一种适用于中国地区肥胖症的基因诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及一种生物
技术领域：
，尤其是一种在基因工程领域进行中国地区肥胖症诊断的试剂盒。
背景技术：
：人类信号转导和转录激活因子-3(singletransducerandactivatoroftranscription-3,STAT3)基因定位于第17号染色体，位于17q21.31区。在一个以家系为基础的遗传关联研究中，发现STAT3基因rs2293152位点与胰岛素抵抗存在关联，一项针对法国白人人群的研究结果显示，STAT3基因rs8069645位点,rs744166位点,rs2293152位点和rs10530050位点与腹型肥胖存在关联,而针对阿根廷当地土著人群的遗传关联研究中，未发现STAT3基因rs2293152位点与肥胖和胰岛素抵抗存在关联[33]。目前关于STAT3基因多态性与肥胖的关联研究得出的结论并不一致。但是，在中国人群中STAT3基因与肥胖易感性关系的研究尚未见相关报道。STAT3基因在介导瘦素传导通路中具有重要作用，本研究针对STAT3基因与中国地区肥胖症的生物学相关性进行了系列实验研究。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种适用于中国地区肥胖症的基因诊断试剂盒。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种适用于中国地区肥胖症的基因诊断试剂盒，该试剂盒采用SEQIDNO：1所示核苷酸序列作为特异检测因子。作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒分别采用SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为上游引物和下游引物。作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒的聚合酶链式反应体系设置如下：PCR反应体系20μL，包括浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，浓度为10-20ng/μL的DNA模板1μL，2xTaqPCRPlusMasterMix为反应体系的一半10μL，加入6μL去离子水使总的反应体系为20μL；PCR扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸30s，共34个循环，然后72℃延伸8min，最后4℃保存。作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒还包含有如下的酶切反应体系：酶切反应体系20μL，包括15μLPCR扩增产物，1μL10×loadingBuffer，0.5μL限制性内切酶，加入去离子水至20μL，置于37℃恒温仪1-16h；所用限制性内切酶为MspI,置于37℃过夜酶解消化。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：我们的研究显示中国地区肥胖症的发病与其基因型明确相关，因此能够利用本发明的试剂盒对中国地区肥胖症的易感性与易感人群进行基因诊断。附图说明图1为rs2293152位点基因分型电泳图谱，图中：1、4道:GC基因型；2、3道:GG基因型；5道:CC基因型。图2为STAT3基因rs2293152位点纯和基因型GG正向测序图谱。图3为STAT3基因rs2293152位点杂合基因型GC正向测序图谱。图4为STAT3基因rs2293152位点纯和基因型CC正向测序图。具体实施方式以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种试剂及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。实施例1、基因组DNA的提取采用百泰克公司(北京)提供的全血DNA提取试剂盒，具体操作步骤如下：(1)取解冻后EDTA-K2抗凝全血样品，颠倒混匀后取约2mL至10mL离心管中，向离心管中加入红细胞裂解液至9mL；(2)颠倒混匀后放入37℃恒温摇床中，10min后取出放入低温高速离心机中12000r/min，离心10min；(3)离心完成后，弃上清，再次加入红细胞裂解液至6mL，颠倒混匀后放入37℃恒温摇床中10min；(4)10min后，于低温高速离心机中12000r/min，离心10min，弃上清；(5)在涡旋振荡器上振荡打散细胞团，加入3mL细胞核裂解液，轻柔吹打混匀至液体有黏连性，放入55℃水浴锅中；(6)待液体变的清亮没有细胞团取出，冷却至室温，加入1.5mL蛋白沉淀液，涡旋振荡至出现蛋白沉淀和泡沫，12000r/min离心10min；(7)将上清液转移至新的10mL离心管中，转移过程中注意不要把泡沫和沉淀移出；(8)加入异丙醇(与移出液体等量)约4mL，颠倒混匀试管至出现絮状物，即DNA，12000r/min离心5min；(9)取出弃上清，加入3mL70％乙醇溶液清洗DNA，12000r/min离心5min，弃上清后，室温放置晾干；(10)加入200μLDNA溶解液，溶解混匀后，离心分装。实施例2、位点的选择及检测序列的筛查确定根据国外参考文献结合生物信息数据库(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，HapMap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)。具体筛选过程如下：通过HapMap数据库获得中国人群和日本人群(CHB+JHB)STAT3的SNPs信息，导入Haploview4.2软件中，设置为：定义连锁不平衡模块时采用95％可信区间，最小等位基因频率(MAF)＞0.05，重新判分后,运行Tagger(标签)工具，采用SNP之间r2＞0.8的标准选择标签SNP。共从STAT3基因中选出22个标签SNP。为进一步筛选SNP，从数据库中选择192对性别，年龄匹配的肥胖与体重正常对象，运用SequenomSNP分型检测技术对选择的22个易感基因多态性位点进行检测分型，采用logistic回归的方法分析22个SNP与肥胖遗传易感性之间的关系发现4个位点的变异与慢性病相关联。结合文献综述结果，拟对STAT3基因rs2293152位点进行研究。在GeneBank中查相关序列，Rs2293152位于第17号染色体的反义链42329511位置。实施例3、引物设计在PubMeddbSNP数据库下载STAT3基因rs2293152位点的序列，根据上下游引物序列长度、PCR产物长度、无发夹结构、无二聚体、无错配、合适的退火温度等选择上下游引物。表1STAT3基因rs2293152位点引物序列实施例4、溶液配制及仪器准备(1)50xTAE溶液的配制取Tris24.2g、EDTA3.72g于烧杯中加入乙酸5.71ml，加入适量超纯水，用玻璃棒搅拌至无色透明，定容至100ml(若配制250ml按比例相应增加各成分的量)。室温保存。(2)1xTAE溶液的配制取50xTAE溶液20ml于容量瓶中用超纯水定容至1000ml，上下颠倒混匀，保存于室温。(3)2％胶板的制作称取2g琼脂糖，量取100ml1xTAE，一起放入锥形瓶中溶解，之后于微波炉中加热至液体呈无色透明并冒出大泡，取出，冷却至50℃左右，加入10μLEB，倒入封好的板中，并插好梳子，凉至凝胶凝固，至少需要30分钟。凝胶完全凝固后拔出梳子，胶板即制作好。表2主要试剂试剂名称生产厂家PCR扩增引物金唯智生物科技有限公司标准分子量100bpMarkerI上海莱枫生物科技有限公司2xTaqPCRPlusMasterMix上海莱枫生物科技有限公司MspI内切酶上海莱枫生物科技有限公司HaeⅢ内切酶上海莱枫生物科技有限公司琼脂糖上海莱枫生物科技有限公司Tris(三羟甲基氨基甲烷)上海化学试剂站异丙醇天津市科密欧化学试剂开发中心70％乙醇天津市恒兴化学试剂制造有限公司表3主要仪器仪器名称生产厂家LabCycler梯度PCR仪SENSO，德国DYY-8C型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂UVI自动凝胶成像分析系统基因有限公司低温高速离心机Eppendorf，德国气浴恒温振荡器金坛市精达仪器制造有限公司DK-8D型电热恒热水槽上海跃进医疗器械厂WD900SL23.2型Galanz微波炉格兰仕电器实业有限公司HVE-50型高压灭菌蒸汽锅Hirayama，日本BP221S型电子分析天平Sartorius，德国实施例5、PCR扩增反应体系设计实验过程中PCR的退火温度至关重要，根据梯度PCR选择最合适的温度作为退火温度。STAT3基因rs2293152位点的引物序列及PCR退火条件见表1，DNA模板如SEQIDNO：1所示。⑴、PCR反应体系，反应体系20μL，包括浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，浓度为10-20ng/μL的DNA模板1μL，2xTaqPCRPlusMasterMix为反应体系的一半10μL，加入6μL去离子水使总的反应体系为20μL。⑵、位点rs2293152的PCR扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸30s，共34个循环，然后72℃延伸8min，最后4℃保存。实施例6、酶切反应条件设定(1)酶切反应体系，反应体系20μL，包括15μLPCR扩增产物，1μL10×loadingBuffer，0.5μL限制性内切酶，加入去离子水至20μL，置于37℃恒温仪1-16h。(2)rs2293152位点按反应体系加样，所用限制性内切酶分别为MspI,置于37℃过夜酶解消化。(3)rs2293152位点酶切后序列如下表所示。表4rs2293152位点酶切后序列长度序列265bpSEQIDNO：1后265bp序列133bpSEQIDNO：1第53-185位合计133bp序列132bpSEQIDNO：1后132bp序列实施例7、凝胶成像分析及基因型鉴定酶消解产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，rs2293152电泳电压设置为稳流状态下电压100V，电泳1h。然后于凝胶成像仪下通过观察条带大小判定并记录样本基因型。(1)rs2293152位点:PCR扩增产物长度317bp，纯和基因型(GG)经MspI酶切后产生265bp一个片段；杂合基因型(GC)则产生265bp，132bp两个片段，纯和基因型(CC)则产生132bp、133bp两个片段，因132bp和133bp片段基本一致，电泳凝胶显示为一条片段(表4、5)。(2)限制性内切酶识别序列根据Fermentas公司分子生物应用指南2011-2012版用书。表5STAT3基因rs2293152位点PCR-RFLP分析附图1分别为STAT3基因rs2293152位点的PCR-RFLP实验电泳图谱。其中M泳道为标准分子量Marker，其它泳道为各位点的三种基因型，具体基因型分型结果见图中注释。rs2293152位点PCR扩增产物长度317bp，纯和基因型(GG)经MspI酶切后产生265bp一个片段；杂合基因型(GC)为两条265bp和132bp片段，纯和基因型(CC)显示为132bp和133bp的一条片段。实施例8、测序验证将STAT3基因rs2293152位点经PCR-RFLP试验判定基因型的PCR产物送往测序公司测序。测序结果验证了基因型的分型判定结果的正确性。基因型测序结果见图2至图4。实施例9、STAT3基因多态性和肥胖易感性的关联基因型GG、突变杂合型GC、突变纯合型CC和突变基因型(GC+CC)在病例组中分布频率分别为25.98％，48.29％，25.72％，74.02％；在对照组中的分布频率分别为33.68％，45.59％，20.74％，66.32％。以野生型GG为对照，突变杂合型GC的分布频率在病例组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。突变纯合型CC和突变基因型(GC+CC)在病例组和对照组之间的分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。调整年龄，性别，吸烟，饮酒，脂肪摄入量，蔬菜水果摄入量，静息活动时间等因素后，突变纯合型CC的OR值及95％CI为1.61(1.08,2.41)，突变基因型(GC+CC)的调整OR值及95％CI为1.41(1.02,1.94)。且rs2293152位点C等位基因与肥胖易感性有关联OR(95％CI)为1.29(1.07,1.56)。表6位点rs2293152与肥胖的关联(n,％)实施例10、中国地区肥胖症的易感性诊断标准数据采用SAS9.1(SASInstitute,USA)进行整理分析，发现：rs22931521位点CC基因型、GC+CC基因型和GG基因型频率分布差异有统计学意义(P＝0.020和P＝0.015；注：P<0.05有统计学差异；OR>1说明疾病的危险度因暴露而增加，暴露与疾病之间为“正”关联；OR<1说明疾病的危险度因暴露而减少，暴露与疾病之间为“负”关联。下同)；肥胖组rs2293152位点等位基因C分布频率高于对照组(P＝0.009)。rs2293152位点C等位基因与肥胖易感性有关联OR(95％CI)为1.29(1.07,1.56)。在调整年龄、性别、吸烟、饮酒、高脂饮食、蔬菜水果摄入和静息活动时间等协变量后，CC基因型和GC+CC基因型的OR(95％CI)和P值分别为1.61(1.08,2.41)，P＝0.013和1.41(1.02,1.94)，P＝0.036，有统计学意义，rs2293152基因多态性仍与肥胖易感性具有关联性，见表6。综上，当调整相关因素后，当OR＞1.0且P<0.05时，即表明检测对象对肥胖易感。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。序列表<110>郑州大学<120>一种适用于中国地区肥胖症的基因诊断试剂盒<160>3<210>1<211>317<212>DNA<213>人类（Homosapiens）<400>1TCCGGCTACTTGGTCACCTACATAGTTGATTGTTCCCCTGTGATTCAGATCCCGGAAATT60TAACATTCTGGGCACAAACACAAAAGTGATGAACATGGAAGAATCCAACAACGGCAGCCT120CTCTGCAGAATTCAAACACTTGGTATGTGGGAGGAGCTCCCCTTCACAAAGGGCCTCTGG180CTGCGGGAGAGGGCTAGGGAGAGCCTCACAGGACACCTGCCTTTTTCTTTTCTTACAGAC240CCTGAGGGAGCAGAGATGTGGGAATGGGGGCCGAGCCAATTGTGATGTAAGTTTTGTTGG300GGATGAAAGACAACTGG317<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2TCCGGCTACTTGGTCAC17<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3CCAGTTGTCTTTCATCCC18当前第1页1 2 3