一种芽胞杆菌感受态细胞的制备方法与流程

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽胞杆菌感受态细胞的制备方法。

背景技术：
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芽胞杆菌大量存在于各种生境，生理代谢途径多样，易于培养，不仅广泛应用于生物农药、生物肥料、生物饲料、生物修复以及食品加工等领域，而且广泛用于基础生命科学问题的探索，在微生物学研究和分子生物学研究中均占有重要的地位。其中通过基因敲入和敲除验证分子机理、生产目标蛋白是高效且普遍应用的技术途径。虽然有研究表明芽胞杆菌细胞生长周期的对数生长期会出现便于自然转化的感受态，然而实际工作中却发现很难将外源基因转入芽胞杆菌，推测特殊的细胞壁结构是转化失败的主要原因之一。芽胞杆菌所属的革兰氏阳性菌细胞壁厚度大、化学组份简单，一般含90%肽聚糖和10%磷壁酸。肽聚糖分子由肽和聚糖两部分组成，其中肽包括四肽尾和肽桥，而聚糖由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸两种单糖相互间隔连接而成。青霉素作用于肽桥，可以有效抑制新细胞壁的合成；溶菌酶能水解连接双糖单位的β-1,4-糖苷键，从而导致细胞壁肽聚糖“散架”，它对新合成的细胞壁及成熟细胞壁都能起破坏作用。高浓度的青霉素或溶菌酶会完全破坏细胞壁结构，具有致死效应。但是适当的浓度可能在保证不危害细胞生存的情况下使细胞壁结构暂时松散，从而易于实现外源基因转化。细胞壁破坏的情况下，细胞对渗透压和机械力敏感，此时，应注意避免制备过程中培养基的离子强度以及离心收集菌体等操作对菌体的可能伤害。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是针对上述问题，提供一种能够成功得到芽胞杆菌感受态细胞的芽胞杆菌感受态细胞的制备方法。

一种芽胞杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，将芽胞杆菌先用青霉素g钠处理，然后再用溶菌酶处理，然后再经洗涤后收集菌体，得到芽胞杆菌感受态细胞。

优选，包括以下步骤：

将芽胞杆菌接种至含0.5m蔗糖的lb培养基中，培养至对数生长期，培养期间培养物中加入青霉素g钠，使其终浓度为10μg/ml，然后收集菌体，菌体用蔗糖甘油缓冲液洗涤若干次，收集菌体，收集的菌体重悬于蔗糖甘油缓冲液中，每毫升菌悬液中加入37.5μg溶菌酶进行处理，孵育，然后收集菌体，菌体用蔗糖甘油缓冲液洗涤若干次，收集菌体，收集的菌体重悬于蔗糖甘油缓冲液中，由此得到芽胞杆菌感受态细胞；

所述的蔗糖甘油缓冲液含有：0.5m蔗糖，100ml/l甘油，余量为水。

优选，所述的芽胞杆菌感受态细胞的制备方法，具体步骤为：将芽胞杆菌接种至lb液体培养基中，30℃震荡培养过夜，按体积分数2%的接种量接种至含0.5m蔗糖的lb培养基中，30℃振荡培养3.5h，每毫升培养物中加入10μg青霉素g钠，继续培养2.5h，取菌液，离心收集菌体，菌体用冰预冷的蔗糖甘油缓冲液洗涤若干次，离心收集菌体，收集的菌体重悬于冰预冷的蔗糖甘油缓冲液中，每毫升菌悬液中加入37.5μg溶菌酶，37℃孵育20min，离心收集菌体，菌体用冰预冷的蔗糖甘油缓冲液洗涤若干次，离心收集菌体，收集的菌体重悬于冰预冷的蔗糖甘油缓冲液中，由此得到芽胞杆菌感受态细胞。

优选，所述的芽胞杆菌为lysinibacillussphaericusc3-41或lysinibacillusfusiformiszc-1。

利用本发明的方法制备的芽胞杆菌感受态细胞，能够成功地将质粒转入芽胞杆菌中。本发明的制备方法操作简便，成本低廉，效果好，解决了芽胞杆菌感受态细胞制备困难的问题，为开展芽胞杆菌的基因敲除/敲入、揭示表型特征的分子机理及工业生产需求提供了新的技术途径。

附图说明：

图1是质粒pzg转化lysinibacillussphaericusc3-41感受态细胞在抗性平板阳性克隆情况照片；

图2是质粒pksv7转化lysinibacillusfusiformiszc-1感受态细胞在抗性平板阳性克隆情况照片。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：lysinibacillussphaericusc3-41感受态细胞制备及转化效果

（1）从斜面取一环lysinibacillussphaericusc3-41，接种至5mllb液体培养基，30℃，160rpm振荡培养过夜；

（2）按体积分数2%的接种量接至200ml的含0.5m蔗糖的lb培养基（lb+0.5m蔗糖培养基），30℃，160rpm振荡培养3.5h；

（3）向200ml培养体系加入终浓度10μg/ml的青霉素g钠溶液，继续培养2.5h（30℃，160rpm振荡培养）；

（4）4℃，8000rpm离心8min，收集菌体；用冰预冷的蔗糖甘油缓冲液（sucroseglycerolwashbuffer，sgwb）洗涤菌体三次；蔗糖甘油缓冲液（sucroseglycerolwashbuffer，sgwb）含有：0.5m蔗糖，100ml/l甘油，余量为水，其是称取171g蔗糖溶于适量的双蒸水中，然后加入100ml甘油，加双蒸水定容至1000ml，完全溶解后利用naoh将ph值调至7.0，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱保存；sgwb需要现配现用，配制好后过滤除菌，使用时需要预先置于冰上预冷；

（5）4℃，8000rpm离心8min，收集菌体；将收集的菌体重悬于1ml冰预冷的sgwb中，向菌悬液中加入1.5μl溶菌酶液（25mg/ml），37℃孵育20min；

（6）4℃，8000rpm离心5min，收集菌体；用冰预冷的sgwb洗涤2次（离心机加速和减速设定慢一些，以免破坏已经脆弱的细胞）；

（7）4℃，8000rpm离心5min，收集菌体，将收集的菌体重悬于1ml冰预冷的sgwb中，由此获得lysinibacillussphaericusc3-41感受态细胞；按100μl/管分装，-80℃保存或直接进行下一步；

（8）取100μl上述感受态细胞冰上溶化；

（9）然后加入5μl（约300ng）pzg质粒，轻轻混匀后冰浴5min；

（10）将感受态细胞与质粒的混合物加入到预冷的电转杯中，设定2000v，电击5ms；冰浴10min；

（11）冰浴后加入500μl含0.5m蔗糖的lb培养基（lb+0.5m蔗糖培养基），37℃振荡培养1.5h后，取样涂布含10μg/ml氯霉素的lb平板，37℃静置培养过夜（见图1）；

（12）挑取抗性板上的单菌落转接到含10μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养5h，提取质粒，测序验证质粒是否成功转入。

结果：

（1）菌株lysinibacillussphaericusc3-41本身并不具备氯霉素抗性，转化后其可以在抗性平板和抗性液体培养基中生长，基本说明质粒转化成功。

（2）特异性引物测序结果显示，质粒pzg成功转入本发明所述的方法制备的lysinibacillussphaericusc3-41感受态细胞。

实施例2：lysinibacillusfusiformiszc-1感受态细胞制备及转化效果

（1）从斜面取一环lysinibacillusfusiformiszc-1，接种至5mllb液体培养基，30℃，160rpm振荡培养过夜；

（2）按体积分数2%的接种量接至200ml的含0.5m蔗糖的lb培养基（lb+0.5m蔗糖培养基），30℃，160rpm振荡培养3.5h；

（3）向200ml培养体系加入终浓度10μg/ml的青霉素g钠溶液，继续培养2.5h（30℃，160rpm振荡培养）；

（4）4℃，8000rpm离心8min，收集菌体；用冰预冷的蔗糖甘油缓冲液（sucroseglycerolwashbuffer，sgwb）（现配现用）洗涤菌体三次；蔗糖甘油缓冲液（sucroseglycerolwashbuffer，sgwb）含有：0.5m蔗糖，100ml/l甘油，余量为水；其是称取171g蔗糖溶于适量的双蒸水中，然后加入100ml甘油，加双蒸水定容至1000ml，完全溶解后利用naoh将ph值调至7.0，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱保存；sgwb需要现配现用，配制好后进行过滤除菌，使用时需要预先在冰上预冷；

（5）4℃，8000rpm离心8min，收集菌体；将收集的菌体重悬于1ml冰预冷的sgwb中，向菌悬液中加入1.5μl溶菌酶液（25mg/ml），37℃孵育20min；

（6）4℃，8000rpm离心5min，收集菌体；用冰预冷的sgwb洗涤2次（离心机加速和减速设定慢一些，以免破坏已经脆弱的细胞）；

（7）4℃，8000rpm离心5min，收集菌体，将收集的菌体重悬于1ml冰预冷的sgwb中，由此获得lysinibacillusfusiformiszc-1感受态细胞；按100μl/管分装，-80℃保存或直接进行下一步；

（8）取100μl上述感受态细胞冰上溶化；

（9）然后加入5μl（约300ng）pksv7质粒，轻轻混匀后冰浴5min；

（10）将感受态细胞与质粒的混合物加入到预冷的电转杯中，设定2000v，电击5ms；冰浴10min；

（11）冰浴后加入500μl含0.5m蔗糖的lb培养基（lb+0.5m蔗糖培养基），37℃振荡培养3h后，取样涂布含10μg/ml氯霉素的lb平板，37℃静置培养过夜（见图2）；

（12）挑取抗性板上的单菌落转接到含10μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养5h，提取质粒，测序验证质粒是否成功转入。

结果：

（1）菌株lysinibacillusfusiformiszc-1本身并不具备氯霉素抗性，转化后其可以在抗性平板和抗性液体培养基中生长，基本说明质粒转化成功。

（2）特异性引物测序结果显示，质粒pksv7成功转入本发明所述方法制备的lysinibacillusfusiformiszc-1感受态细胞。

上述试验表明，使用适量浓度的青霉素g钠和溶菌酶温和降低细胞壁的结构紧密程度，同时注意避免制备过程中培养基的离子强度以及离心收集菌体等操作对细胞的可能伤害，可以有效地获得芽胞杆菌感受态细胞，实现转化。后续电转化实验证实2种质粒可成功转入2种芽胞杆菌的感受态细胞，克服了常规方法无法制备这些芽胞杆菌感受态细胞的困难，经本发明所述的新方法成功获得了转化成功的感受态细胞。本发明所述的芽胞杆菌感受态细胞的制备方法，为满足科研及工业生产需求提供了新的技术途径。