中添加亮氨酸浓度为0.2~1.0g/L。
在本发明的一些实施例中，步骤（3）中发酵中，添加亮氨酸时间为发酵20~48小时。
本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）生产γ-聚谷氨酸。菌种来源：发明所用菌种见天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为惰性载体固态发酵法生产γ-聚谷氨酸的方法专利，申请号 ：200910228297。该菌种为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号 CGMCC3336。
本发明采用高效液相色谱仪测定D-谷氨酸浓度与 L-谷氨酸浓度，其高效液相色谱仪的工作条件：
仪器：Agilent1200 高效液相色谱仪，配紫外可见检测器和工作站；
色谱柱：大赛璐 CR(+)/(CR-) 手性柱；
流动相：pH2.0 高氯酸水溶液；
流速：0.4mL/min；
柱温：25℃ ；
检测波长：UV200nm
样品制备：发酵液经二次醇沉复溶后，与等体积 6mol/L 盐酸在 110℃进行水解，水解前样品用流动相稀释适当倍数，水解后样品用流动相稀释适当倍数，经 0.22μm 滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
本发明具有的优点和积极效果是：
本发明生产γ-聚谷氨酸，其γ-聚谷氨酸的产量得到显著提高，该方法可以同时控制γ-聚谷氨酸中L/D谷氨酸的比例，因此可以得到不同用途的γ- 聚谷氨酸。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法。下面对本发明实施例的一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法进行详细描述。
实施例：
本发明提出了一种发酵过程中添加亮氨酸生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
1）CGMCC3336 菌种的活化：在富含营养的固体培养基斜面上于 37℃培养 16 小时，制备得到成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含 ：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/ L，琼脂 20g/L， pH7.2 ；
2）种子液的制备 ：
将一环上述种子转入装有液体种子培养基的三角瓶中，37℃，220rpm 培养16小时至对数生长期 ；其中，种 子 液 培 养 基 组 成（g/L）：葡萄糖 30 ；酵母膏 7 ；胰蛋白胨 10 ； 磷酸氢二钾0.5 ； 硫酸镁0.5， pH7.2 ； 500ml 的三角瓶中分装 50ml 培养基 ；
3) 发酵罐发酵 ：
发酵罐培养基成分为（g/L）：葡萄糖 80，谷氨酸钠 80，硝酸铵 18，氯化钠10， 硫酸镁0.5， 氯化钙1.0， 硫酸亚铁0.01，精氨酸 0.44，组氨酸 0.26，苏氨酸 0.5， 蛋氨酸 0.4，谷氨酰胺 0.5，吡哆醇 0.001， pH7.2 ；
发酵条件：5L 发酵罐装液量为 3L，种子液的接种量为10%，发酵温度 37℃，发酵中添加亮氨酸，通风量 1.0vvm，转速 400rpm，初始 pH 为7.2 。
本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）生产γ-聚谷氨酸。菌种来源：发明所用菌种见天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为惰性载体固态发酵法生产γ-聚谷氨酸的方法专利，申请号 ：200910228297。该菌种为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号 CGMCC3336。
本发明采用高效液相色谱仪测定D-谷氨酸浓度与 L-谷氨酸浓度，其高效液相色谱仪的工作条件：
仪器：Agilent1200 高效液相色谱仪，配紫外可见检测器和工作站；
色谱柱：大赛璐 CR(+)/(CR-) 手性柱；
流动相：pH2.0 高氯酸水溶液；
流速：0.4mL/min；
柱温：25℃ ；
检测波长：UV200nm
样品制备：发酵液经二次醇沉复溶后，与等体积 6mol/L 盐酸在 110℃进行水解，水解前样品用流动相稀释适当倍数，水解后样品用流动相稀释适当倍数，经 0.22μm 滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
对照试验：与实施例不同之处在于，发酵过程中，不添加亮氨酸；发酵结束后经检测 γ-聚谷氨酸的产量为 19g/L，γ- 聚谷氨酸中 L- 谷氨酸与 D- 谷氨酸含量比例为 1 ：1。
实施例 1
发酵 24小时，添加0.5g/L亮氨酸，实验结果：γ- 聚谷氨酸产量由对照组的 19g/L 提高到 22g/L，L/D 构型比例为1.5 ：1。
实施例 2
发酵 24小时，添加1g/L亮氨酸，实验结果：γ- 聚谷氨酸产量由对照组的 19g/L 提高到 25g/L，L/D 构型比例为 1.8 ：1.2。
实施例 3
发酵 48小时，添加0.5g/L亮氨酸，实验结果：发酵小时添加亮氨酸结果 ： γ- 聚谷氨酸产量由对照组的 19g/L 提高到 25g/L，L/D 构型比例为 1 ：1.8。
实施例 4
发酵 48小时，添加1g/L亮氨酸，实验结果：γ- 聚谷氨酸产量由对照组的 19g/L 提高到 28g/L，L/D 构型比例为 1：2。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。