1.一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌,使枯草芽孢杆菌中编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活后获得;
所述sleB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;cwlJ基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌,其特征在于,所述编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ无法表达。
3.权利要求1所述芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,步骤如下:
(i)以枯草芽孢杆菌为模板,进行PCR扩增,分别得到sleB1,cwlJ1片段;
sleB1片段扩增的PCR引物序列如下:
sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’;
sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’;
cwlJ1片段扩增的PCR引物序列如下:
cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’;
cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’;
(ii)以质粒pPIC9k为模板,进行PCR扩增,得到kmr片段;
所述的kmr片段PCR扩增引物序列如下:
kmr-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’;
kmr-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’;
(iii)以pPICZαA质粒为模板,进行PCR扩增,得到zeor片段;
所述的zeor片段PCR扩增引物序列如下:
zeor-up:5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’;
zeor-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’;
(iv)利用重叠PCR技术连接sleB1和kmr片段,制得sleB1-kmr片段,步骤如下:
初次PCR扩增,扩增体系如下:
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,模板sleB1 1μl,模板kmr 1μl,用ddH2O补足25μl;
初次PCR扩增,扩增程序如下:
95℃预变性5min;94℃变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸3.5min,5个循环;
补充PCR扩增,扩增体系如下:
向初次扩增后的体系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,10μmol/L引物sleB-up 1μl,10μmol/L引物kmr-down 1μl,用ddH2O补足50μl;
补充PCR扩增,扩增程序如下:
95℃预变性5min;94℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸4.5min,30个循环;72℃延伸10min,-20℃保存;
(v)利用重叠PCR技术连接cwlJ1和zeor片段,制得cwlJ1-zeor片段,步骤如下:
初次PCR扩增,扩增体系如下:
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,模板cwlJ1 1μl,模板zeor 1μl,用ddH2O补足25μl;
初次PCR扩增,扩增程序如下:
95℃预变性5min;94℃变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸3min,5个循环;
补充PCR扩增,扩增体系如下:
向初次扩增后的体系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,10μmol/L引物cwlJ-up 1μl,10μmol/L引物zeor-down 1μl,用ddH2O补足50μl;
补充PCR扩增,扩增程序如下:
95℃预变性5min;94℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸4min,30个循环;72℃延伸10min,-20℃保存;
(vi)将步骤(iv)制得的sleB1-kmr片段转化枯草芽孢杆菌获得sleB基因缺失菌后,再将步骤(v)制得的cwlJ1-zeor基因转化sleB基因缺失菌中获得sleB,cwlJ基因双缺失菌株,经筛选,制得芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(i)中,sleB1片段扩增的PCR扩增体系为50μl:
2×Taq PCR MasterMix 25μl,10μmol/L引物sleB-up 2.5μl,10μmol/L引物sleB-down 2.5μl,模板2.5μl,用ddH2O补足50μl;
sleB1片段扩增的PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸1.5min,30个循环;72℃延伸10min。
5.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(i)中,cwlJ1片段扩增的PCR扩增体系为50μl:
2×Taq PCR MasterMix 25μl,10μmol/L引物cwlJ-up 2.5μl,10μmol/L引物cwlJ-down 2.5μl,模板2.5μl,用ddH2O补足50μl;
cwlJ1片段扩增的PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸1.5min,30个循环;72℃延伸10min。
6.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(ii)中,所述的kmr片段PCR扩增体系为50μl:
2×Taq PCR MasterMix 25μl,10μmol/L引物kmr-up 2.5μl,10μmol/L引物kmr-down 2.5μl,模板2.5μl,用ddH2O补足50μl;
所述的kmr片段PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸3.5min,30个循环;72℃延伸10min。
7.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(iii)中,所述的zeor片段PCR扩增体系为50μl:
2×Taq PCR MasterMix 25μl,10μmol/L引物zeor-up 2.5μl,10μmol/L引物zeor-down 2.5μl,模板2.5μl,用ddH2O补足50μl;
所述的zeor片段PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸10min。
8.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(vi)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168;
优选的,所述步骤(vi)中的转化为:将枯草芽孢杆菌感受态细胞在2500V、25uF的条件下电击一次,时间常数=4.5~5.0ms;
优选的,所述步骤(vi)中的筛选,包括卡那青霉素筛选和博来霉素筛选。
9.如权利要求8所述的构建方法,其特征在于,所述卡那青霉素筛选步骤如下:
在含有卡那青霉素抗生素的平板上进行白斑筛选,挑取白色单一斑点,接种到含有卡那青霉素的液体LB培养基,培养至对数末期,对能在含有卡那青霉素抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证,将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒,对提取的质粒进行酶切验证,含有目的条带的,即得;
含有卡那青霉素的液体LB培养基,每升组分如下:
10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg卡那青霉素,定容至1L。
10.如权利要求8所述的构建方法,其特征在于,所述博来霉素筛选步骤如下:
在含有博来霉素抗生素的平板上进行白斑筛选,挑取白色单一斑点,接种到含有博来霉素的液体LB培养基,培养至对数末期,对能在含有博来霉素抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证,将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒,对提取的质粒进行酶切验证,含有目的条带的,即得;
含有博来霉素的液体LB培养基,每升组分如下:
10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg博来霉素,定容至1L。