一种苝醌类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及以真菌竹黄子座为原料首次分离到的一种苝醌类化合物及其制备方法和用途。上述化合物对肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为研制治疗多种临床常见多发癌症的药物。

背景技术：

真菌竹黄为肉座菌科真菌竹黄(Shiraia bambusicola Henn.)的子座，该药材目前收载于江西省中药材标准2014年版。真菌竹黄是一种寄生在竹子上的真菌药材，别名竹花、赤团子、竹赤团子等，主要分布于四川、云南、江西、江苏、浙江和福建等地。具有通经活络、散瘀止痛、止咳化痰等功效，用于治疗风湿性关节炎、胃气痛、气管炎、百日咳等病症。

真菌竹黄所含化学成分复杂且结构多样，目前已经从真菌竹黄分离出来的苝醌类化合物有竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素、hypomycin A。

技术实现要素：

本发明的一个方面涉及一种下式(I)的新化合物或其前药或其溶剂化物，

式(I)化合物分子式为C₃₀H₂₂O₉，属于苝醌类化合物，可以命名为为竹红菌素E。

本发明的另一个方面还涉及式(I)的化合物的前药。此处“前药”是指某些本身可能并不具有或仅有极低的药理学活性的式(I)的化合物的衍生物，其在施用至哺乳动物(特别是人)后可体内转化为式(I)化合物(例如通过水解切割来转化)从而起到治疗作用。此类衍生物被称为“前药”或“药物前体”或“前驱药物”。本领域技术人员熟知，可例如通过用已知的某些官能团替换式(I)的化合物中存在的合适官能团，来生产前药。例如，将式(I)的化合物中的羟基替换成醚、酰胺或酯基，可能得到某些前药。例如，式(I)的化合物的前药的例子包括但不限于其羟基与不同酸形成的酯，例如：甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、异丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、庚酸酯、辛酸酯、丙烯酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸酯、苯基丁酸酯、酒石酸酯、棒酸酯、柠檬酸酯、癸酸酯、延胡索酸酯、葡糖酸酯、谷氨酸酯、乙醇酸酯、乳酸酯、月桂酸酯、苹果酸酯、马来酸酯、丙二酸酯、油酸酯、草酸酯、棕榈酸酯、泛酸酯、琥珀酸酯等等。

本发明的另一个方面还涉及式(I)的化合物的溶剂化物，例如其可药用溶剂化物，尤其是其水合物。术语“溶剂化物”用于描述本发明的化合物与溶剂分子之间的分子复合物。溶剂化物的例子包括但不限于：本发明的化合物与水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、氯仿、丙酮、乙醇胺或其混合物组成的溶剂化物。当溶剂是水时，亦称“水合物”。本发明中，一个溶剂分子可与本发明的化合物的一个分子结合，例如，一水合物；或者，超过一个溶剂分子可与本发明的化合物的一个分子结合，例如，二水合物或多水合物；或者，少于一个溶剂分子可与本发明的化合物的一个分子结合，例如，半水合物。本领域技术人员理解，这些不同形式的溶剂化物通常不会对式(I)的化合物的药理活性有显著影响。

本发明的另一个方面涉及式(I)化合物的制备方法，其大体包括以下步骤：(1)用乙醇回流提取真菌竹黄的子座；(2)浓缩乙醇提取液；(3)氯仿萃取；(4)浓缩氯仿萃取液；(5)柱层析分离；以及任选地(6)纯化。特别地，所述方法的步骤包括：

(1)用乙醇对真菌竹黄的子座进行加热回流，过滤后得乙醇提取液；

(2)将乙醇提取液浓缩，得乙醇浸膏；

(3)将乙醇浸膏用水溶解后，再用氯仿萃取，得氯仿萃取液；

(4)将氯仿萃取液浓缩，得氯仿浸膏；

(5)对氯仿浸膏进行柱层析分离，得粗品；

(6)任选地对(5)所得粗品进行纯化。

在一种实施方式中，工艺步骤(1)中，优选以阴干的真菌竹黄子座为原料，经粉碎后用乙醇加热回流提取，滤过后得乙醇提取液。其中所用乙醇优选高浓度乙醇水溶液，例如大于75％，大于85％、大于95％，也可以采用100％纯乙醇，更优选75％-95％的乙醇水溶液，最优选为85％左右。

在一种实施方式中，工艺步骤(2)中，浓缩优选减压浓缩。

在一种实施方式中，工艺步骤(3)中，优选纯净水，例如蒸馏水或反渗透高纯水。

在一种实施方式中，工艺步骤(4)中，浓缩优选减压浓缩。

在一种实施方式中，工艺步骤(5)中，柱层析分离优选包括以下步骤：(a)将氯仿浸膏与硅胶(硅胶粒度例如为100-200目)拌样，转入柱层析，用氯仿-甲醇混合液(氯仿-甲醇体积配比例如为从200∶1到20∶1)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似(在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点)洗脱液，得8个馏分；以及(b)将第3个馏分与C₁₈拌样，转入C₁₈反相柱层析，用乙腈-水溶液(乙腈体积浓度例如为30％-70％)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似(在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点)洗脱馏分，得粗品。

在一种实施方式中，工艺步骤(6)的纯化例如可以如下进行：将步骤(5)得到的竹红菌素E粗品以乙腈-水为洗脱剂，经制备液相色谱进行纯化。步骤(6)也可以额外包括其他进一步的提纯步骤，例如重结晶等。

经步骤(6)纯化后，所得的化合物的纯度可以为，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、或99％，或更高。

以上工艺步骤(1)-(6)是相对独立的，所以上述各种实施方式可以任意组合，其组合所得技术方案和工艺条件都在本公开范围内。

本申请的式(I)化合物的制备方法的一个示例性实施方案示于附图1中。

经超导核磁共振波谱、质谱等多种检测，确定了通过上述方法获得的本发明化合物(竹红菌素E)的分子式为C₃₀H₂₂O₉，化学结构式为：

利用上述制备方法获得的经纯化的竹红菌素E为红色无定型粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机试剂，熔点为266.2-268.0℃，光学活性[α]²⁰_D-58.8(c 0.068，MeOH)，UV(CH₃OH)λ_max235nm、342nm和460nm。

根据式(I)结构，有机合成技术人员也可以适当地设计合成路线，通过有机合成的方法来制备式(I)化合物。

在获得式(I)化合物后，本领域技术人员可以很容易地对其进行化学修饰而获得其前药。在获得式(I)化合物后，本领域技术人员可以很容易地得到式(I)化合物的溶剂化物。

发明人已经通过实验(例如测定抑制肿瘤细胞增殖的MTT法等)证明，本发明的化合物竹红菌素E对癌症细胞的抑制作用并不局限于特定癌症，而是对多种癌症均显示显著的抑制作用，例如人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞。特别地，本发明竹红菌素E对人胃癌细胞和人卵巢癌细胞的抑制作用明显强于其他竹红菌素，例如竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素和竹红菌丁素。而且，本发明竹红菌素E不仅对肿瘤的增殖有抑制作用，还能够抑制肿瘤的迁移和侵袭。

因此，本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含作为活性成分的式(I)的化合物或其前药或其溶剂化物以及可药用载体和/或赋形剂。对于可药用载体和赋形剂并无特殊要求，只要其满足相关药品监管规定并且与本发明的化合物相容即可。本领域技术人员可以根据给药途径、剂型等等来选择合适的可药用载体或赋形剂。

本文所用之“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和延缓吸收剂等。可用的药物载体可以是固体或液体的。示例性的固体载体是乳糖、蔗糖、云母、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体是糖浆、花生油、橄榄油、水、药用缓冲液等。

示例性的可药用赋形剂的例子包括下述这些：填料，例如淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉等)、糖(包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇等)；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、褐藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如聚维酮、乙醇酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钠和碳酸氢钠；用于延迟分解的试剂，例如石蜡；再吸收加速剂，例如季铵化合物；表面活性剂，例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯；吸附性载体，例如，高岭土和斑脱土以及润滑剂，例如，滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙以及固体聚乙二醇。

所述的药物组合物可以被配置为任何合适的剂型，例如液体剂型(例如溶液剂、悬浮剂、糖浆、乳剂等)或半固体剂型(例如软膏剂、凝胶剂等)或固体剂型(例如片剂、丸剂、颗粒、胶囊等)。根据需要，所述药物组合物的施用方式可以为，例如口服、肠胃外、皮内、皮下、肌内、腹膜内等。

式(I)的化合物可以与其他药物活性物质联合使用，所述其他药物活性物质可以与本申请式(I)的化合物同时施用或分别以任何合适次序施用。或者，本发明的药物组合物可含有超过一种活性成分。其它的活性物质可以为，例如抗有丝分裂作用的药物(例如紫杉醇或长春新碱等)、抗代谢药(例如吉西他滨等)、针对DNA的药物(例如阿霉素等)、针对拓扑异构酶的药物(如依托泊苷等)、针对肿瘤细胞中生物靶点的药物(例如郝赛酊等)。

所述药物组合物可以通过将至少一种本发明化合物(作为活性成分)与一种或多种药物上合适的载体或赋形剂组合来制备，所述载体和赋形剂能协助将活性化合物加工成最终的药物制剂。

本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：施予所述哺乳动物治疗有效量的式(I)化合物或其前药或其药学上可接受溶剂化物。

本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：施予所述哺乳动物治疗有效量的本发明的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的式(I)的化合物或其前药或其溶剂化物以及可药用载体和/或赋形剂。

本发明还涉及(I)化合物或其前药或溶剂化物用于治疗疾病的用途，特别是在哺乳动物(特别是人)中治疗癌症的用途。

本发明还涉及(I)化合物或其前药或溶剂化物在制备用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的药物中的用途。

上文所述“癌症”也包括肿瘤，例如为乳癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、喉癌、肝癌、结肠癌、甲状腺癌、黑素瘤、肾癌、睾丸癌、白血病、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌等等。优选地，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌。更优选地，所述癌症为胃癌和卵巢癌。

术语“治疗有效量”在本文中使用时表示：当施用给需要治疗的哺乳动物(特别是人)时，足以起到有效治疗效果的本发明化合物或其前药或溶剂化物的量。因此，本发明的化合物或其盐或溶剂化物的治疗有效量是足以抑制、减少或消除癌细胞的量。发明人已发现：竹红菌素E在0.01μmol/L～100μmol/L时对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用。但是，在具体治疗时，医生可以根据发病对象、病情严重程度、并发症的存在与否、是否联合用药等情况来调整并具体确定适合于病人使用的具体剂量。

术语“治疗”在本文中使用时表示：预防、缓解、消除或治愈相应的病症。

除非另有声明，本文中提到的“式(I)的化合物”、“式(I)化合物”和“本发明的化合物”包括其无定形体、其各种晶型、其立体异构体、其互变异构体和经同位素标记的形式。所有这些以不同形式存在的化合物都落入本发明和给出的结构式的范围内。

术语“立体异构体”指具有相同化学组成但是其原子或基团空间排列不同的化合物。除非另有声明，本文所公开的新型化合物的所有立体异构体(例如对映异构体和非对映异构体及其外消旋混合物)都包含在本发明的化合物的范围内。此外，本文所公开的新型化合物的所有互变异构体或顺反异构体也都包含在本发明的化合物的范围内。可通过本领域技术人员公知的传统技术(例如分级分离结晶、手性色谱拆分等)来分离本发明化合物的各种异构体。

本发明还涵盖经同位素标记的本发明化合物，其中，一个或多个原子被具有相同原子序数但是原子量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子量或质量数的原子替换。适于包括进本发明化合物的同位素的例子包括氢的同位素，例如²H和³H，碳的同位素，例如¹¹C、¹³C和¹⁴C，氧的同位素，例如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O。例如，掺入了放射性同位素的本发明化合物，可用于药物的组织分布研究。放射性同位素氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)特别适用于该目的，因为它们易于掺入并且容易被检测。通常可通过本领域技术人员已知的传统技术，来制备经同位素标记的本发明化合物。

附图说明

图1显示本申请式(I)的苝醌类化合物的制备方法的一个实施方案的流程图：

图2为高分辨质谱图，说明竹红菌素E的分子量；

图3为核磁共振¹H NMR图，说明了竹红菌素E结构中氢(-CH，-CH₂，-CH₃，-CH₃O)的归属；

图4为核磁共振¹³C NMR图，说明了竹红菌素E结构中碳(O＝C-，-C＝C，-CH₂，-CH₃)的归属；

图5为核磁共振HSQC谱图，说明了竹红菌素E结构中相关的碳与氢的归属；

图6为核磁共振HMBC谱图，说明了竹红菌素E结构中远程碳与氢的相关确定碳的连接位置；

图7为核磁共振DEPT谱图，说明了竹红菌素E结构中相关的碳(-CH₃O，-CH₂，-CH₃，-CH)的归属。

图8显示的为竹红菌素E对BGC-823(人胃癌细胞)和A2780(人卵巢癌细胞)的迁移和侵袭的抑制的实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

试剂

柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产。乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

实施例1：真菌竹黄中苝醌类化合物竹红菌素E的提取和分离。

真菌竹黄于2015年6月20日采自浙江省景宁畲族自治县，经江西省药品检验检测研究万林春副主任中药师鉴定为肉座菌科真菌竹黄Shiraia bambusicola Henn.的子座，标本保留在江西省药品检验检测研究标本室(标本号JXSSYJS2015016)

竹红菌素E的制备步骤依次如下：

(1)乙醇加热回流提取：真菌竹黄子座阴干后粉碎，经粉碎后的真菌竹黄子座100.0Kg，用85％用乙醇加热回流(多功能提取罐(上海泽望自动化设备有限公司))提取3次，过滤，得85％乙醇提取液；

(2)浓缩85％乙醇提取液：将85％乙醇提取液减压浓缩(EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司))得乙醇浸膏4.8Kg，在减压浓缩过程中回收乙醇；

(3)萃取：把85％乙醇浸膏用蒸馏水溶解，再用氯仿萃取4次，得氯仿萃取液；

(4)浓缩氯仿萃取液：将氯仿提取液减压浓缩(EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司))得氯仿浸膏460g，在减压浓缩过程中回收氯仿；

(5)柱层析分离：将氯仿浸膏与硅胶拌样，转入柱层析，硅胶粒度100～200目(青岛海洋化工厂)，用氯仿-甲醇洗脱剂梯度洗脱，氯仿-甲醇体积配比为200∶1、100∶1、50∶1、20∶1各2L；将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并在薄层板(青岛海洋化工厂)相同位置具有相同颜色的斑点的洗脱馏分，得8个馏分，第3个馏分与C₁₈拌样，转入C₁₈反相柱层析，用乙腈-水洗脱剂梯度洗脱，乙腈体积浓度为40％、50％、60％、70％各500mL，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点的洗脱馏分，得竹红菌素E粗品；

(6)单体化合物的纯化：竹红菌素E粗品以乙腈-水(40∶60，v/v，7mL/min)作为洗脱剂，采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，经安捷伦1200型制备高效液相色谱得本发明的竹红菌素E(25mg)。

实施例2：苝醌类化合物竹红菌素E的结构鉴定：

竹红菌素E的理化性质如下：红色无定型粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机试剂，RY-IG型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)测得其熔点为266.2～268.0℃，Perkin-Elmer 341旋光仪(美国PERKIN ELMER有限公司)测得其旋光度为-0.04，光学活性[α]²⁰_D-58.8(c0.068，MeOH)，岛津UV-260紫外分光光度计(日本岛津公司)显示其UV(CH₃OH)λ_max235nm、342nm和460nm；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-TOF质谱仪(美国Waters有限公司)得到该化合物的精确分子量549.1171，推算其分子式为C₃₀H₂₂O₉。Varian UNITY INOVA 600型超导核磁共振仪(美国Varian有限公司)得到其¹H和¹³C NMR数据见表1，同时，通过测定H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)和无畸变极化转移增强法(DEPT)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构，化学结构式如下：

表1竹红菌素E氢谱和碳谱数据表(δin ppm，J in Hz)

注：INOVA 600MHz；δ化学位移单位ppm，¹H NMR和¹³C NMR分别以溶剂中残存的氯仿(δ_H7.260ppm)和氘代氯仿(δ_c 77.160ppm)为内标；核磁共振信号的归属是在HSQC、HMBC等二维谱基础上完成的。

实施例3：苝醌类化合物竹红菌素E的体外抗肿瘤活性测试

测试原理：MTT法：活细胞线粒体中存在着与NAPP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)相关的脱氢酶，琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的噻唑蓝MTT(3-(4，5)-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用二甲亚砜(DMSO)溶解甲瓒后可用酶标仪在570nm，630nm处检测吸光度，光密度值与活细胞数成正比。

所用细胞株为：BGC-823(人胃癌细胞)、Bel(人肝癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)和A549(人肺癌细胞)，均购自于ATCC公司。

试验方法：MTT法：取对数生长细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×10⁴细胞/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃/5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时后，弃去原培养液。每一样品设计6个浓度梯度，然后在试验孔中加入100μL含有各浓度梯度的上述制备的竹红菌素E以及紫杉醇(阳性对照)的培养基，每一浓度平行6孔；对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃/5％CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时后，每孔加入新鲜配置的含5mg/mLMTT的无血清培养基20μL，37℃下继续培养4小时后，去除上清液。每孔加入150μL DMSO溶解Formazan沉淀，置微量震荡器上震荡5分钟使其充分溶解。在酶标仪上测定570nm，630nm处的吸光度，可反映活细胞数量。通过SPSS软件计算药物的抑制浓度(IC₅₀)值。计算公式如下：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(试验孔测定值/对照孔测定值)×100％。结果在下表2-6中示出。

表2竹红菌素E对BGC-823(人胃癌细胞)的抑制作用

表3竹红菌素E对A2780(人卵巢癌细胞)的抑制作用

表4竹红菌素E对Bel(人肝癌细胞)的抑制作用

表5竹红菌素E对HCT-8(人结肠癌细胞)的抑制作用

表6竹红菌素E对A549(人肺癌细胞)的抑制作用

实验证明竹红菌素E在0.01μmol/L～100μmol/L时对人胃癌细胞和人卵巢癌细胞均有明显的抑制作用，IC₅₀分别为0.541μM和0.125μM。其IC₅₀值显著小于其他四种竹红菌素。并且，竹红菌素E在0.01μmol/L～100μmol/L时也对人肝癌细胞、人结肠癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用，IC₅₀分别为1.111μM、2.146μM和0.518μM。

小结：竹红菌素E对人胃癌细胞和人卵巢癌细胞均有较强抑制作用，其抑制作用显著强于竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素和竹红菌丁素，可用于研究治疗癌症或肿瘤的药物。而且竹红菌素E对癌细胞的抑制作用不仅限于特定肿瘤，而是对多种肿瘤均显示抑制。

实施例4：苝醌类化合物竹红菌素E的体外抗肿瘤迁移和侵袭测试

1.迁移测试

所用细胞株为：BGC-823(人胃癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)

实验方法：

(1)取出Oris-compatible 96孔板，垂直插入配套的stoppers，检查stoppers，确保完全垂直插入对应的孔且紧密密封于孔的底部，然后放入37℃培养箱预热1h。

(2)收集对数期生长的细胞(BGC-823，A2780)制成细胞悬液，调整细胞密度至0.3×10⁶个/mL。

(3)将上述调整好浓度的细胞，分别取100uL加入预热的含有stoppers的Oris-compatible 96孔板，最终每孔细胞浓度为0.3×10⁵个/孔，加入后轻微水平晃动96孔板使细胞悬液分布均匀，放入5％CO₂，37℃细胞培养箱培养。

(4)实验分组设含25ng/mL EGF药物组(0.5μmol/L，0.1μmol/L)；25ng/mL EGF组，空白组(无EGF)，EGF阳性药组(BB-94，购自美国Selleck公司)，每组设3个复孔。

(5)待细胞过夜单层贴壁后，垂直取下stoppers，小心吸尽培养基，用PBS清洗两遍。加入不同浓度的含药培养基，培养72h。

(6)72h后取出培养板，每孔加入100μL甲醇固定10min，0.5％结晶紫染色30min，利用Olympus IX73荧光倒置显微镜(奥林巴斯有限公司)拍照。

细胞迁移实验结果见附图8A。

2.侵袭测试

所用细胞株为：BGC-823(人胃癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)

实验方法：

(1)收集对数期生长的细胞(BGC-823，A2780)制成细胞悬液，调整细胞密度至0.5×10⁶个/mL。

(2)将上述调整好的浓度的细胞，分别取100uL加入4℃预冷已含有stoppers且用Collagen I包被的Oris-compatible 96孔板，最终每孔细胞浓度为0.5×10⁵个/孔，加入后轻微水平晃动96孔板使细胞悬液分布均匀，放入5％CO₂，37℃细胞培养箱培养。

(3)实验分组设含25ng/mL EGF药物组(0.5μmol/L，0.1μmol/L)；25ng/mL EGF组，空白组(无EGF)，EGF阳性药组(BB-94，购自美国Selleck公司)，每组设3个复孔。

(4)待细胞过夜单层贴壁后，垂直取下stopper，小心吸尽培养基，用pbs清洗两遍。取稀释成一定浓度的Oris^TM Pro Collagen I Overlay，每孔加入40μL，将96孔板放入37℃细胞培养箱1h，待Collagen I胶凝固后，取出，加入不同浓度的含药培养基，培养72h。

(5)72h后取出培养板，每孔加入100μL甲醇固定10min，0.5％结晶紫染色30min，利用Olympus IX73荧光倒置显微镜(奥林巴斯有限公司)拍照。

细胞侵袭实验结果见附图8B。

小结：

在细胞的迁移和侵袭实验结果中，我们可以看出，经EGF处理72h后的BGC-823，A2780细胞组向中心空白圆形处迁移/侵袭的细胞数明显大于空白组。0.1μmol/L和0.5μmol/L的竹红菌素E均能抑制EGF处理后的细胞迁移和侵袭能力，而0.5μmol/L的竹红菌素E具有更显著的抑制作用。表明竹红菌素E对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有抑制作用。