一种具有抗菌活性的异黄酮类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物化学
技术领域：
，具体涉及一种从传统药食同源植物葛根中提取分离得到的具有抗菌活性的异黄酮类化合物，同时，本发明还涉及该化合物的制备方法及应用。
背景技术：
：葛根为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛。秋、冬二季采挖，趁鲜切成厚片或小块；干燥。甘、辛，凉。有解肌退热，透疹，生津止渴，升阳止泻之功。常用于表证发热，项背强痛，麻疹不透，热病口渴，阴虚消渴，热泻热痢，脾虚泄泻。同时葛根也是一种重要的保健食品，其药用价值极高，素有“亚洲人参”之美誉，葛粉称之为“长寿粉”，在日本被誉为“皇室特供食品”。葛根中的主要化学成分为黄酮和异黄酮类化合物(大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等)，也含有萜类、内酯、甾醇等其它结构类型的化合物。异黄酮是黄酮类化合物中的一种，它是植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酰辅酶a侧链延长后环化形成以苯色酮环为基础的酚类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酮类化合物。异黄酮类化合物突出的生理活性引起了科技工作者的广泛关注。研究表明葛根异黄酮具有突出的抗氧化、抗菌、抗病毒、补充女性雌激素、收缩平滑肌、增加冠血流量、抑制血小板凝集、降血糖等作用。天然抗菌剂是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为食品抗菌剂。此类抗菌剂为天然物质，有的本身就是食品的组分，故对人体无毒害，并能增进食品的风味品质，因而是一类有发展前景的食品抗菌剂。随着食品安全性与保健功能日益成为人们关注的焦点，食品原料乃至食品添加剂的选择趋向天然、健康、具有生物活性的材料，天然植物成为了食品抗菌成分的重要来源，可用于抗菌剂开发的天然物质资源非常广泛，结构类型主要有：黄酮、单宁、蒽醌、生物碱、木酯素、萜类化合物、甾醇等。本发明从葛根中分离得到了一种异黄酮化合物，活性研究表明该化合物具有较好的抗菌活性；而且该化合物安全、无毒，可用于抑制烟草料液微生物生长和制备卷烟抗菌接装纸。目前还未见相关文献报道。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种具有抗菌活性的异黄酮类化合物；第二目的在于提供所述具有抗菌活性的异黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述异黄酮类化合物作为抗菌剂的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。本发明从葛根中分离出一种新的具有抗菌活性的异黄酮类化合物，其分子式为c17h14o4，结构式如式(i)所示：该化合物的命名为：4′-羟基-6-甲氧基–7-甲基-异黄酮，英文名为：4′-hodroxy-6-methoxy-7-methyl-isoflavone，为浅黄色胶状物。上述具有抗菌活性的异黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)，浸膏提取：将葛根粉碎到20～50目，用重量百分浓度为80％～100％的甲醇水溶液、重量百分浓度为80％～100％的乙醇水溶液或重量百分浓度60％～90％的丙酮为提取溶剂，浸泡提取3～5次，每次浸泡24h～72h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为2～4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～300目，所用硅胶重量为浸膏重量2～4倍量；以体积比为1:0～1:2的氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱；步骤(3)，高效液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为6:4的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(i)所述的异黄酮类化合物。进一步，优选的是，步骤(2)中，浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。进一步，优选的是，步骤(2)中，梯度洗脱时，梯度依次是氯仿和丙酮体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2；每个梯度洗脱到tlc点板无点后，更换下一梯度洗脱。进一步，优选的是，步骤(3)中高效液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为体积浓度为42％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。本领域技术人员应该知晓本技术方案只是一个优选技术方案，高效液相色谱分离纯化采用的流动相不限于此，进一步，优选的是，高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶sephadexg-10柱层析分离，可得本发明化合物的纯品。以上述方法制备得到的异黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定：本发明化合物为浅黄色胶状物；其高分辨质谱hresims(正离子采集)显示准分子离子峰为m/z305.0798[m+na]+，(计算值305.0790)。结合1h和13cnmr谱确定化合物分子式为c17h14o4，不饱和度为11。红外光谱中显示了羟基(3310cm-1)、羰基(1642cm-1)和芳环(1610、1558和1440cm-1)的共振吸收峰。紫外光谱在210、262、328nm有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。化合物的1h、13cnmr和dept数据(如图1、图2和表1)显示化合物中存在17个碳和14个氢，包括1个异黄酮骨架(c-2～c-10和c-1′～c-6′，h-5、h-8、h-2′,6′和h-2′,6′)，一个甲氧基(δc55.9q，δh3.86s)、一个甲基(δc16.6q，δh2.37s)，以及一个酚羟基(δh11.20s)。化合物的异黄酮骨架可进一步由h-5和c-4、c-6、c-7、c-9、c-10，h-8和c-6、c-7、c-9、c-10，h-2和c-1′、c-3、c-4、c-9，以及h-2′,6′和c-3的hmbc相关得到确认。进一步分析其hmbc相关谱(如图3)，根据甲氧基氢(δh3.86)与c-6(δc157.5)的hmbc相关可推测该甲氧基取代在异黄酮母核的c-6位。甲基取代在c-7位可由h3-1″(δh2.37)与c-6(δc154.1)、c-7(δc132.0)和c-8(δc117.8)，以及h-8(δh6.69)和c-1″(δc16.6)的hmbc相关得到确定。酚羟基取代在c-4′位可由可由酚羟基氢(δh11.20)与c-3′,5′(116.0)和c-4′(157.5)的hmbc相关得到确认。苯环上典型的质子信号h-5(δh7.13s)、h-8(δh6.69s)、h-2,6[δh7.73(d,j＝8.8)]和h-3,5[(δh6.78(d,j＝8.8)]也支持异黄酮母核上的上述取代基模式。至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：4′-羟基-6-甲氧基–7-甲基-异黄酮。表1化合物(1)的核磁共振数据(溶剂为cdcl3)no.δcδh(m,j,hz)no.δcδh(m,j,hz)2152.6d7.85s10121.4s3123.6s1′124.9s4176.2s2′,6′130.5d7.73(d)8.85114.9d7.13s3′,5′116.0d6.78(d)8.86154.1s4′157.5s7132.0s1″16.6q2.37s8117.8d6.69some-655.9q3.86s9149.0sar-oh-4′11.20s化合物的红外、紫外和质谱数据：uv(甲醇)，λmax(logε)328(3.46)、262(3.85)、210(4.32)nm；ir(溴化钾压片)：νmax3310、3068、2935、1642、1610、1558、1506、1440、1365、1257、1148、1059、962、847cm-1；1h和13cnmr数据(500和125mhz,(cdcl3)，见表1；正离子模式esimsm/z305[m+na]+；正离子模式hresimsm/z305.0798[m+na]+(计算值c17h14nao4，305.0790)。本发明还提供上述具有抗菌活性的异黄酮类化合物作为抗菌剂的应用。进一步，优选的是，所述的抗菌剂为烟草料液用抗菌剂。同时，本发明还提供上述具有抗菌活性的异黄酮类化合物在制备卷烟用抗菌接装纸中的应用。对本发明化合物进行了抗菌活性筛选，体外抗菌实验用琼脂扩散法进行，首先将受试菌均匀地涂在mh琼脂培养基(牛肉粉6.0g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l,琼脂17.0g/l，ph7.3±0.1)，受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物(本发明化合物用10mldmso溶解，加水稀释成50μg/ml的溶液)浸泡好的药片(直径5mm)放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72h后，观察抑菌圈大小。结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率超过均90.6％。把本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察料液中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：52.3％、64.6％、75.9％。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期大大得到延长，延长时间分别为2倍、3.5倍、5倍。将本发明化合物应用到卷烟接装纸的制备中(把化合物配成50μg/ml，均匀的浸涂在卷烟接装纸上，每支卷烟的接装纸浸涂量为50μg)，和对照相比较(未添本发明加化合物)，添加过本化合物的接装纸检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数均显著减少；对大肠杆菌(atcc25922)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)的抑菌率全部达到61.8％以上，能够降低或消除卷烟接装纸及在贮存过程中细菌滋生和繁殖的可能性，另外，在卷烟吸食、传递过程中，该抗菌作用也能够对卷烟烟支上的接装纸被污染的微生物起到抑制作用。本发明与现有技术相比，其有益效果为：(1)制备本发明的化合物所用的原料易得，提取方法简单；本发明所保护的具有抗菌活性的异黄酮类化合物分子结构也简单，容易实现人工合成。(2)采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高(>98％)，后续的工业化生产容易实现。(3)本发明化合物从传统药食同源植物葛根中分离得到，对动物无毒，使用安全，化合物展现出良好的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到90.6％以上；本发明化合物应用于抑制烟草料液中微生物的生长，能显著延长烟草料液的保质期，保质期延长时间分别为2倍、3.5倍、5倍。(4)将本发明化合物应用于卷烟接装纸的制备中，能够对卷烟接装纸被污染的微生物起到抑制作用；由于卷烟接装纸直接和口腔接触，该化合物在卷烟接装纸中的使用可避免在卷烟在吸食、传递过程中被微生物污染，有效提高了卷烟的卫生和安全性。附图说明图1为本发明具有抗菌活性的异黄酮类化合物的核磁共振碳谱；图2为本发明具有抗菌活性的异黄酮类化合物的核磁共振氢谱；图3为本发明具有抗菌活性的异黄酮类化合物的主要hmbc相关。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明所采用的葛根全部是普通市购干制品。本发明所用葛根原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面基于不同产地的葛根原料，对本发明做进一步说明：实施例1制备异黄酮类化合物c17h14o4，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：1.浸膏提取：取葛根样品粉碎到30目，用高浓度甲醇(w％：95％)或高浓度乙醇(w％：95％)或高浓度丙酮(w％：70％)为提取溶剂，提取溶剂：葛根(重量比)＝3:1，每次浸泡54h，提取4次，合并提取液、过滤浓缩成浸膏。2.硅胶柱层析：浸膏用重量比2.5倍量的纯甲醇或纯丙酮溶解后用重量比1.2倍的80～100目硅胶拌样，用重量比3倍量的250目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为(1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩。3.高压液相色谱分离：柱层析洗脱液的6:4部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的异黄酮类化合物，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为体积浓度为42％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。高压液相色谱法分离纯化后的物质，一个优选的后处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。实施例2葛根样品来源于广西南平，品种为野葛。将粉碎到30目的葛根取样2.0kg粉碎以重量百分浓度为95％的甲醇浸泡提取5次，每次提取24h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为2:1，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.3kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分，每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱，得到8个部分；其中体积配比为6:4的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以体积浓度42％的甲醇水溶液为流动相，zorbaxsb-c18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，即得本发明异黄酮类化合物。实施例3葛根样品来源于重庆万州，品种为柴葛，将将粉碎到30目的葛根样品取样3.5kg切碎，以重量百分浓度为95％的乙醇水溶液浸泡提取4次，每次提取48h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为3:1，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，1kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分，每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱，得到8个部分；其中体积配比为6:4的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以体积浓度42％的甲醇水溶液为流动相，zorbaxsb-c18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，即得本发明异黄酮类化合物。实施例4葛根样品来源于云南临沧，品种为柴葛，将葛根取样5kg粉碎，以重量百分浓度为75％的丙酮水溶液用浸泡提取3次，每次提取72h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为4:1，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，1.5kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱，得到8个部分；其中体积配比为6:4的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以42％的甲醇为流动相，zorbaxsb-c18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，即得本发明异黄酮类化合物。实施例5一种具有抗菌活性的异黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)，浸膏提取：将葛根粉碎到20目，用重量百分浓度60％的丙酮为提取溶剂，浸泡提取3次，每次浸泡24h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为2:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.5倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8倍的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160～300目，所用硅胶重量为浸膏重量2倍量；以体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱；步骤(3)，高效液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为6:4的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(i)所述的异黄酮类化合物。高效液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为体积浓度为42％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶sephadexg-10柱层析分离，可得本发明化合物的纯品。实施例6一种具有抗菌活性的异黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)，浸膏提取：将葛根粉碎到50目，用乙醇为提取溶剂，浸泡提取5次，每次浸泡72h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏1.2倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为300目，所用硅胶重量为浸膏重量4倍量；以体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱；步骤(3)，高效液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为6:4的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(i)所述的异黄酮类化合物。高效液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为体积浓度为42％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶sephadexg-10柱层析分离，可得本发明化合物的纯品。实施例7一种具有抗菌活性的异黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)，浸膏提取：将葛根粉碎到30目，用甲醇为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡48h，每次所用提取溶剂与葛根的重量比为3:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏1倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经tlc监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到tlc点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱；步骤(3)，高效液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为6:4的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(i)所述的异黄酮类化合物。高效液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为体积浓度为42％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为328nm，每次进样200μl，收集33.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶sephadexg-10柱层析分离，可得本发明化合物的纯品。实施例8------化合物结构的鉴定以实施例1方法制备得到的异黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定：本发明化合物为浅黄色胶状物；其高分辨质谱hresims(正离子采集)显示准分子离子峰为m/z305.0798[m+na]+，(计算值305.0790)。结合1h和13cnmr谱确定化合物分子式为c17h14o4，不饱和度为11。红外光谱中显示了羟基(3310cm-1)、羰基(1642cm-1)和芳环(1610、1558和1440cm-1)的共振吸收峰。紫外光谱在210、262、328nm有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。化合物的1h、13cnmr和dept数据(如图1、图2和表1)显示化合物中存在17个碳和14个氢，包括1个异黄酮骨架(c-2～c-10和c-1′～c-6′，h-5、h-8、h-2′,6′和h-2′,6′)，一个甲氧基(δc55.9q，δh3.86s)、一个甲基(δc16.6q，δh2.37s)，以及一个酚羟基(δh11.20s)。化合物的异黄酮骨架可进一步由h-5和c-4、c-6、c-7、c-9、c-10，h-8和c-6、c-7、c-9、c-10，h-2和c-1′、c-3、c-4、c-9，以及h-2′,6′和c-3的hmbc相关得到确认。进一步分析其hmbc相关谱(如图3)，根据甲氧基氢(δh3.86)与c-6(δc157.5)的hmbc相关可推测该甲氧基取代在异黄酮母核的c-6位。甲基取代在c-7位可由h3-1″(δh2.37)与c-6(δc154.1)、c-7(δc132.0)和c-8(δc117.8)，以及h-8(δh6.69)和c-1″(δc16.6)的hmbc相关得到确定。酚羟基取代在c-4′位可由可由酚羟基氢(δh11.20)与c-3′,5′(116.0)和c-4′(157.5)的hmbc相关得到确认。苯环上典型的质子信号h-5(δh7.13s)、h-8(δh6.69s)、h-2,6[δh7.73(d,j＝8.8)]和h-3,5[(δh6.78(d,j＝8.8)]也支持异黄酮母核上的上述取代基模式。至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：4′-羟基-6-甲氧基–7-甲基-异黄酮。实施例9取实施例2-7制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例8相同，确认实施例2-7制备的化合物为所述的异黄酮类化合物——4′-羟基-6-甲氧基–7-甲基-异黄酮。实施例10取实施例1-7制备的任一异黄酮类化合物进行抗菌活性试验，试验情况如下：对本发明化合物进行了抗菌活性筛选，体外抗菌实验用琼脂扩散法进行，首先将受试菌均匀地涂在mh琼脂培养基(牛肉粉6.0g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l,琼脂17.0g/l，ph7.3±0.1)，受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物(本发明化合物用10mldmso溶解，加水稀释成50μg/ml的溶液)浸泡好的药片(直径5mm)放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72h后，观察抑菌圈大小。结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率均超过90.6％。同时，对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、ames实验和tk基因突变实验,证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。实施例11把本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察料液中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：52.3％、64.6％、75.9％。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期大大得到延长，三种添加浓度的烟草料液的保质期延长时间分别为2倍、3.5倍、5倍。实施例12将本发明化合物应用到卷烟接装纸的制备中(把化合物配成50μg/ml，均匀的浸涂在卷烟接装纸上，每支卷烟的接装纸浸涂量为50μg)，和对照相比较(未添本发明加化合物)，添加过本化合物的接装纸检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数均显著减少；对大肠杆菌(atcc25922)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)的抑菌率全部达到61.8％以上，能够降低或消除卷烟接装纸及在贮存过程中细菌滋生和繁殖的可能性，另外，在卷烟吸食、传递过程中，该抗菌作用也能够对卷烟烟支上的接装纸被污染的微生物起到抑制作用。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12