一种嵌合抗原受体分子及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体分子及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。

1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Natural killer-like T cells，NKT)、Th1效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentritic cells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。

免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达，至少有两方面的因素导致体内的T淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与T细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的T淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。

目前以CD19为靶点开发的CAR-T细胞疗法，在一期和二期血液系统肿瘤临床治疗上都取得了明显的效果，但是CAR-T细胞疗法在实体瘤的研究中的进展缓慢，目前还没有显著性的突破。原因之一是淋巴性白血病癌细胞中95％都表达B细胞抗原CD19，而其他实体瘤细胞的特异性抗原表达在40-70％之间；所以在实体瘤的治疗中，单一的单抗CAR-T细胞不可能杀伤表达其他肿瘤特异性抗原的癌细胞。原因之二是免疫杀伤细胞通过血液/淋巴液循环浸润到实体肿瘤的速度和数目。原因之三是肿瘤组织细胞对免疫活性细胞的负调节作用。

在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(Regulatory T cells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmed cell death protein 1/Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物keytruda和opdivo已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。本发明通过改变嵌合抗原受体分子(CAR)胞外段的PD-1分子，选用比PD-1与PDL1的亲和力更高的分子，制备特异性和杀伤性更高的高亲和力嵌合抗原受体分子。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有与肿瘤表面PDL-1分子更高亲和力的嵌合抗原受体分子及其应用。

本发明第一方面提供一种嵌合抗原受体分子，包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括HAC肽段，其序列如SEQ ID NO：1所示。据《Engineering high-affinity PD-1 variants for optimized immunotherapy and immuno-PET imaging》文章报道，PD-1的突变体HAC具有与肿瘤表面PDL-1分子更高亲和力。

应当说明的是，所述跨膜区肽段为蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基，其氨基酸大部分是疏水性氨基酸；其中，所述跨膜区肽段包括但不限于CD8跨膜区肽段或PD-1跨膜区肽段，当跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段时，所述HAC肽段与CD8跨膜区肽段还通过CD8的hinge区肽段相连。CD8跨膜区肽段的序列如SEQ ID NO：2所示，CD8的hinge区肽段的序列如SEQ ID NO：3所示，PD-1跨膜区肽段的序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步的，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB(又称CD137)、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。优选的，所述胞内结构域肽段选自相互连接的4-1BB和CD3ζ胞内结构域肽段，其序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。

进一步的，所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋白失活。信号肽可选自免疫球蛋白轻链的信号肽、或是PD-1蛋白分泌的信号肽，其序列分别如SEQ ID NO：7和8所示。

优选的，本发明的嵌合抗原受体分子，由免疫球蛋白轻链的信号肽、HAC肽段、CD8的hinge区肽段、CD8的跨膜区肽段、4-1BB胞内结构域肽段和CD3ζ胞内结构域肽段依次连接而成，其序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明第二方面提供一种核苷酸，其编码本发明第一方面提供的嵌合抗原受体分子。

进一步的，包含或为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第二方面提供的核苷酸。

进一步的，所述载体为慢病毒载体，其可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

应当说明的是，本发明中所用的慢病毒载体，应当包括但不限于pRRSLIN慢病毒表达载体和pLVX载体，优选为pRRSLIN慢病毒表达载体。

本发明第四方面提供一种重组细胞，其包含本发明第三方面提供的重组载体。所述重组细胞优选为T细胞或NK细胞。该嵌合抗原受体的编码基因能够通过前述载体被转移至T细胞或NK细胞内，用于修饰T细胞或NK细胞，成为CAR-T或CAR-NK细胞；利用该嵌合抗原受体修饰的T细胞或NK细胞，能够通过识别肿瘤细胞表面的组织因子，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤治疗。

在本发明中：

术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

术语“胞外区”是指膜蛋白位于细胞外的区段。

术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。

术语“PD-1”是指人类程序性死亡因子1(programmed cell death protein1)，基因名称PDCD1_HUMAN，对应蛋白序列编号有UniProtKB-Q15116，是T细胞免疫抑制分子，其胞外区结构域类似免疫球蛋白的可变区(V-section)，具有特异性结合其配体PD-L1和PD-L2(Programmed cell death protein 1ligand 1/2)的特性。PD-1通常在活化的T淋巴细胞中表达，在多种恶性肿瘤细胞中也有表达。

术语“PD-L1”、“PD-L2”是指目前发现的人类程序性死亡因子1配基1和配基2(programmed cell death protein 1ligand 1/2)。其胞外区结构域具有类似免疫球蛋白的V和C1区，通过V区与PD-1的V区相结合(4zqk Structure 23 2341-2348，2015)。通常在树突状细胞DC、T调节细胞和Th细胞、巨噬细胞、Mast细胞和骨髓中少量表达，在多种恶性肿瘤细胞中也有表达。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明的嵌合抗原受体分子，具有与肿瘤表面PDL-1分子更高亲和力的HAC分子，将其组装在CAR-T细胞胞外段，用来识别肿瘤细胞，具有更高的亲和力和杀伤活性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是慢病毒表达载体构建示意图；

图2是pRRSLIN-HAC侵染3天的流式结果图；

图3是CAR-HAC对不同种靶细胞的杀伤结果图；

图4是CAR-HAC对不同种靶细胞的体外增殖的检测结果图；

图5是CAR-HAC对不同种靶细胞的细胞因子的检测结果图；

图6是CAR-HAC对MCF7/MCF7-PDL1/HeLa/SMC7721 4种细胞株的检测结果图；

图7是针对不同细胞株CAR-PD-1和CAR-HAC的杀伤效果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 慢病毒表达载体制备

本发明提供一种用于表达嵌合抗原受体分子的慢病毒表达载体的制备方法，包括以下步骤：

S1、根据《Engineering high-affinity PD-1 variants for optimized immunotherapy and immuno-PET imaging》文章报道的PD-1分子突变体HAC序列信息，合成HAC基因片段，从GenBank数据库中搜寻已知的人CD8跨膜区基因序列、人4-1BB胞内区基因序列和CD3ζ胞内区基因序列；

S2、将上述基因序列依次按人HAC基因、CD8膜区基因、人4-1BB胞内区基因和CD3ζ胞内区基因进行连接，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成完整的HAC-CD8-4-1BB-CD3ζ基因序列信息，

S3、将HAC-CD8-4-1BB-CD3ζ的基因序列通过酶切转化连接到pRRSLIN载体中，基因上游为EP-1α启动子。将载体转化到Stbl3大肠杆菌菌株后，转种到含有氨苄青霉素的固体培养基中进行繁殖，筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，通过测序确认载体构建成功，获得pRRSLIN-HAC慢病毒表达载体，慢病毒表达载体构建示意图如图1所示。

实施例2 慢病毒制备

本发明提供实施例1中慢病毒表达载体表达制备慢病毒的方法，包括以下步骤：

S1、转染前24小时，以每皿约8×10⁶将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。

S2、准备溶液A和溶液B

溶液A：6.25mL 2×HEPES buffer缓冲液

溶液B：分别加入以下质粒的混合物：112.5μg pRRLSIN-HAC(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μL 2M钙离子溶液。

S3、充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置2-3分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，在转速500g，温度25℃下离心10min，使用PES膜(0.45μm)过滤；以70％乙醇消毒离心管，并置于紫外灯下消毒30min；将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中，在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8mL上清液加1mL蔗糖)，以PBS平衡离心管，在转速25000rpm、温度4℃下离心2h；小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体；加入100μL PBS，密封离心管，在4℃放置2h，每20min轻轻涡旋一次，500g离心1min(25℃)，收集病毒上清；冰上冷却后，置于-80℃保存。

实施例3 CAR-T细胞制备

本发明提供实施例2中慢病毒侵染细胞制备CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

S1、取0.5mL血进行快速的病原微生物检测，排除HBV、HCV、HDV和HEV、HIV-1/2、梅毒螺旋体及寄生虫等微生物感染；无菌条件下，用肝素瓶采血50mL(肝素抗凝)，立即(4℃，24小时内)送至细胞制备实验室，保证此过程无病原微生物污染。得到患者血液后，在GMP制备室，用酒精棉球擦拭肝素瓶表面进行消毒后放入生物安全柜。

S2、预先打开2个50mL离心管，将血液转入两个50mL离心管中，旋紧；将上述装好血液的两个50mL离心管放入离心机离心，2000rpm离心10min，室温离心后收集上层血浆，留下沉淀层；收集的自体血浆经56℃，30min灭活，4℃放置15min后，900g，离心30min(4℃)，取上清备用。

S3、将上述富集的血细胞用生理盐水稀释至30mL/管，打开2个新的50mL离心管，每个离心管分别加入15mL人淋巴细胞分离液，用移液管把稀释后的血细胞液缓缓加入到盛有人淋巴分离液的离心管中，旋紧。注意血液要加到淋巴分离液的上层，勿打破人淋巴分离液的界面。将加好的血细胞液放入离心机，调至最小的升降速率，常温2000rpm离心20min。收集两管的中层白细胞层于一支15mL无菌离心管中，加入5mL生理盐水，洗两次(2000rpm离心10min)，得外周血单核细胞(PBMC)。

S4、配置完全生长培养基，V-VIVO15添加自体AB(FBS)浓度为5％，白细胞介素-2(IL-2)浓度为40ng/mL，将分离得到的PBMC用培养基稀释成2×10⁶/mL，取50μL流式检测PBMC中T细胞的纯度。

S5、Day 0，配置缓冲液(在PBS缓冲液中添加1％的胎牛血清(FBS))，选用微珠作为细胞培养载体，将微珠振荡30s或手动上下摇匀5min，按照微珠与T细胞的用量比为3：1取CD3/CD28微珠置于1.5mL EP管中，添加1mL缓冲液清洗微珠，之后使用磁铁从EP管向外吸微珠1min，弃洗液，重复两次，再使用培养基将微珠重悬到原体积，将细胞和微珠混合后按2×10⁶PBMC/mL加到合适的培养瓶中。

S6、Day 2将细胞密度调整至3-5×10⁶/mL，按病毒载体与细胞的比例为1:5添加实施例1制备得到的pRRSLIN-HAC慢病毒表达载体，同时添加聚凝胺(polybrene)4μg/mL和40ng/mL IL-2。4h之后，补加新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×10⁶/mL继续培养。将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。

S7、每隔2-3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5-1×10⁶/mL。

S8、Day 10-12，细胞数量达到10⁹级别，在400g下离心5min得到免疫细胞，再用预冷的PBS洗涤两遍。

S9、用血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞类群，CAR-T细胞比例。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。逐步扩大培养过程中，加入总体积所需的白细胞介素-2。

实施例4 CAR-T细胞流式分析

对实施例3制备的CAR-T细胞进行流式分析，其具体步骤如下：

S1、取5×10⁴细胞(包括T细胞、CAR-T细胞)用于染色；

S2、细胞与抗体(抗体可与HAC分子识别结合，偶联FITC荧光分子)共孵育45min，50μl，置于冰上；

S3、PBS洗脱两次；

S4、用120μl FACS试剂重悬细胞；

S5、流式细胞仪器测量FITC荧光信号，如果与对照T细胞对比，CAR细胞FITC荧光信号增强，表面CAR细胞构建成功。

CAR-T细胞流式浸染效果如图2所示，图中，纵坐标为流式SSC-H侧向角散射信号，横坐标为FITC荧光信号，该信号值越强，表明HAC分子在膜上表达的越多，CAR-T细胞转染成功的比例越高。A图和B图为对照组，为不侵染病毒的T细胞；FITC偶联的检测CAR分子的抗体检测不到CAR分子表达；C图和D图，为转染PRRSLIN-HAC慢病毒的T细胞，经流式检测，与A图和B图对比，有细胞成功转染；病毒侵染T细胞后，流式检测侵染3天后，侵染效率可以达到53.26％，说明成功制备HAC-CAR-T细胞。

实施例5 HAC-CAR-T细胞体外活性检测

采用LDH释放法检测HAC-CAR-T细胞对工程细胞株MCF-1/PDL1和高表达PDL1的肿瘤细胞的杀伤效应，通过ELISA方法检测LDH释放，包括以下步骤：

S1、用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞调整到5×10⁴/mL。

S2、在96孔细胞培养板中加入靶细胞，每孔加100μL。取3个孔作为效应细胞(HAC-CAR-T细胞)自然释放对照孔，不加靶细胞，仅加100μL培养液。

S3、向各孔加100μL效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例10:1；5:1；1:1。自然释放孔不加效应细胞只加100μL培养液，效应细胞与靶细胞共孵育6小时，每个实验置三个复孔。

S4、最大释放孔中(阳性对照)加10μL Lysis Solution(10×)，孵育45min-60min，每个实验置三个复孔。

S5、取上述3和4中待测样品和对照样品各50μL，加入新鲜的96孔酶标板中，再加入反应液和底物，避光30min。

S6、加入50μL终止液。

S7、在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值)，检测波长490nm或492nm，在1小时内测完。

S8、特异性杀伤效率计算

杀伤率＝实验组LDH(OD)/最大LDH释放组(OD)。

计算公式：杀伤效率＝(实验组-效应自然释放-靶自然释放)/(靶最大释放-靶自然释放)×100％。

S9、通过CBA试剂盒测定细胞因子分泌情况，同时计算CAR-T细胞各组中的增殖情况，并利用CD3和CD8抗体染色，确认增殖的T细胞中CD8阳性的T细胞的比例。

如图3所示，HAC CAR-T可以显著杀伤SMCCC7721肿瘤细胞，对高表达PDL-1的MCF-7细胞的杀伤效果好于MCF-7普通肿瘤细胞，图中，横坐标表示CAR-T细胞与肿瘤细胞不同的效靶比，纵坐标表示杀伤效率，不同类型的柱状图表示不同肿瘤细胞。相应的，如图4所示，横坐标表示T细胞与肿瘤或CAR-T细胞与肿瘤的效靶比，纵坐标表示细胞数目，T代表T细胞，HAC代表CAR-T细胞，可见与普通T细胞相比，CAR-T细胞在接触到肿瘤细胞刺激后，可发生特异性激活和增殖，且高效靶比情况下更为显著。

如图5杀伤实验中，横坐标表示CAR-T细胞与肿瘤细胞不同的效靶比，纵坐标表示细胞因子含量，检测培养上清中的细胞因子，发现CAR-T杀伤实验组IL-2(图5A)和TNF-α(图5B)的分泌显著升高。如图6所示，为CD3/CD8流式抗体检测CAR-T对MCF7/MCF7-PDL1/HeLa/SMC7721 4种细胞株杀伤后CD8T细胞的比例，纵坐标PE信号表示特异性检测CD3分子表达，横坐标FITC信号表示检测CD8分子表达，通过流式细胞仪检测，HAC CAR-T细胞激活后，主要是CD8T细胞发生特异性增殖。

如图7所示，对不同细胞MCF7(图7A)、MCF7-PD-L1(图7B)和SMC7721(图7C)，CAR-PD-1表示CAR分子的胞外段为普通PD-1分子，CAR-PD-1-HAC表示本发明构建的HAC-CAR嵌合抗原受体分子，与PD-1CAR-T相比，HAC CAR-T效果更好。

上述结果证明，HAC-CART细胞在接触肿瘤细胞后，可以特异性的发生活化和增殖，释放细胞因子，杀伤肿瘤细胞，其中CD8阳性T细胞起到主要作用。同时比较了PD-1CAR-T和HAC CAR-T对肿瘤的杀伤效果，结果显示HAC-CAR-T明显优于PD-1CAR-T.

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。