一种吲哚乙烯类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针领域，尤其涉及一种吲哚乙烯类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

小分子探针是指针对某种特定目标生物分子或生物离子开发的探测器，小分子探针能与特定的靶分子进行特异性相互作用，并能被特殊的检测技术所探知。与普通的检测技术相比，探针技术具有灵敏度高、专一性强、快速准确等优点，适用于分子影像和实时监测。

rna(核糖核酸)在生物体的生长、发育及凋亡的整个过程中都有重要的调控作用；在许多疾病的发生过程中，rna起着关键作用，如恶性肿瘤的发生与rna的表达异常关系密切。但与dna分析与检测技术相比，rna的分析与检测技术的开发与应用发展缓慢。

rna荧光探针具有在复杂的溶液体系中或者活细胞环境中高选择性、特异性地识别rna的优点，在rna分析与检测领域具有很好的应用前景。目前，已经商业化的rna荧光探针只有invitrogen公司出品的rnaselect。该荧光探针在实际成像应用中存在一些缺陷，例如与rna响应速度较慢、光致毒性大和光稳定性差等缺点，这些缺陷影响其应用价值。因此，开发性能优越的rna小分子荧光探针具有很强的市场价值。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种吲哚乙烯类化合物及其制备方法和应用，本发明提供的吲哚乙烯类化合物作为rna荧光探针时，毒性低，响应速度快且光稳定性强。

本发明提供了一种吲哚乙烯类化合物，具有式(i)所示结构，

其中，r1、r3独立的选自h、卤素、羟基、c1～c6的烷氧基、c2～c15的亚胺基、c1～c6的烷基；

r4选自c1～c6的烷基；

r2选自哌啶基、吗啉基、吡咯基或nr5r6；

r5、r6独立的选自h、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、式(r-1)、式(r-2)、式(r-3)、式(r-4)或式(r-5)，

且r5、r6不同时为h。

优选的，所述r1选自h、f、cl、br、-oh、-och3、-n(ch3)2或c1-c6的烷基。

优选的，所述r3选自h、f、cl、br、-oh、-och3、-n(ch3)2或c1-c6的烷基。

优选的，所述r4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

优选的，所述吲哚乙烯类化合物为式(i-a)、式(i-b)、式(i-c)、式(i-d)或式(i-e)，

本发明还提供了一种吲哚乙烯类化合物的制备方法，包括：

将式(ii)化合物、式(iii)化合物、r2-h反应，得到式(i)结构的吲哚乙烯类化合物；

其中，r1、r3独立的选自h、卤素、羟基、c1～c6的烷氧基、c2～c15的亚胺基、c1～c6的烷基；

r4选自c1～c6的烷基；

r2选自哌啶基、吗啉基、吡咯基或nr5r6；

r5、r6独立的选自h、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、式(r-1)、式(r-2)、式(r-3)、式(r-4)或式(r-5)，

且r5、r6不同时为h。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测水溶液中的rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中的rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测细胞中的rna的荧光探针中的应用。

与现有技术相比，本发明提供了一种吲哚乙烯类化合物，具有式(i)所示结构，本发明提供的化合物通过在喹啉位引入吲哚-3-甲醛并以此为母体选择特定的取代基得到一系列式(i)所示结构的吲哚乙烯类化合物，实验结果表明，利用本发明所述荧光探针标记后的荧光图像显示，在细胞质和核仁区有明显的绿光分布，明确提示所述探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的rna，并且在与传统核仁荧光探针或与经rna酶消化实验后的细胞进行对比试验后也得到进一步的证实。可见，本发明提供的荧光探针是一类新型的rna选择性识别荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有低生物毒性、膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其作为rna和核仁荧光探针具有广泛的应用，有望开发为rna和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂。

附图说明

图1为式(i-a)化合物探针与da21、ds12、ds26、rna五种核酸在1∶1浓度下的荧光谱；

图2为式(i-a)化合物探针滴定st-dna、ds26、rna的荧光数据的拟合曲线；

图3为式(i-a)化合物探针滴定rna的荧光光谱；

图4为式(i-a)化合物探针滴定rna的荧光光谱中c与(f-f0)/f0拟合的曲线；

图5为式(i-a)化合物探针与染料dapi复染pc3细胞的细胞成像图；

图6为式(i-a)化合物探针与rnase和dnase的细胞染色实验；

图7为式(i-a)化合物探针与dna和rna凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种吲哚乙烯类化合物，具有式(i)所示结构，

其中，r1、r3独立的选自h、卤素、羟基、c1～c6的烷氧基、c2～c15的亚胺基、c1～c6的烷基；

r4选自c1～c6的烷基；

r2选自哌啶基、吗啉基、吡咯基或nr5r6；

r5、r6独立的选自h、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、式(r-1)、式(r-2)、式(r-3)、式(r-4)或式(r-5)，

且r5、r6不同时为h。

按照本发明，所述r1优选为h、f、cl、br、-oh、-och3、-n(ch3)2或c1-c6的烷基，更优选为h、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

按照本发明，所述r3优选为h、f、cl、br、-oh、-och3、-n(ch3)2或c1-c6的烷基，更优选为h、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

按照本发明，所述r4优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

按照本发明，所述r5、r6优选独立的选自-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、式(r-1)、式(r-2)、式(r-3)、式(r-4)或式(r-5)，

其中，结构式中：中的虚线部分为其与氮的连接部位。

更具体的，所述吲哚乙烯类化合物为式(i-1)、式(i-2)、式(i-3)、式(i-4)或式(i-5)，

本发明还提供了一种吲哚乙烯类化合物的制备方法，包括：

将式(ii)化合物、式(iii)化合物、r2-h反应，得到式(i)结构的吲哚乙烯类化合物；

其中，r1、r3独立的选自h、卤素、羟基、c1～c6的烷氧基、c2～c15的亚胺基、c1～c6的烷基；

r4选自c1～c6的烷基；

r2选自哌啶基、吗啉基、吡咯基或nr5r6；

r5、r6独立的选自h、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、式(r-1)、式(r-2)、式(r-3)、式(r-4)或式(r-5)，

且r5、r6不同时为h。

按照本发明，本发明将将式(ii)化合物、式(iii)化合物、r2-h反应，得到吲哚乙烯类化合物；其中，各个基团的限定与前述化合物中基团的限定相同，本发明对反应的方法没有特殊要求，本领域公知的用于该类反应的方法均可。

其中，本发明中，所述式(ii)化合物优选按照以下方法制备得到，

将式(iv)化合物与r4i反应，得到式(ii)结构的化合物；

其中，r3选自h、卤素、羟基、c1～c6的烷氧基、c2～c15的亚胺基、c1～c6的烷基。

其中，本发明对反应的条件没有特殊要求，本领域公知的可用于该类反应的反应条件均可。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测水溶液中的rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中的rna的荧光探针中的应用。

本发明还提供了一种本发明所述的吲哚乙烯类化合物在制备检测细胞中的rna的荧光探针中的应用。

本发明提供了一种具有式(i)所示结构的吲哚乙烯类化合物，本发明提供的化合物通过在喹啉位引入吲哚-3-甲醛并以此为母体选择特定的取代基得到一系列式(i)所示结构的吲哚乙烯类化合物，实验结果表明，利用本发明所述荧光探针标记后的荧光图像显示，在细胞质和核仁区有明显的绿光分布，明确提示所述探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的rna，并且在与传统核仁荧光探针或与经rna酶消化实验后的细胞进行对比试验后也得到进一步的证实。可见，本发明提供的荧光探针是一类新型的rna选择性识别荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有低生物毒性、膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其作为rna和核仁荧光探针具有广泛的应用，有望开发为rna和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：化合物2(4-氯-1，2-二甲基喹啉)的合成

往25ml圆底烧瓶里称取4-氯-2-甲基喹啉0.2g(1.1236mmol)，加入碘甲烷，溶剂环丁砜，将混合物加热到40～60℃，反应15个小时后，冷却，加入无水乙醚后震荡，抽滤，固体洗涤数遍，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到0.345g纯品2，产率为95.8％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ8.56(d，j＝8.4hz，1h)，8.46(d，j＝8.3hz，1h)，8.22(t，j＝8.1hz，1h)，8.01(t，j＝7.9hz，1h)，7.55(s，j＝7.4hz，1h)，4.20(s，3h)，3.74(s，1h)，2.68(s，3h)。

实施例2：化合物(i-a)的合成

称取0.319g(0.001mol)的化合物2，加入到装有10ml乙醇的圆底烧瓶中，再加入0.217g，即1.5倍摩尔量的吲哚-3-甲醛，室温条件下搅拌5分钟后加入1ml哌啶，在80℃下反应5h，冷却至室温，向反应后溶液中加入10ml乙酸乙酯，振荡后抽滤，并用少量乙醇洗涤沉淀，真空干燥后得到化合物(i-a)为黄褐色固体0.409g，其结构如下，产率为85.1％：1hnmr(400mhz，dmso)δ11.82(s，1h)，8.27(d，j＝8.8hz，1h)，8.11(d，j＝8.3hz，1h)，8.05-7.98(m，2h)，7.74(t，j＝7.6hz，1h)，7.63(dd，j＝11.8，9.1hz，2h)，7.51-7.43(m，2h)，7.25(t，j＝7.6hz，1h)，7.06(t，j＝7.5hz，1h)，6.98(s，1h)，4.23(s，3h)，3.76(s，4h)，1.84(s，4h)，1.78(s，2h)。

实施例3：化合物(i-b)的合成

本实施例的制备方法除了用吗啉代替哌啶外，其余同实施例二，产物为红褐色固体即为化合物(i-b)，其结构式如下，产率为78.2％：¹hnmr(400mhz，dmso)δ12.03(s，1h)，8.30(dd，j＝12.3，3.2hz，2h)，8.18(t，j＝5.2hz，3h)，8.02(t，j＝7.5hz，1h)，7.73(t，j＝7.6hz，1h)，7.58-7.51(m，2h)，7.43(d，j＝15.7hz，1h)，7.32-7.24(m，2h)，4.27(s，3h)，3.97-3.88(m，4h)，3.72(d，j＝4.2hz，4h)。

实施例4：化合物(i-c)的合成

本实施例的制备方法除了用呲咯代替哌啶外，其余同实施例二，产物为黄棕色固体即为化合物(i-c)，其结构式如下，产率为76.8％：¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.85(s，1h)，8.49(d，j＝8.5hz，1h)，8.17-8.09(m，2h)，8.01(dt，j＝15.8，5.3hz，3h)，7.65(t，j＝7.7hz，1h)，7.51(d，j＝7.7hz，1h)，7.33(d，j＝15.7hz，1h)，7.28-7.20(m，2h)，7.00(s，1h)，4.11(s，3h)，4.01(s，4h)，2.06(s，4h)。

实施例5：化合物(i-d)的合成

本实施例的制备方法除了用1-(2-氨乙基)哌啶烷代替哌啶外，其余同实施例二，产物为黄褐色固体即为化合物(i-d)，其结构式如下，产率为78.2％：¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.91(s，1h)，8.74(s，1h)，8.49(d，j＝8.1hz，1h)，8.18(d，j＝8.8hz，1h)，8.10(dd，j＝14.9，11.3hz，3h)，8.03-7.97(m，1h)，7.73(t，j＝7.7hz，1h)，7.53(d，j＝7.1hz，1h)，7.38(d，j＝15.8hz，1h)，7.30-7.21(m，2h)，7.15(s，1h)，4.13(d，j＝11.7hz，3h)，3.78(s，2h)，2.66(d，j＝21.8hz，2h)，1.50(s，4h)，1.38(d，j＝4.2hz，2h)。

实施例6：化合物(i-e)的合成

本实施例的制备方法除了用3-氨基-1-丙醇代替哌啶外，其余同实施例二，产物为深黄色固体即为化合物(i-e)，其结构式如下，产率为81.2％：¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.90(s，1h)，8.87(s，1h)，8.50(d，j＝8.2hz，1h)，8.18(d，j＝8.8hz，1h)，8.14-8.11(m，1h)，8.11-8.02(m，2h)，7.99(t，j＝7.7hz，1h)，7.72(t，j＝7.6hz，1h)，7.55-7.49(m，1h)，7.37(d，j＝15.8hz，1h)，7.29-7.22(m，2h)，7.15(s，1h)，4.78(s，1h)，4.14(s，3h)，3.71(s，2h)，3.61(d，j＝4.4hz，2h)，2.00-1.86(m，2h)。

实施例7：式(i-a)化合物荧光探针对不同核酸选择性的荧光光谱实验

将5mm的式(i-a)化合物储备液稀释成5um的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度400nm/min，激发波长455nm)测出其各自的荧光强度，结果见图1，图1为式(i-a)化合物探针与da21、ds12、ds26、rna五种核酸在1∶1浓度下的荧光谱；从图中可以看出，式(i-a)化合物荧光探针与rna的结合之后荧光强度最强，而对其他的双链、单链和g-四链体dna荧光强度较弱。

选择性实验中所使用的核酸

实施例8：式(i-a)化合物荧光探针对不同核酸的荧光滴定实验

将5mm的化合物储备液稀释成5μm的浓度，放置于荧光分光光度计中，逐渐增加溶液中不同核酸的浓度，并进行荧光强度测定。测定条件为：狭缝宽度10nm，扫描速度400nm/min，激发波长455nm；结果见图2，图2为式(i-a)化合物探针滴定st-dna、ds26、rna的荧光数据的拟合曲线；从图中可以看出，随着核酸浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且该荧光探针与rna相结合荧光强度较强，说明其对rna有明显的选择性。

荧光滴定实验中所使用的核酸

实施例9：式(i-a)化合物荧光探针对rna检测限的测定

将5mm的化合物储备液稀释成5μm的浓度，再在荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长455nm)扫描，再往其中慢慢加入rna做到使其饱和，检测结果见图3，图3为式(i-a)化合物探针滴定rna的荧光光谱，其中，图中，从下到上依次为加入rna量增加的曲线，从图3可以看出，随着rna的增多，荧光强度不断增加，说明化合物能与rna相结合，且产生较强荧光。

检测限的计算公式

lod＝k×sb/m

lod(化合物的结合常数)，m是浓度c与(f-f0)/f0的所做直线的斜率，sb为用仪器空白多次测量的标准偏差，k值按照国际纯粹和应用化学联合会建议通常取为3，其中，c与(f-f0)/f0拟合的曲线见图4，图4为式(i-a)化合物探针滴定rna的荧光光谱中c与(f-f0)/f0拟合的曲线；通过计算可知，式(i-a)化合物荧光探针对rna检测限lod为8μg/l。

实施例10：式(i-a)化合物荧光探针的细胞成像实验

先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为5000个/ml，然后在37℃、5％co2环境中培养70h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×pbs洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5ml常温避光放置2min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×pbs洗3次，加入1ml的5μm的化合物然后放置20min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×pbs洗3次，在上述6孔板中加入1μm的dapi溶液1ml并37℃放置2min，然后再用预冷的1×pbs洗6次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。

结果见图5，图5为式(i-a)化合物探针与染料dapi复染pc3细胞的细胞成像图；从图中可知，本发明的荧光探针作用于细胞核及细胞质内的rna，同时也证明了该系列荧光配体能够在细胞体系对rna进行成像和检测。

实施例11：式(i-a)化合物荧光探针的rnase与dnase细胞成像实验

先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为5000个/ml，然后在37℃、5％co2环境中培养72h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×pbs洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5ml常温避光放置2min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×pbs洗3次，加入1ml的5um的化合物然后放置20min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×pbs洗3次，在六孔板中分别加入1mldnase，dnase-freernase的溶液并37℃，5％co2培养3h.弃去6孔板中的酶溶液，再用预冷的1×pbs洗3次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况，结果见图6，图6为式(i-a)化合物探针与rnase和dnase的细胞染色实验，其中，图中，a为未加酶的荧光图，b为加dna酶后的荧光成像，c为加rna酶后的荧光成像，加入dna酶后，荧光强度无明显变化，加入rna酶后，rna水解，荧光几乎全部消失，说明该荧光探针选择性的结合细胞内的rna，并产生荧光。

实施例12：核酸凝胶电泳实验

先配制1000ml的1×tae电泳缓冲液，分别称取0.2g的biowestagarose(西班牙琼脂糖)和20ml电泳缓冲液于锥形瓶中，微波炉加热煮沸，将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入5mm的化合物2ul摇匀，灌制凝胶，待凝胶冷却之后取出梳子和隔板，放入电泳槽中，缓冲液淹没过胶1-2mm为止，dna样品配成5m(混合液中上样缓冲液为1×)，rna配成5mg/l，分别取10ul加入凝胶点样孔中，将整个电泳仪接通，100v电压跑15min，取出凝胶块，将其置于凝胶电泳仪上观察。

结果见图7，图7为式(i-a)化合物探针与dna和rna凝胶电泳图；从图中可以看出，式(i-a)化合物与rna结合可产生较强的荧光现象，而对双链ds26，荧光较弱，说明其具有较好的选择性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。